復(fù)合雜合突變導(dǎo)致遺傳性蛋白C 缺陷癥一家系調(diào)查*

孫維杰，徐琦煜，王峰，徐全軍，周偉，陳慧敏，牧啟田（.寧波大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江寧波 3500；.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，浙江溫州 3505）

蛋白C（protein C，PC）作為機(jī)體內(nèi)重要的生理性抗凝物質(zhì)，是一種維生素K 依賴性絲氨酸蛋白酶原，主要由肝細(xì)胞合成并以一種無活性酶原的形式釋放至血漿中［1］。PC 缺陷癥的診斷主要依靠實(shí)驗(yàn)室檢查，如PC 活性（PC：A）和PC 抗原（PC：Ag）的測定。包括PC、蛋白S（protein S，PS）以及抗凝血酶（antithrombin，AT）在內(nèi)的生理性抗凝蛋白缺陷是遺傳性易栓癥的主要病因。PC 缺陷癥導(dǎo)致的家族性易栓癥由Griffin 等［2］于1981 年首次報(bào)道，之后越來越多的研究證實(shí)PC 缺陷癥是易栓癥的高危因素。這類疾病的臨床表現(xiàn)主要以靜脈血栓栓塞為主，其中深靜脈血栓栓塞和肺栓塞最常見［3］。本研究旨在觀察并分析復(fù)合雜合突變導(dǎo)致遺傳性PC 缺陷癥家系的臨床特征以及PROC基因的突變情況。

1 資料與方法

1.1 病歷資料 先證者男，27 歲，2020 年12 月因“肩肋部疼痛2 d，咳嗽伴痰中帶血2 d”就診于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院。追問有無出血史或血栓史，得知先證者1 年前曾因腸系膜靜脈血栓形成在寧波大學(xué)附屬第一醫(yī)院血管外科保守治療好轉(zhuǎn)后出院，出院后間斷口服利伐沙班進(jìn)行抗凝治療。常規(guī)凝血檢查示先證者PC：A 降至27%（參考區(qū)間70%～130%），初步診斷為PC 缺陷癥。其父母和妹妹肺動(dòng)脈造影及雙下肢深靜脈B 超檢查均未發(fā)現(xiàn)異常。本次住院時(shí)先證者及其家系成員均進(jìn)行血漿PC 水平及PROC基因檢測。選擇溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2020 年10 月至12 月就診且無肝腎功能異常，無出血及血栓史的體檢健康者100 例作為健康人對(duì)照，其中男53 例，女47 例，年齡16～60 歲（中位年齡32 歲）。所有受試者均簽署知情同意書，并經(jīng)寧波大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫審2012-17）。該先證者家系圖譜見圖1。

圖1 遺傳性PC 缺陷癥家系圖

1.2 主要儀器及試劑 STA-Max 全自動(dòng)血凝儀（法國Stago 公司），DeNovix DS-11 超微量分光光度計(jì)（美國DeNovix 公司），ABI 2720 PCR 擴(kuò)增儀、ABI PRISM 3700 測序儀（美國Applied Biosystems 公司）。PT、APTT 和PC：A 凝血試劑（法國Stago 公司），DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技公司）。

1.3 樣本采集和處理 采集先證者及家系成員就診時(shí)的空腹外周靜脈血2.7 mL，109 mmol／L 枸櫞酸鈉1 ∶9 抗凝，8 ℃、3 000 r／min 離心10 min，離心后上層乏血小板血漿立即用于檢測各項(xiàng)凝血指標(biāo)；其余部分按照DNA 提取試劑盒說明書提取外周血單個(gè)核細(xì)胞的基因DNA，并置于-40 ℃保存。

1.4 實(shí)驗(yàn)室表型檢測 按照STA-Max 全自動(dòng)血凝儀說明書，采用凝固法檢測血漿凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）、纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)ib）和PS 活性（PS：A），發(fā)色底物法檢測PC：A 和AT 活性（AT：A）。

