SCFAs調(diào)節(jié)線粒體自噬改善高糖下胰島β細(xì)胞損傷的研究

王思瑤 陸春暉 張 潔 靳 瑾

糖尿病現(xiàn)已成為全球日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題,嚴(yán)重威脅著人類健康。作為以高血糖為主要特征的慢性進(jìn)行性代謝疾病,糖尿病主要由遺傳和環(huán)境因素共同導(dǎo)致,而胰島β細(xì)胞功能異常是導(dǎo)致糖尿病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素[1,2]。機(jī)體內(nèi)血糖長(zhǎng)期處于升高狀態(tài)會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、炎癥等反應(yīng)發(fā)生,加速胰島β細(xì)胞凋亡,進(jìn)而使其功能受損,引起糖尿病及相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生[3]。目前,尋找改善高糖環(huán)境作用下胰島β細(xì)胞功能損傷的藥物或分子靶標(biāo),對(duì)于開發(fā)糖尿病的新型有效治療方案來說意義重大。

短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)主要由膳食纖維和未消化碳水化合物發(fā)酵過程中的腸道微生物群所產(chǎn)生,也是腸道上皮細(xì)胞能量供應(yīng)的重要來源,其主要包括乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉[4]。據(jù)報(bào)道,SCFAs能夠促進(jìn)腸黏膜上皮細(xì)胞增殖,改善腸道屏障的完整性,防止微生物易位,并進(jìn)一步抑制炎性反應(yīng)。然而,腸道菌群失調(diào)和產(chǎn)生SCFAs的細(xì)菌減少常見于各種代謝疾病中,包括糖尿病和肥胖癥[5,6]。在臨床研究和動(dòng)物建模研究中,增加膳食纖維攝入量或給予SCFAs,能夠?qū)ρ装Y性腸病、過敏性氣道疾病、1型糖尿病和2型糖尿病發(fā)揮保護(hù)作用,并抑制促炎性細(xì)胞因子的分泌和活性氧的產(chǎn)生,這表明SCFAs在治療慢性炎癥或代謝疾病方面具有廣闊的治療潛力,但其確切機(jī)制仍不明晰[7～9]。本研究旨在探討乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉3種SCFAs對(duì)高糖環(huán)境下所誘發(fā)胰島β細(xì)胞功能損傷的影響及其可能的作用機(jī)制。

材料與方法

1.主要材料與試劑:大鼠胰島素瘤INS-1細(xì)胞購自美國ATCC公司,胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司,乙酸鈉、丙酸鈉、丁酸鈉購自美國Sigma公司,青-鏈霉素雙抗、RPMI1640完全培養(yǎng)基及胰蛋白酶購自美國Gibco公司,CCK-8試劑盒購自上海漢恒生物工程有限公司,Annexin V-FITC/PI檢測(cè)試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司,Hoechst 33258染液和DCFH-DA熒光探針購自北京百奧萊博科技有限公司,胰島素含量檢測(cè)試劑盒購自上海超研生物科技有限公司,環(huán)氧樹脂購自美國Bio-Rad公司,RIPA裂解液、BCA測(cè)定試劑盒及ECL購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,兔抗LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62、PINK1及Parkin單克隆抗體購自英國Abcam公司,兔抗GAPDH多克隆抗體與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自美國 Santa Cruz公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2.方法

(1)細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理:INS-1細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),添加RPMI1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素雙抗),每24h更換1次培養(yǎng)液,待其長(zhǎng)滿瓶壁70%后,0.25%胰酶消化,常規(guī)傳代培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板,分組后進(jìn)行對(duì)應(yīng)處理,具體如下:①對(duì)照組:使用5mmol/L葡萄糖處理細(xì)胞;②模型組:使用33mmol/L葡萄糖處理細(xì)胞,建立高糖誘導(dǎo)損傷;③乙酸鈉(sodium acetate,NaA)組:預(yù)先以100μmol/L NaA處理細(xì)胞24h,然后高糖誘導(dǎo)損傷;④丙酸鈉(sodium propionate,NaP)組:預(yù)先以100μmol/L NaP處理細(xì)胞24h,然后高糖誘導(dǎo)損傷;⑤丁酸鈉(sodium butyrate,NaB)組:預(yù)先以100μmol/L NaB處理細(xì)胞24h,然后高糖誘導(dǎo)損傷。處理結(jié)束后,收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

(2)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性:INS-1細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,處理后24h,每孔中加入10μl CCK-8溶液,孵育培養(yǎng)2h,通過酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔450nm處吸光度(absorbance,A)值,計(jì)算細(xì)胞增殖率,細(xì)胞增殖率(%)=實(shí)驗(yàn)組A450/對(duì)照組A450×100%。

