種曲接種量對(duì)醬油制曲及發(fā)酵的影響

黃佳玲，劉建華，劉艷梅，蘇燕文

（廣東廚邦食品有限公司，廣東陽(yáng)江 529500）

醬油釀造主要包含制曲與發(fā)酵兩大過(guò)程，制曲過(guò)程是醬油釀造的重要環(huán)節(jié)。米曲霉在制曲過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其分泌產(chǎn)生的各種酶，為醬油發(fā)酵的原料分解、物質(zhì)轉(zhuǎn)化合成奠定了基礎(chǔ)[1]。醬油制曲過(guò)程中蒸料時(shí)間、米曲霉接種量、制曲溫度、制曲時(shí)間對(duì)成曲品質(zhì)指標(biāo)（蛋白酶比活力、谷氨酰胺酶比活力）均具有影響，其中接種量對(duì)蛋白酶比活力的影響最大[2]。醬油制曲用的米曲霉一般是由其母種經(jīng)過(guò)3～4代擴(kuò)大培養(yǎng)而來(lái)，統(tǒng)稱(chēng)為種曲。種曲是醬油生產(chǎn)制曲的種子，種曲制作的主要目的是為醬油生產(chǎn)提供大量種子，即孢子[3]。但不同菌株產(chǎn)孢子能力不同，即使使用相同菌株培養(yǎng)所得的種曲，其孢子數(shù)也有很大不同[4]。實(shí)際生產(chǎn)中，為便于生產(chǎn)操作控制落實(shí)，制曲過(guò)程接入種曲時(shí)，往往是以培養(yǎng)種曲用的對(duì)應(yīng)干物料的重量計(jì)算種曲重量，此時(shí)接入的種曲量雖相同，但不同培養(yǎng)工藝培養(yǎng)所得種曲本身的干基孢子數(shù)仍存在較大差異，會(huì)導(dǎo)致制曲接入的有效孢子數(shù)差異較大，進(jìn)而可能會(huì)導(dǎo)致不同批次間制曲的質(zhì)量產(chǎn)生較大波動(dòng)，不利于產(chǎn)品品質(zhì)的穩(wěn)定。因此，需要找到制曲過(guò)程中種曲（米曲霉孢子）有效接種量的最優(yōu)控制水平，用以控制生產(chǎn)并提升產(chǎn)品的質(zhì)量與穩(wěn)定性。

本文采用不同米曲霉孢子有效接入量進(jìn)行醬油制曲與發(fā)酵，跟蹤監(jiān)測(cè)不同時(shí)間曲料感官、制曲酶活的高低及不同時(shí)間發(fā)酵過(guò)程中常見(jiàn)理化指標(biāo)，以期為企業(yè)大生產(chǎn)中的種曲接種量的控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種與原料

菌種，廣東廚邦食品有限公司自培米曲霉三角瓶菌種；制曲與發(fā)酵過(guò)程所用原材料麩皮、黃豆、小麥、食用鹽，均從市場(chǎng)采購(gòu)。

1.2 儀器與設(shè)備

IKA RH磁力攪拌器，廣州綠百草科學(xué)儀器有限公司；25×16血球計(jì)數(shù)板，上海求精生化試劑儀器有限公司；E100顯微鏡，南京江南永新光學(xué)有限公司；DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；KDC-2C型微量凱式定氮儀，上海纖檢儀器有限公司；Biochrom 30+全自動(dòng)氨基酸分析儀，英國(guó)柏楉有限公司；200 kg種曲機(jī)，江蘇華暉環(huán)?？萍加邢薰?；發(fā)酵池，廣東廚邦食品有限公司設(shè)計(jì)自制；65 m3發(fā)酵罐，連云港中復(fù)連眾復(fù)合材料集團(tuán)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 種曲培養(yǎng)方法

麩皮原料直接均勻按1.0～1.5 cm的厚度裝滿(mǎn)曲盤(pán)后，放入種曲機(jī)；以180～200 mL·min-1的噴水量補(bǔ)濕25～30 min，同步開(kāi)啟種曲機(jī)風(fēng)機(jī)；啟動(dòng)種曲機(jī)的自動(dòng)滅菌與冷卻功能，自動(dòng)通入蒸汽升溫至120～125 ℃，保壓滅菌25～30 min對(duì)麩皮培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，而后自動(dòng)冷卻使培養(yǎng)基的溫度降至35～40 ℃；接入（6±2）‰的三角瓶菌種，并同步開(kāi)啟種曲機(jī)風(fēng)機(jī)20～30 min，接種完畢；控制加濕噴頭的噴水量在270～300 mL·min-1對(duì)接種后的培養(yǎng)基加濕（120±5） min，同步開(kāi)啟種曲機(jī)風(fēng)機(jī)；通過(guò)種曲機(jī)的自動(dòng)培養(yǎng)程序進(jìn)行自動(dòng)控溫、加濕和通風(fēng)，同時(shí)整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中種曲機(jī)風(fēng)機(jī)需保持一直開(kāi)啟。其中，培養(yǎng)溫度為28～36 ℃，通風(fēng)量為5～7 m3·h-1，以180～200 mL·min-1的噴水量間斷性加濕培養(yǎng)至72 h，最終培養(yǎng)獲得成熟種曲[5]。

