HPLC 法測(cè)定參蒲益智緩釋膠囊中β-細(xì)辛醚含量*

謝海龍，董晏含，孟怡彤，朱艷華

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司，黑龍江 虎林 158400）

石菖蒲主要有效成分為β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚，屬于揮發(fā)油類(lèi)成分[1]。具有“開(kāi)心孔，通九竅，久服輕身，不忘不迷或延年[2]”之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，其主要揮發(fā)油成分具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥、抗糖尿病[3]、細(xì)胞保護(hù)、降血脂、支氣管擴(kuò)張[4]、抗炎[5]、止瀉、抗?jié)兒玩?zhèn)痛等功用[6]。本課題組選用石菖蒲配伍人參為主藥制備了參蒲益智緩釋膠囊，對(duì)治療認(rèn)知障礙類(lèi)疾病尤其是血管性認(rèn)知障礙（VCI）[7]有確切療效。

本文應(yīng)用高效液相色譜（HPLC）對(duì)參蒲益智緩釋膠囊中β-細(xì)辛醚的含量進(jìn)行測(cè)定，為后續(xù)臨床研究提供質(zhì)量監(jiān)控基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與藥品

BT25S 型電子分析天平（德國(guó)Sartorius 公司）；KQ5200DB 型數(shù)控超聲波清洗器（永泰超聲儀器有限公司）；A2010 型島津液相色譜儀（日本島津公司）。

β-細(xì)辛醚標(biāo)準(zhǔn)品（B30631 源葉生物）；吐溫-80（AR 天津市光復(fù)精細(xì)化工廠）；參蒲益智緩釋膠囊（實(shí)驗(yàn)室自制）；甲醇（色譜純DIKMA 公司）；H3PO4（色譜純 科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 β-細(xì)辛醚分析方法的建立

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil GOLD（C18柱，250×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇∶0.1%磷酸水溶液（65∶35）；檢測(cè)波長(zhǎng)：257nm；流速：1.0mL·min-1；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取β-細(xì)辛醚對(duì)照品4.00mg，先用適量0.5%的吐溫-80 溶液超聲溶解，再定容至10mL 容量瓶?jī)?nèi)，搖勻，配制成濃度為400.00μg·mL-1的β-細(xì)辛醚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。然后精密吸取1mL 上述β-細(xì)辛醚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用0.5%的吐溫-80 溶液定容至10mL 容量瓶?jī)?nèi)，搖勻，配制成濃度為40.00 μg·mL-1β-細(xì)辛醚對(duì)照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備 取5 粒緩釋膠囊，每粒膠囊約0.50g，傾出內(nèi)容物，混勻，取適量顆粒并精密稱(chēng)定1.50g（約含188μL 石菖蒲揮發(fā)油），先加入適量0.5%的吐溫-80 溶液使其超聲溶解，再用0.5%的吐溫-80 溶液定容于10mL 容量瓶?jī)?nèi)，搖勻?yàn)V過(guò)，作為供試品溶液。

1.2.4 空白溶液的制備 按照比例稱(chēng)取輔料，0.5%吐溫-80 溶液作為溶劑溶解，定容至10mL 容量瓶?jī)?nèi)，搖勻，作為空白溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn)

使用0.22μm 濾膜過(guò)濾空白溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液。將續(xù)濾液按照“1.2.1”的色譜條件進(jìn)行分析，得到的譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 β-細(xì)辛醚高效液相色譜圖Fig.1 HPLC of β-asarone

由圖1 可見(jiàn)，β-細(xì)辛醚的保留時(shí)間約為10.8 min，且對(duì)照品、供試品的峰形較好，輔料峰未產(chǎn)生干擾，證明此方法的專(zhuān)屬性好。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取“1.2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別精密吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL 置于10mL 容量瓶中，分別得到4.00、8.00、16.00、24.00、32.00 和40.00μg·mL-1的對(duì)照品溶液，過(guò)濾，取續(xù)濾液按照“1.2.1”的色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以β-細(xì)辛醚濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=196959x-316847（R2=0.9993），標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

圖2 HPLC 法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve by HPLC method for determination

由圖2 可見(jiàn)，β-細(xì)辛醚在4.00～40.00μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

2.3.1 日內(nèi)精密度 配制濃度分別為4.00、16.00、32.00μg·mL-1的對(duì)照品溶液，平行配制6 份，按照“1.2.1”的色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算日內(nèi)精密度，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 日內(nèi)精密度結(jié)果Tab.1 Intraday precision results

由表1 可見(jiàn)，β-細(xì)辛醚的日內(nèi)精密度良好，符合方法學(xué)考察要求。

2.3.2 日間精密度 配制濃度分別為4.00、16.00、32.00μg·mL-1的對(duì)照品溶液，平行配制6 份，按照“1.2.1”的色譜條件進(jìn)樣，連續(xù)3d，記錄峰面積，計(jì)算日間精密度，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 日間精密度結(jié)果Tab.2 Inter-day precision results

由表2 可見(jiàn)，β-細(xì)辛醚的日間精密度良好，符合方法學(xué)考察要求。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按照“1.2.3”項(xiàng)下的供試品溶液配制方法，平行配制6 份溶液，按照“1.2.1”的色譜條件進(jìn)樣，分別在0、2、4、6、8、12 和24h 進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，β-細(xì)辛醚在24h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of stability test

2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取樣品6 份，每份約150mg，精密稱(chēng)定，置10mL容量瓶中，分別精密加入β-細(xì)辛醚對(duì)照品溶液（40.00μg·mL-1）0.2mL，加0.5%的吐溫-80 溶液超聲溶解完全并稀釋至刻度，分別精密吸取1mL 該溶液置5mL 容量瓶中，加0.5%的吐溫-80 溶液超聲稀釋至刻度，搖勻，按照“1.2.1”的色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 回收率測(cè)定結(jié)果Tab.4 Recovery determination results

由表4 可見(jiàn)，平均回收率的范圍在80%～120%之間，且RSD 值小于2%，符合方法學(xué)考察要求。

2.6 含量測(cè)定

按照“1.2.3”項(xiàng)下方法制備3 批供試品溶液，按照“1.2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，計(jì)算每粒緩釋膠囊中β-細(xì)辛醚的含量。結(jié)果顯示，每粒膠囊中β-細(xì)辛醚含量分別為104.97、105.32、104.74μg，其平均含量為105.01μg。

3 結(jié)論

本文采用HPLC 法建立了參蒲益智緩釋膠囊中β-細(xì)辛醚含量的測(cè)定方法，并進(jìn)行了相應(yīng)的方法學(xué)考察。結(jié)果表明，β-細(xì)辛醚在其濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其專(zhuān)屬性強(qiáng)，日內(nèi)精密度、日間精密度均較好，穩(wěn)定性、加樣回收率的RSD 值均小于2%，符合方法學(xué)考察要求，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好。為參蒲益智緩釋膠囊的質(zhì)量監(jiān)控提供了數(shù)據(jù)支持。