(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平:收集5組INS-1細(xì)胞,常規(guī)消化后離心,PBS清洗細(xì)胞,加入適量1×binding buffer重懸細(xì)胞,調(diào)整密度為1×106個(gè)/毫升,吸取100μl細(xì)胞懸液移入流式檢測(cè)管,再依次加入5μl Annexin V-FITC和10μl碘化丙錠,震蕩混勻,室溫孵育10min,立即通過流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。

(4)Hoechst 33258染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài):收集5組INS-1細(xì)胞,PBS清洗后,加入5μg/ml Hoechst 33258工作染液,置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育30min,PBS洗滌細(xì)胞并重懸,取適量細(xì)胞混懸液制片,在熒光顯微鏡下觀察并拍攝圖片,結(jié)果中細(xì)胞核呈亮藍(lán)色熒光。

(5)放射免疫法測(cè)定細(xì)胞釋放胰島素的含量:將5組INS-1細(xì)胞分別以2×105個(gè)/孔接種于48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜后,以4000r/min(離心半徑10cm)離心30min,吸取上清液,放射免疫法檢測(cè)不同處理組細(xì)胞釋放胰島素的含量,具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

(6)DCFH-DA熒光探針測(cè)定細(xì)胞ROS水平:將5組INS-1細(xì)胞分別以1×104個(gè)/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,添加含有10μmol/L DCFH-DA 的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30min,在熒光顯微鏡下觀察并拍攝圖片,通過酶標(biāo)儀檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)488nm、發(fā)射波長(zhǎng)525nm處每孔細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

(7)透射電子顯微鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)及自噬泡:收集5組INS-1細(xì)胞,PBS清洗,用預(yù)冷的2.5%戊二醛固定液固定過夜,再用1%四氧化鋨中固定,分級(jí)乙醇溶液中脫水后,環(huán)氧樹脂包埋。切片后,樣品用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色,在透射電子顯微鏡觀察各組細(xì)胞線粒體形態(tài)及線粒體自噬情況,拍攝圖片。

(8)Western blot法檢測(cè)線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平:添加RIPA裂解緩沖液分別提取5組INS-1細(xì)胞蛋白,BCA法蛋白定量,于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆?。在蛋白樣品中加入等體積樣品緩沖液,煮沸變性,每泳道按30μg上樣,通過10%SDS-PAGE電泳后,電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。常溫下以5%脫脂奶粉封閉并震蕩1h,在膜上加入LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62、PINK1及Parkin的單克隆抗體,共置于4℃冰箱孵育過夜,用辣根過氧化物酶標(biāo)記的對(duì)應(yīng)二抗,室溫孵育1h,ECL顯影并定影,以GAPDH作為內(nèi)參蛋白,Image J軟件測(cè)定各蛋白條帶灰度值,計(jì)算各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

結(jié) 果

1.各組INS-1細(xì)胞增殖率比較:與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞增殖率顯著降低(P<0.05);而NaA組、NaP組及NaB組細(xì)胞增殖率均顯著高于模型組細(xì)胞增殖率(P<0.05),詳見圖1。

圖1 各組INS-1細(xì)胞增殖率比較與對(duì)照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

2.各組INS-1細(xì)胞凋亡水平比較:與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與模型組比較,NaA組、NaP組及NaB組的細(xì)胞凋亡率均顯著降低(P<0.05),詳見圖2。

圖2 各組INS-1細(xì)胞凋亡率比較與對(duì)照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

通過Hoechst 33258染色觀察到對(duì)照組INS-1細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整,外圍輪廓清晰,細(xì)胞大小較為一致;模型組的部分細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)濃縮、碎裂的藍(lán)色凋亡體,說明細(xì)胞發(fā)生損傷與凋亡;相較于模型組,NaA組、NaP組以及NaB組細(xì)胞內(nèi)濃縮與碎裂現(xiàn)象有所改善,未見明顯的藍(lán)色凋亡體,詳見圖3。

圖3 各組INS-1細(xì)胞凋亡形態(tài)觀察(Hoechst 33258染色,×200)A.對(duì)照組;B.模型組;C.NaA組;D.NaP組;E.NaB組。箭頭所指為藍(lán)色凋亡體

3.各組INS-1細(xì)胞胰島素釋放含量比較:與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞的胰島素釋放量顯著降低(P<0.05);而相較于模型組,NaA組、NaP組及NaB組的細(xì)胞胰島素釋放水平均顯著增加(P<0.05),詳見圖4。

