PCSK9介導(dǎo)ApoER2降解在血管平滑肌細(xì)胞多倍體化及衰老中的作用

魏小云 劉恒亮 姬勁銳 郭亞男

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是目前最重要的死因和疾病負(fù)擔(dān)之一,并且其患病率仍處于持續(xù)上升階段[1]。血管平滑肌細(xì)胞是血管壁的主要組分,在各種血管性疾病進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。既往研究發(fā)現(xiàn),斑塊內(nèi)血管平滑肌會出現(xiàn)DNA損傷、增殖不良及端?？s短等早期衰老現(xiàn)象,但引起血管平滑肌細(xì)胞衰老的具體機(jī)制尚未完全闡明[3,4]。PCSK9(proprotein convertase subtilisin/kexin type-9)是前蛋白轉(zhuǎn)化酶的第9個(gè)成員,其可通過PCSK9-低密度脂蛋白受體(low-density lipoprotein receptor, LDLR)軸在膽固醇代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用,現(xiàn)已成為降脂治療的重要靶點(diǎn)[5]。研究表明,循環(huán)PCSK9水平與年齡和動脈粥樣硬化程度呈正相關(guān),提示其與人體衰老可能關(guān)聯(lián),但其與血管平滑肌細(xì)胞衰老的相關(guān)性尚不完全清楚[2,6,7]。

近年來,Komaravolu等[8]研究發(fā)現(xiàn)PCSK9的靶蛋白ApoER2參與小鼠主動脈血管平滑肌細(xì)胞的有絲分裂過程,ApoER2敲除可以顯著抑制血管平滑肌細(xì)胞的胞質(zhì)分裂,并引起小鼠血管平滑肌細(xì)胞多倍體的形成及衰老。然而,目前尚未有研究證明PCSK9可以通過介導(dǎo)ApoER2的降解,促進(jìn)人血管平滑肌細(xì)胞多倍體的形成及衰老。因此,本研究采用腺病毒引起PCSK9在血管平滑肌細(xì)胞中的過表達(dá),對血管平滑肌細(xì)胞增殖及多倍體化的情況進(jìn)行掃描分析,觀察其對人血管平滑肌細(xì)胞多倍體形成的影響,并探討ApoER2在這一過程中發(fā)揮的作用。

材料與方法

1.細(xì)胞及主要儀器、試劑:(1)細(xì)胞:人血管平滑肌細(xì)胞購自美國ATCC(貨號:CRL-199),用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的Ham′s F12培養(yǎng)液在37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁約90%后用0.25%胰蛋白酶消化并傳代。(2)主要試劑、儀器:PCSK9腺病毒(Ad-PCSK9)購自美國SignaGen公司(貨號:SL103186)?？蛰d腺病毒(Ad-Null)購自美國Vector Biolabs公司(貨號:1240)。人重組ApoER2蛋白(recombinant human ApoER2, rhApoER2)購自美國R&D Systems公司(貨號:3520-AR)。細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色(senescence associated β-galactosidase, SAβG)試劑盒購自美國Cell Signaling Technology (貨號:9860)。PCSK9、ApoER2及BrdU抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。BrdU購自美國Thermo公司(貨號:B9285)。倒置熒光顯微鏡購自德國Leica公司,pH調(diào)節(jié)儀購自美國HANNA公司,激光掃描細(xì)胞儀(laser scanning cytometer, LSC)購自美國CompuCyte公司。

2.實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù):(1)Ad-Null轉(zhuǎn)染組(空載腺病毒組):細(xì)胞均勻傳代后,采用空載腺病毒(Ad-Null)轉(zhuǎn)染人血管平滑肌細(xì)胞4h,后換用含10%胎牛血清的Ham′s F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)0、6、12、24、36h。(2)Ad-PCSK9轉(zhuǎn)染組(PCSK9腺病毒組):細(xì)胞均勻傳代后,采用Ad-PCSK9腺病毒轉(zhuǎn)染人血管平滑肌細(xì)胞4h,后換用含有10%胎牛血清的Ham′s F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)0、6、12、24、36h。在24h時(shí)進(jìn)行光學(xué)細(xì)胞形態(tài)觀察,并檢測細(xì)胞增殖、衰老及相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。(3)rhApoER2干預(yù)(PCSK9腺病毒+ rhApoER2組):用無菌PBS將其稀釋成8mmol/L的母液。在Ad-PCSK9轉(zhuǎn)染血管平滑肌細(xì)胞前,在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入rhApoER2,使其終濃度達(dá)到80μmol/L,并繼續(xù)培養(yǎng)24h,并檢測細(xì)胞增殖和衰老水平。