1.3.2 種曲有效接種量對(duì)醬油制曲的影響

將按1.3.1種曲培養(yǎng)方法培養(yǎng)所得的種曲依據(jù)其干基孢子數(shù)折算為60億個(gè)/g、80億個(gè)/g、100億個(gè)/g、120億個(gè)/g和140億個(gè)/g不同干基孢子數(shù)的種曲（折算方法詳見(jiàn)表1），再統(tǒng)一以3‰（W/W）的接種量將折算后種曲接入制曲原料進(jìn)行大曲培養(yǎng)。其間，培養(yǎng)至第15～16 h進(jìn)行第一次翻曲，繼續(xù)培養(yǎng)至第21～24 h進(jìn)行第二次翻曲，培養(yǎng)至44 h獲得成熟大曲[6]。每組試驗(yàn)需記錄第一、二次翻曲時(shí)曲料與成熟大曲的感官狀態(tài)，并以其感官、大曲中性蛋白酶活為判定依據(jù)，初步確定制曲適宜的種曲有效接種量。

表1 不同干基孢子數(shù)種曲的折算方法

1.3.3 種曲有效接種量對(duì)醬油發(fā)酵的影響

將1.3.2試驗(yàn)中初步確定的制曲適宜的種曲有效接種量對(duì)應(yīng)組別的成熟大曲分別與2.2倍20%的鹽水混合制醪，以相同投料量和投料時(shí)間分別投入65 m3發(fā)酵罐，參照廣式高鹽稀態(tài)醬油釀造的常規(guī)工藝進(jìn)行發(fā)酵。在發(fā)酵至10 d、20 d、30 d、60 d、90 d和120 d，分別取其發(fā)酵液檢測(cè)總酸、氨基酸態(tài)氮、全氮、還原糖等常規(guī)指標(biāo)進(jìn)行跟進(jìn)驗(yàn)證，再結(jié)合1.3.2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)制曲適宜的種曲有效接種量。

1.3.4 在廣式高鹽稀態(tài)醬油釀造工藝中的應(yīng)用試驗(yàn)

以成熟大曲的感官、中性蛋白酶活及其90 d發(fā)酵液氨基酸態(tài)氮與全氮為主要指標(biāo)、90 d發(fā)酵液總酸、還原糖為參考指標(biāo)，驗(yàn)證1.3.2與1.3.3共同確認(rèn)的種曲有效接種量應(yīng)用于廣式高鹽稀態(tài)醬油釀造工藝中制曲與發(fā)酵的穩(wěn)定性。按照1.3.1種曲培養(yǎng)方法制備種曲，再按照1.3.2的制曲工藝制備成熟大曲（制曲接種量按照1.3.2與1.3.3共同確認(rèn)的種曲有效接種量執(zhí)行），而后按照1.3.3的發(fā)酵工藝進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵至120 d取其發(fā)酵液進(jìn)行檢測(cè)。上述試驗(yàn)共開(kāi)展10批次平行試驗(yàn)，以驗(yàn)證其在大生產(chǎn)中的穩(wěn)定性。

1.3.5 數(shù)據(jù)測(cè)定方法

孢子數(shù)測(cè)定參照《孢子數(shù)測(cè)定法》（SB/T 10315—1999）[7]；中性蛋白酶活測(cè)定參照《蛋白酶活力測(cè)定》（SB/T 10317—1999）[8]；總酸含量參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總酸的測(cè)定》（GB 12456—2021）[9]，采用第三法自動(dòng)電位滴定法測(cè)定；氨基酸態(tài)氮含量測(cè)定參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》（GB 5009.235—2016）[10]；還原糖含量參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中還原糖的測(cè)定》（GB 5009.7—2016）[11]，采用直接滴定法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 種曲有效接種量對(duì)醬油制曲的影響