1.5 DNA 提取及基因測序分析 提取先證者及家系成員基因組DNA，使用DS-11 超微量分光光度計(jì)檢測基因組DNA 的純度和濃度，取純度（A260nm／A280nm）約為1.8，濃度為50 ng／μL 的DNA 樣本，置于-40 ℃保存。PCR 擴(kuò)增先證者PROC基因（Gen-Bank：AF378903）所有外顯子及側(cè)翼序列，利用Primer-BLAST（https：／ ／www.ncbi.nlm.nih.gov／tools／primer-blast／）設(shè)計(jì)引物，并由上海桑尼生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。PCR 反應(yīng)體系為25 μL，包括1×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，雙蒸水7.5 μL，50 ng／μL DNA 模板3 μL，10 μmol／L 上、下游引物各1 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，根據(jù)不同引物的退火溫度相應(yīng)退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)15 g／L 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行特異性鑒定，紫外光下觀察為單一明亮條帶。電泳陽性產(chǎn)物經(jīng)純化后送上海桑尼生物技術(shù)有限公司測序。

1.6 生物信息學(xué)分析 應(yīng)用多序列比對(duì)軟件ClustalX-2.1-win 對(duì)多種同源性物種氨基酸突變位點(diǎn)的保守水平進(jìn)行研究。同源性物種的氨基酸序列來源網(wǎng)址：http：／ ／www.ncbi.nlm.nih.gov／homologene；使用在線生物信息學(xué)軟件PROVEAN（http：／／provean.jcvi.org／index.php）預(yù)測突變的致病性。

2 結(jié)果

2.1 凝血指標(biāo)檢測結(jié)果 先證者常規(guī)凝血指標(biāo)檢查PT、APTT、Fib、PS：A 及AT：A 均在參考區(qū)間內(nèi)，D-二聚體（D-D）為6.22 mg／L，PC：A 降至27%。先證者的父親、母親和妹妹的PC：A 分別降低至67%、63%和60%。先證者及其家系成員實(shí)驗(yàn)室表型檢測結(jié)果見表2。

表2 遺傳性PC 缺陷癥家系成員表型和基因型檢測結(jié)果

2.2 基因測序結(jié)果 先證者PROC基因第7 號(hào)外顯子存在 c.541T ＞G 雜合錯(cuò)義突變導(dǎo)致p.Phe181Val和c.577-579delAAG 雜合缺失突變?yōu)閜.Lys192deletion，其父親為c.541T＞G 突變雜合子，母親和妹妹為c.577-579delAAG 突變雜合子，外祖父為野生型，見圖2。

圖2 PROC 基因第7 號(hào)外顯子測序結(jié)果

2.3 生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果 保守性分析顯示，Lys192 和Phe181 在同源物種間高度保守（圖3）；PROVEAN 軟件預(yù)測c.577-579delAAG 雜合錯(cuò)義突變和c.541T＞G 雜合缺失突變均為有害突變，得分分別為-2.88 分和-4.67 分（得分≤-2.5 分為有害突變；＞-2.5 分為中性突變）。