3.細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶檢測:采用SAβG試劑盒進(jìn)行細(xì)胞衰老檢測。將1×104個(gè)細(xì)胞接種于35mm2培養(yǎng)皿。分組處理后,棄去培養(yǎng)基,PBS漂洗數(shù)次并加入細(xì)胞固定液。細(xì)胞固定15min后,在培養(yǎng)皿中加入含SAβG染液1.5ml,于37℃恒溫箱中孵育過夜。然后在光學(xué)顯微鏡下拍照觀察。SAβG染色陽性比率(%)=β-半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

4.蛋白水平的檢測:冰上裂解細(xì)胞30min,置于1.5ml離心管中,并在4℃ 12000r/min(離心半徑6cm)的離心機(jī)中離心15min。將上清液移至離心管中,DC法定量檢測蛋白濃度并將蛋白濃度調(diào)整一致后置于煮沸儀上將其變性。每組樣本混勻后取65μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,檢測內(nèi)參β-actin,根據(jù)β-actin的A值調(diào)整上樣量,使其與β-actin的A值保持一致。將蛋白以恒壓100V后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用含5%脫脂奶粉的TBST進(jìn)行封閉,然后加一抗(PCSK9和ApoER2,抗體稀釋度均為1∶1000)于4℃冰箱中孵育過夜,加入二抗室溫孵育2h,再用TBST洗3次,放入化學(xué)發(fā)光檢測儀中進(jìn)行檢測。應(yīng)用Gel-Pro Analyzer 4.0圖像分析軟件檢測目的蛋白的A值。

5.LSC掃描分析: 細(xì)胞培養(yǎng)基中加入終濃度為10μmol/L的BrdU,并在37℃培養(yǎng)箱中標(biāo)記1h。棄去培養(yǎng)基,加入1～2ml無水乙醇固定20min后,加入0.1%的Triton X-100常溫孵育20min。加入4mol/L HCl并在常溫下孵育20min后用枸櫞酸鈉中和鹽酸。加入封閉緩沖液孵育20min,并加入BrdU抗體(1∶50)。常溫孵育1h后,加入F488綠色熒光二抗。常溫孵育30～60min后,加入PI進(jìn)行細(xì)胞核的復(fù)染。常溫孵育20min,用75%的甘油進(jìn)行封片,并在熒光顯微鏡下進(jìn)行拍照觀察后采用LSC進(jìn)行血管平滑肌細(xì)胞增殖及多倍體化的掃描分析。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法: 應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,兩組間的比較采用t檢驗(yàn),3組間各指標(biāo)的比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD法(方差齊)或Dunnett′sT3(方差不齊)檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.PCSK9過表達(dá)對血管平滑肌細(xì)胞增殖水平的影響:為探究PCSK9對人血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響,采用PCSK9過表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染人血管平滑肌細(xì)胞。PCSK9在人血管平滑肌細(xì)胞中僅有少量表達(dá),而在Ad-PCSK9轉(zhuǎn)染12h后,人血管平滑肌細(xì)胞中PCSK9的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05,圖1A)。光學(xué)顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察所示,在轉(zhuǎn)染腺病毒24h后,Ad-PCSK9轉(zhuǎn)染組的血管平滑肌細(xì)胞密度顯著低于Ad-Null轉(zhuǎn)染組,且多核血管平滑肌細(xì)胞(≥4N)的數(shù)目顯著增加(P<0.01,圖1B)。此外,為進(jìn)一步明確PCSK9過表達(dá)對細(xì)胞增殖的影響,采用MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證明,Ad-PCSK9轉(zhuǎn)染組血管平滑肌細(xì)胞的增殖活性明顯低于Ad-Null轉(zhuǎn)染組(0.39±0.03 vs 0.72±0.06,P<0.01)。上述研究的結(jié)果提示,過表達(dá)PCSK9不僅可以抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖,還可誘導(dǎo)多倍體血管平滑肌細(xì)胞的形成。

圖1 PCSK9過表達(dá)對血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響A.PCSK9的表達(dá)水平,與0h比較,*P<0.05,**P<0.01;B.光鏡下的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變;C.MTT實(shí)驗(yàn)細(xì)胞增殖比較