米曲霉的接種量對(duì)醬油制曲的質(zhì)量，特別是其關(guān)鍵指標(biāo)蛋白酶活有一定影響。在大生產(chǎn)中，制曲接入的種曲量相對(duì)固定，但當(dāng)種曲的孢子數(shù)不同時(shí)，其不同批次有效米曲霉孢子接入量亦不相同，可能會(huì)對(duì)制曲質(zhì)量產(chǎn)生影響。試驗(yàn)通過(guò)將種曲折算為不同干基孢子數(shù)的種曲，再按統(tǒng)一的接種量制曲（實(shí)際接入的有效孢子數(shù)不同），從而驗(yàn)證確定制曲適宜的種曲有效接種量，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 種曲有效接種量對(duì)醬油制曲影響的試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，隨著制曲接種的折算后種曲干基孢子數(shù)的升高，米曲霉的生長(zhǎng)速度逐步加快，開(kāi)始產(chǎn)生孢子的時(shí)間亦有所提前，成熟大曲的孢子量明顯上升。當(dāng)制曲接種的折算后種曲干基孢子數(shù)達(dá)到140億個(gè)/g時(shí)，米曲霉生長(zhǎng)速度最快，在第二次翻曲時(shí)曲料的孢子量已到達(dá)生產(chǎn)可接受水平的上限，而成熟大曲感官孢子豐滿(mǎn)、孢子量遠(yuǎn)超出生產(chǎn)可接受水平；當(dāng)制曲接種的折算后種曲干基孢子數(shù)在120億個(gè)/g及以下時(shí)，成曲孢子量最多為3個(gè)+的水平，均處于生產(chǎn)可接受水平。成熟大曲的中性蛋白酶活則整體呈現(xiàn)先快后慢的上升趨勢(shì)，在制曲接種的折算后種曲干基孢子數(shù)為120億個(gè)/g時(shí)，成熟大曲中性蛋白酶活達(dá)到最大值（2 757 U·g-1）；制曲接種的折算后種曲干基孢子數(shù)繼續(xù)提升至140億個(gè)/g時(shí)，成熟大曲中性蛋白酶活為2 682 U·g-1，略有下降。這可能是因?yàn)榉N曲有效接種量過(guò)大，會(huì)引起品溫上升相對(duì)較快，易結(jié)塊，不利于通風(fēng)供氧，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗過(guò)快，影響米曲霉的生長(zhǎng)代謝，導(dǎo)致產(chǎn)酶量降低。結(jié)合生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，暫定制曲適宜的種曲有效接種量為接種3‰折算為80～120億個(gè)/g干基孢子數(shù)的種曲。

2.2 種曲有效接種量對(duì)醬油發(fā)酵的影響

分別采用1.3.2試驗(yàn)中制曲接種量為接種3‰折算后干基孢子數(shù)為80億個(gè)/g、100億個(gè)/g、120億個(gè)/g的種曲培養(yǎng)所得成熟大曲與鹽水混合制醪，而后發(fā)酵曬制，并跟進(jìn)發(fā)酵過(guò)程中不同天數(shù)發(fā)酵液的總酸、氨基酸態(tài)氮、全氮、還原糖等評(píng)價(jià)發(fā)酵質(zhì)量?jī)?yōu)劣的主要指標(biāo)。

2.2.1 發(fā)酵過(guò)程總酸的動(dòng)態(tài)變化

由圖1醬油發(fā)酵過(guò)程中總酸的動(dòng)態(tài)變化可以看出，醬油發(fā)酵過(guò)程中，不同組別總酸含量均是在發(fā)酵前90 d快速上升，90 d時(shí)基本達(dá)到最高水平，而后維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。120 d總酸含量有小幅下降，可能是因?yàn)槟承┪⑸锟梢詫⒂袡C(jī)酸轉(zhuǎn)化為其他次級(jí)代謝產(chǎn)物[12]。總酸是醬油品鑒的風(fēng)味物質(zhì)，且與產(chǎn)品貨架期的體態(tài)穩(wěn)定性相關(guān)，總酸過(guò)低會(huì)導(dǎo)致醬油體態(tài)不穩(wěn)定，析出絮狀雜質(zhì)或晶體，且影響醬油防腐效果；總酸過(guò)高會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品發(fā)酸，影響其風(fēng)味的柔和性，并掩蓋發(fā)酵醬油本身的醬香味[13]。因此，結(jié)合生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，種曲有效接種量?jī)?yōu)選為接種3‰折算為80億個(gè)/g、100億個(gè)/g干基孢子數(shù)的種曲。