4.各組INS-1細(xì)胞活性氧水平比較:與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞熒光強(qiáng)度顯著升高(P<0.05),說明細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加;與模型組比較,NaA組、NaP組及NaB組的各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度均顯著降低(P<0.05),說明細(xì)胞內(nèi)ROS水平下降,詳見圖5。

圖5 各組INS-1細(xì)胞ROS水平測(cè)定(DCFH-DA染色,×100)A.對(duì)照組;B.模型組;C.NaA組;D.NaP組;E.NaB組。與對(duì)照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

5.各組INS-1細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果:TEM下觀察到對(duì)照組線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)完整,嵴清晰可見;模型組線粒體結(jié)構(gòu)受損,有明顯的空泡形成、嵴破壞和自噬體吞噬等現(xiàn)象;NaA組、NaP組及NaB組線粒體受損現(xiàn)象均較模型組明顯減輕,自噬體吞噬減少,詳見圖6。

圖6 各組INS-1細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察(TEM,×10000)A.對(duì)照組;B.模型組;C.NaA組;D.NaP組;E.NaB組。箭頭所指為線粒體吞噬體,M表示線粒體

6.各組INS-1細(xì)胞線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較:與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高,PINK1與Parkin蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào),而p62蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05);與模型組比較,NaA組、NaP組及NaB組的細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低,PINK1與Parkin蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào),同時(shí),p62蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05),詳見圖7。

圖7 各組INS-1細(xì)胞線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較與對(duì)照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

討 論

糖尿病的特征在于各種代謝異常,主要包括糖代謝和脂代謝以及其他內(nèi)分泌激素的代謝紊亂,從而引起高血糖、胰島素分泌不足、胰島素功能障礙等[2]。在過去的幾十年中,我國糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生率一直在穩(wěn)步上升[10]。血糖穩(wěn)態(tài)由胰島控制,胰島主要由α細(xì)胞、β細(xì)胞、δ細(xì)胞和PP細(xì)胞組成。其中,胰島α細(xì)胞通過分泌胰高血糖素促進(jìn)肝葡萄糖合成來提高血糖水平;胰島δ細(xì)胞分泌生長(zhǎng)抑素,通過旁分泌信號(hào)途徑下調(diào)胰島α細(xì)胞和胰島β細(xì)胞釋放的激素;胰島PP細(xì)胞分泌的胰多肽對(duì)于胰島素分泌具有再調(diào)節(jié)作用;胰島β細(xì)胞則通過刺激脂肪、肌肉、肝臟和腸細(xì)胞中的血糖攝取來釋放胰島素,從而達(dá)到降低血糖水平的效果[11]。

研究表明,胰島β細(xì)胞受損是糖尿病發(fā)生的主要病理性特征,糖尿病患者體內(nèi)血糖一直處于較高水平,這將直接誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞損傷,增加體內(nèi)胰島素抵抗,進(jìn)而導(dǎo)致胰島素釋放降低,血糖水平進(jìn)一步上升,產(chǎn)生惡性循環(huán),這種持續(xù)性作用會(huì)導(dǎo)致胰島β細(xì)胞衰竭,其特征是胰島β細(xì)胞功能障礙和數(shù)量明顯減少[12,13]。目前,控制血糖的治療策略主要集中在口服藥物和胰島素注射兩個(gè)方面,口服藥物如磺脲類藥物,可以通過不同的信號(hào)通路促進(jìn)內(nèi)源性胰島素分泌,但容易引起嚴(yán)重的低血糖癥;外源性胰島素注射,尤其是針對(duì)新發(fā)糖尿病的短期強(qiáng)化胰島素治療,可使胰島β細(xì)胞功能得到恢復(fù)[14]。雖然這些干預(yù)措施可以控制血糖或暫時(shí)改善胰島素分泌,但由2型糖尿病引起的并發(fā)癥的發(fā)生率并沒有顯著降低,主要原因可能是缺乏內(nèi)在的對(duì)胰島β細(xì)胞的直接保護(hù)方式。