2.PCSK9過表達(dá)對血管平滑肌細(xì)胞多倍體形成的影響:為明確PCSK9過表達(dá)對人血管平滑肌細(xì)胞多倍體化的影響,采用BrdU/PI染色法進(jìn)行染色,并用熒光顯微鏡和LSC掃描儀進(jìn)行形態(tài)觀察和掃描分析。人血管平滑肌細(xì)胞在轉(zhuǎn)染Ad-PCSK9 24h后,可以顯著下調(diào)陽性BrdU細(xì)胞的比例(P<0.01,圖2中A～D),提示PCSK9過表達(dá)可以顯著抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖。此外,較空載腺病毒組,Ad-PCSK9轉(zhuǎn)染組多倍體血管平滑肌細(xì)胞(≥4N)的比例顯著增加(P<0.01,圖2中A～C、E)。上述的研究結(jié)果進(jìn)一步證明PCSK9過表達(dá)不僅可以顯著抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖,還可以顯著促進(jìn)多倍體血管平滑肌細(xì)胞的形成。

3.PCSK9過表達(dá)對血管平滑肌細(xì)胞衰老的影響:采用SAβG染色法檢測血管平滑肌細(xì)胞衰老水平。Ad-PCSK9轉(zhuǎn)染組的SAβG陽性血管平滑肌細(xì)胞數(shù)目顯著高于Ad-Null轉(zhuǎn)染組(31.93±7.2 vs 5.46±2.84,P<0.01,圖3)。在Ad-PCSK9轉(zhuǎn)染組中,SAβG陽性血管平滑肌細(xì)胞多為多倍體血管平滑肌細(xì)胞。上述的結(jié)果表明,PCSK9過表達(dá)誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞多倍體化與血管平滑肌細(xì)胞的衰老密切相關(guān)。

圖3 PCSK9過表達(dá)對血管平滑肌細(xì)胞衰老的影響A.SAβG染色后光鏡觀察細(xì)胞衰老(×200),箭頭所指為多倍體細(xì)胞;B.細(xì)胞衰老水平比較

4.PCSK9過表達(dá)對血管平滑肌細(xì)胞ApoER2表達(dá)水平的影響:既往研究表明,PCSK9可以降解多種LDLR相關(guān)膜蛋白,包括LDLR、VLDLR、LRP1和ApoER2[9]。在Ad-PCSK9轉(zhuǎn)染24h后,人血管平滑肌細(xì)胞中PCSK9的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.01)并顯著下調(diào)ApoER2的表達(dá)水平(P<0.01,圖4中A～C)。上述的結(jié)果表明,PCSK9過表達(dá)可以顯著促進(jìn)ApoER2的降解。

圖4 PCSK9對血管平滑肌細(xì)胞ApoER2表達(dá)的影響A.蛋白表達(dá)情況;B.PCSK9的表達(dá)水平;C.ApoER2的表達(dá)水平

5.rhApoER2對PCSK9過表達(dá)誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞多倍體化的影響:研究表明,ApoER2敲除可以抑制原代小鼠血管平滑肌細(xì)胞的胞質(zhì)分離并促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞多倍體的形成[8]。為探討PCSK9介導(dǎo)的ApoER2降解對血管平滑肌細(xì)胞的多倍體化及衰老的作用,在Ad-PCSK9轉(zhuǎn)染血管平滑肌細(xì)胞前加入可溶性rhApoER2,阻滯PCSK9對血管平滑肌細(xì)胞ApoER2的降解,并檢測細(xì)胞多倍體及增殖情況。rhApoER2可以顯著抑制PCSK9過表達(dá)誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞多倍體化并促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖(P<0.05,圖5)。

圖5 rhApoER2對 PCSK9過表達(dá)誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞多倍體的影響A.LSC細(xì)胞掃描分析;B.多倍體細(xì)胞比例;C.增殖細(xì)胞比例