圖3 p.Lys192（A）和p.Phe181（B）位點(diǎn)保守性分析結(jié)果

3 討論

近年來，隨著檢驗(yàn)技術(shù)和手段的進(jìn)步，PC 缺陷癥的發(fā)病率逐年升高，雜合子型攜帶者在人群中的發(fā)病率為1／500～1／200，而純合子型在人群中的發(fā)病率約為1／4 萬～1／2.5 萬［4］。截止至2023 年1 月，人類基因突變數(shù)據(jù)庫（Human Gene Mutation Database，HGMD）記錄了300 多個(gè)PROC基因突變，其中錯(cuò)義／無義突變占主要部分。本例先證者基因測序發(fā)現(xiàn)PROC基因第7 號(hào)外顯子存在c.541T＞G 錯(cuò)義突變和c.577-579delAAG 缺失突變。c.541T＞G 錯(cuò)義突變在dbSNP 數(shù)據(jù)庫中的編號(hào)為rs199469470，GnomAD-exome 數(shù)據(jù)庫、ExAC 數(shù)據(jù)庫以及ALFA 數(shù)據(jù)庫顯示此錯(cuò)義突變在人群中的突變頻率分別為0.000 052、0.000 025 及0.000 00。c.577-579delAAG 缺失突變在HGMD 公開版數(shù)據(jù)庫中已有收錄該位點(diǎn)PC 缺陷癥的致病性報(bào)道（ID：CD004314）。臨床上根據(jù)PC 活性和抗原降低水平的不同，PC 缺陷癥分為兩種類型：Ⅰ型指PC 合成減少，即血漿PC 活性和抗原含量同步降低；Ⅱ型指合成了異常的PC 分子，即PC 活性水平降低，但抗原含量正?；蛟龈?。Ⅱ型又可以進(jìn)一步分為Ⅱa 型和Ⅱb 型；其中Ⅱa 型指抗原含量正常，抗凝活性及酰胺水解活性降低；Ⅱb型指抗原含量正常，抗凝活性下降［5］。約75%的PC 缺陷癥患者屬于Ⅰ型，是靜脈血栓形成公認(rèn)的危險(xiǎn)因素；Ⅱ型PC 缺陷癥約占24%，其中Ⅱb 型PC 缺陷癥十分罕見。多項(xiàng)文獻(xiàn)報(bào)道，c.541T＞G 錯(cuò)義突變引起Ⅰ型PC 缺陷癥［6］；c.577-579delAAG 缺失突變引起Ⅱ型PC 缺陷癥［6-7］。

本例先證者既往有血栓史，胸部CT 肺動(dòng)脈造影顯示肺栓塞，下肢靜脈造影提示下腔靜脈及右髂總靜脈、兩側(cè)髂內(nèi)靜脈血栓形成，PC：A 降至27%，PROC基因第7 號(hào)外顯子存在復(fù)合雜合突變，保守性分析結(jié)果顯示Phe181 和Lys192 位點(diǎn)在同源物種間均高度保守，表明該2 個(gè)位點(diǎn)氨基酸是PC 蛋白發(fā)揮正常作用的重要功能位點(diǎn)；生物信息學(xué)軟件預(yù)測c.541T＞G 錯(cuò)義突變和c.577-579delAAG 缺失突變均為有害突變，推測該復(fù)合雜合突變可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成減少、穩(wěn)定性下降或分泌障礙，引起血漿PC 水平降低，是導(dǎo)致患者發(fā)生肺栓塞的重要原因之一。其他家系成員為單雜合突變且PC：A 略有降低，目前尚無血栓形成事件發(fā)生。結(jié)合本案例，先證者有腸系膜靜脈血栓史，應(yīng)引起臨床醫(yī)生的高度重視，對(duì)于無明顯誘因反復(fù)發(fā)作或發(fā)病年齡較低的靜脈血栓栓塞患者，應(yīng)進(jìn)行PC：A、PS：A 和AT：A 的普查以及血栓相關(guān)基因檢測（PROC基因、PROS1基因及SERPINC1基因）。確定存在生理性抗凝蛋白缺陷，則需進(jìn)一步對(duì)家系其他成員進(jìn)行相關(guān)基因篩查。PC 和PS 都屬于維生素K 依賴的蛋白質(zhì)，對(duì)于遺傳性PC 缺陷癥患者推薦使用利伐沙班等新型抗凝藥物進(jìn)行治療，對(duì)于確診易栓癥的患者，建議終生抗凝治療以預(yù)防血栓性疾病的發(fā)生，對(duì)于未發(fā)生血栓形成事件的遺傳性PC 缺陷癥攜帶者，是否進(jìn)行抗凝治療來預(yù)防血栓栓塞，目前尚無定論。