大量研究指出,SCFAs在糖尿病的病理生理學(xué)中起關(guān)鍵作用。例如,與健康對(duì)照組比較,1型糖尿病患者產(chǎn)生SCFAs的細(xì)菌數(shù)量明顯減少,促進(jìn)SCFAs合成的基因也減少,這與微生物群紊亂有關(guān)[15]?；加?型糖尿病的患者產(chǎn)生SCFAs的微生物群和SCFAs豐度降低,這是由于腸道微生物群改變、腸道屏障受損以及血漿脂多糖水平升高所致[16]。在小鼠模型中,使用SCFAs進(jìn)行干預(yù)可以緩解1型糖尿病,這是通過降低自身免疫T細(xì)胞計(jì)數(shù)、抑制B淋巴細(xì)胞增殖以及擴(kuò)大結(jié)腸、脾臟和全身淋巴結(jié)中的FoxP3+Treg細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的[17]。此外,已有研究表明,SCFAs在糖尿病患者中的有利作用主要體現(xiàn)在降低血糖水平、改善胰島素抵抗、減輕炎癥和增強(qiáng)胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)的分泌。SCFAs可以保護(hù)胰島β細(xì)胞免受游離脂肪酸和其他一些細(xì)胞因子造成的損害,如采用SCFAs中的丙酸鈉預(yù)處理可顯著減少棕櫚酸鹽和炎性細(xì)胞因子誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞死亡,增強(qiáng)葡萄糖刺激的胰島素分泌和維持胰島β細(xì)胞質(zhì)量[18]。本研究結(jié)果同樣顯示,經(jīng)過乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉預(yù)處理,明顯降低了高糖環(huán)境誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡,并增加了胰島素釋放水平,由此進(jìn)一步說明了SCFAs可能在糖尿病中發(fā)揮胰島保護(hù)作用。

胰島β細(xì)胞長(zhǎng)期處于高糖環(huán)境下會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生,而ROS的過量累積會(huì)導(dǎo)致胰島β細(xì)胞凋亡[19]。因此,清除胰島β細(xì)胞內(nèi)過量的ROS并增強(qiáng)抗氧化能力是保護(hù)細(xì)胞免受高糖刺激受損的可行方法。本研究結(jié)果顯示,在高糖環(huán)境刺激下INS-1細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著增加,而經(jīng)過3種SCFAs乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉預(yù)處理的INS-1細(xì)胞內(nèi)ROS水平均顯著下降,該結(jié)果說明SCFAs能夠抑制高糖環(huán)境刺激下INS-1細(xì)胞內(nèi)ROS水平的增高,從而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),對(duì)胰島β細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

線粒體自噬參與調(diào)節(jié)糖尿病中胰島β細(xì)胞的生理功能,通過自噬可以去除由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)或受損線粒體,并抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),由此說明該途徑是控制線粒體質(zhì)量的重要途徑之一[20]。然而,由長(zhǎng)期氧化應(yīng)激引起的線粒體自噬也是多種疾病的共同特征,例如糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)退行性疾病及脂質(zhì)紊亂[21～23]。在糖尿病中,過度的線粒體自噬會(huì)損害胰島β細(xì)胞并減少其胰島素分泌,此外,還有助于線粒體內(nèi)ROS的產(chǎn)生、NLRP3依賴性促炎反應(yīng)的激活和脂毒性的加劇[24]。但關(guān)于高糖環(huán)境下線粒體自噬的潛在機(jī)制尚未完全闡明,探索基于胰島β細(xì)胞自噬保護(hù)作用是控制糖尿病的有效方式。PINK1/Parkin途徑是啟動(dòng)線粒體自噬的重要信號(hào)通路,當(dāng)線粒體膜電位減小時(shí),PINK1可以結(jié)合到線粒體中,將Parkin募集到線粒體外膜并啟動(dòng)線粒體自噬[25]。

本研究檢測(cè)結(jié)果顯示,經(jīng)高糖環(huán)境誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞線粒體明顯受損,內(nèi)有自噬體吞噬現(xiàn)象,自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高,p62蛋白相對(duì)表達(dá)量下調(diào),PINK1與Parkin蛋白相對(duì)表達(dá)量均上調(diào);而經(jīng)乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉預(yù)處理的INS-1細(xì)胞線粒體受損程度減小,自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低,p62蛋白相對(duì)表達(dá)量上調(diào),PINK1與Parkin蛋白相對(duì)表達(dá)量均下調(diào),該結(jié)果提示SCFAs能夠通過調(diào)節(jié)線粒體自噬而改善高糖環(huán)境刺激下的胰島β細(xì)胞功能損傷。

綜上所述,本研究結(jié)果表明,3種SCFAs乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉能夠保護(hù)高糖環(huán)境刺激下的INS-1細(xì)胞功能損傷,其可能的作用機(jī)制是通過抑制ROS產(chǎn)生及線粒體自噬實(shí)現(xiàn)的。該研究進(jìn)一步明確了高糖環(huán)境下胰島β細(xì)胞功能受損引起糖尿病發(fā)病的機(jī)制。但關(guān)于SCFAs保護(hù)高糖環(huán)境下?lián)p傷胰島β細(xì)胞確切的分子機(jī)制尚不清楚,需要后續(xù)進(jìn)行深入探究。