討 論

血管平滑肌細(xì)胞是動脈粥樣硬化斑塊纖維帽的主要組分,血管平滑肌細(xì)胞的衰老可以減少纖維帽中血管平滑肌細(xì)胞組分,進(jìn)而促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊病變的進(jìn)展[10,11]。近年來研究表明,PCSK9在人動脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)上調(diào),而敲低PCSK9的表達(dá)可通過抑制TLR4/NF-κB信號通路的激活,從而減緩Apoe-/-小鼠動脈粥樣硬化病變的進(jìn)展,而血漿膽固醇水平卻無顯著改變[12]。上述研究結(jié)果表明,PCSK9可以通過非LDLR途徑促進(jìn)動脈粥樣硬化病變的進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn),PCSK9在血管平滑肌細(xì)胞中僅少量表達(dá),而Ad-PCSK9轉(zhuǎn)染人血管平滑肌細(xì)胞,使PCSK9過表達(dá)可通過抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖,并誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞多倍體的形成和衰老。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),PCSK9在血管平滑肌細(xì)胞中的過表達(dá)還可以顯著抑制ApoER2的表達(dá)水平,而rhApoER2則可以抑制PCSK9誘導(dǎo)的多倍體血管平滑肌細(xì)胞形成。本研究結(jié)果提示,PCSK9可能通過誘導(dǎo)ApoER2的降解,促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞多倍體的形成并誘導(dǎo)其發(fā)生衰老。

既往研究表明,斑塊內(nèi)血管平滑肌細(xì)胞會出現(xiàn)廣泛的DNA損傷、端?？s短及端粒酶的活性降低, 引起增殖不良,但其潛在機(jī)制尚不明確[4]。PCSK9是Kexin樣前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶家族的第9個(gè)成員,其在血脂代謝的過程中發(fā)揮重要作用,越來越多的證據(jù)表明PCSK9廣泛參與多種心血管疾病的病理進(jìn)程,如冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、腹主動脈瘤、主動脈瓣鈣化等[13～15]。此外,近年來研究表明,兩種長壽相關(guān)蛋白SIRT1和SIRT6可以PCSK9依賴的方式調(diào)節(jié)血脂代謝[16,17]。然而,目前尚未有研究證實(shí)PCSK9與血管平滑肌細(xì)胞衰老之間的相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn),PCSK9可以通過誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞多倍體的形成,抑制其增殖,并促進(jìn)其發(fā)生衰老,這為闡明PCSK9調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞衰老的機(jī)制提供新的理論依據(jù)。

多倍體是指細(xì)胞整個(gè)基因組拷貝數(shù)增加(>2N)的狀態(tài),通常發(fā)生在植物細(xì)胞,在動物肝細(xì)胞、子宮平滑肌細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞、高血壓大鼠模型平滑肌細(xì)胞中也有發(fā)現(xiàn)[18,19]。有研究表明,細(xì)胞多倍體化參與血管平滑肌細(xì)胞凋亡和衰老的激活,但引起血管平滑肌細(xì)胞多倍體化的信號和潛在機(jī)制仍未完全闡明[3,8,20]。胞質(zhì)分裂是細(xì)胞周期的最后一步,阻滯胞質(zhì)分裂可以引起多倍體的形成,Komaravolu等[8]研究發(fā)現(xiàn),ApoER2參與原代小鼠主動脈血管平滑肌細(xì)胞有絲分裂過程中后期促進(jìn)復(fù)合物(anaphase-promoting complex, APC)/細(xì)胞分裂周期蛋白20(cell division cycle 20, CDC20)復(fù)合物的形成,ApoER2敲除可以顯著抑制血管平滑肌細(xì)胞的胞質(zhì)分裂,并引起血管平滑肌細(xì)胞的多倍體化及過早衰老。既往研究表明,ApoER2是LDLR家族成員,與LDLR的一級序列具有同源性,PCSK9催化結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合并促進(jìn)LDLR家族成員的降解[9]。本研究結(jié)果顯示,PCSK9過表達(dá)可以顯著下調(diào)ApoER2在血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)水平,加入的可溶性rhApoER2阻滯PCSK9對血管平滑肌細(xì)胞ApoER2的降解后可以逆轉(zhuǎn)PCSK9過表達(dá)誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞多倍體化。因此,推測PCSK9可能通過介導(dǎo)ApoER2的降解,抑制血管平滑肌細(xì)胞的胞質(zhì)分裂,進(jìn)而導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞的多倍體化和衰老。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)PCSK9過表達(dá)不僅顯著抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖,還可引發(fā)血管平滑肌細(xì)胞的多倍體化和衰老。機(jī)制上,PCSK9可能通過促進(jìn)ApoER2在血管平滑肌細(xì)胞中的降解,引發(fā)血管平滑肌細(xì)胞的多倍體化。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步揭示了PCSK9在血管平滑肌細(xì)胞中的生理作用,并提示PCSK9單克隆抗體不僅可以降低患者血脂水平,還在改善血管老化方面發(fā)揮潛在作用。