圖1 醬油發(fā)酵過(guò)程中總酸的動(dòng)態(tài)變化

2.2.2 發(fā)酵過(guò)程氨基酸態(tài)氮與全氮的動(dòng)態(tài)變化

全氮是醬油中可溶性含氮化合物的總稱(chēng)，包括原料溶出的蛋白質(zhì)、發(fā)酵過(guò)程蛋白酶解產(chǎn)生的游離氨基酸、多肽氮、微生物自溶釋放的核酸類(lèi)水解物等，是衡量原料利用率與醬油發(fā)酵品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。氨基酸態(tài)氮?jiǎng)t是指以氨基酸形式存在的氮，也是全氮的一部分，更是區(qū)分不同級(jí)別醬油的核心指標(biāo)之一。發(fā)酵過(guò)程中氨基酸態(tài)氮與全氮的動(dòng)態(tài)變化分別見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 醬油發(fā)酵過(guò)程中氨基酸態(tài)氮的動(dòng)態(tài)變化

圖3 醬油發(fā)酵過(guò)程中全氮的動(dòng)態(tài)變化

由圖2、圖3可以看出，醬油發(fā)酵過(guò)程中，不同組別氨基酸態(tài)氮均呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢(shì)，60 d后上升幅度逐漸變緩，發(fā)酵至120 d時(shí)，3組醬油的氨基酸態(tài)氮含量分別為1.03 g/100 mL、1.07 g/100 mL、1.07 g/100 mL，均達(dá)到國(guó)標(biāo)中對(duì)特級(jí)醬油的要求。3組中，制曲接種的折算后種曲干基孢子數(shù)為100億個(gè) /g與120億個(gè)/g的組別，其不同發(fā)酵天數(shù)的氨基酸態(tài)氮均高于制曲接種的折算后種曲干基孢子數(shù)為80億個(gè)/g的組別。3組醬油發(fā)酵液的全氮含量均呈現(xiàn)為在30 d前快速上升，30 d之后緩慢增加/維持相對(duì)穩(wěn)定水平的趨勢(shì)，最終發(fā)酵結(jié)束時(shí)，3組醬油全氮含量分別為1.57 g/100 mL、1.58 g/100 mL、1.58 g/100 mL，3組全氮水平相當(dāng)、無(wú)明顯差異。整體來(lái)看，制曲接種的折算后種曲干基孢子數(shù)為100億個(gè)/g與120億個(gè)/g的組別，發(fā)酵過(guò)程全氮溶出與氨基酸生成的速率較快，發(fā)酵結(jié)束時(shí)氨基酸態(tài)氮相對(duì)較高，但對(duì)全氮的最終積累無(wú)優(yōu)勢(shì)。因此，種曲有效接種量?jī)?yōu)選為接種3‰折算為100億個(gè)/g、120億個(gè)/g干基孢子數(shù)的種曲。

2.2.3 發(fā)酵過(guò)程還原糖的動(dòng)態(tài)變化

在發(fā)酵過(guò)程中，淀粉質(zhì)原料在糖化酶、淀粉酶等的作用下被分解為還原糖，醬油的口感、風(fēng)味、色澤等都與還原糖含量密切相關(guān)[14]。發(fā)酵過(guò)程中還原糖的動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)圖4。

圖4 醬油發(fā)酵過(guò)程中還原糖的動(dòng)態(tài)變化

由圖4可以看出，醬油發(fā)酵過(guò)程中，3組醬油發(fā)酵液還原糖含量均呈現(xiàn)先上升后逐漸降低的趨勢(shì)，在發(fā)酵至第20 d時(shí)，3組醬油發(fā)酵液的還原糖含量均達(dá)到最大值，分別為6.70 g/100 mL、5.67 g/100 mL、5.35 g/100 mL。這主要是發(fā)酵前期淀粉酶等活力尚處于旺盛期，可以快速將淀粉質(zhì)原料水解成葡萄糖、麥芽糖等還原糖，且此時(shí)還原糖的消耗速度較低，所以前期還原糖含量快速上升至最高值。20 d之后，隨著發(fā)酵的持續(xù)進(jìn)行，乳酸菌、酵母菌等微生物逐漸發(fā)展為優(yōu)勢(shì)菌群，將前期積累的還原糖進(jìn)一步分解代謝為酸類(lèi)、醇類(lèi)、酯類(lèi)等次級(jí)代謝產(chǎn)物，故而導(dǎo)致還原糖含量下降。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，3組醬油的還原糖含量分別下降至5.10 g/100 mL、4.33 g/100 mL、3.25 g/100 mL，第3組醬油的還原糖含量最低，這可能是由于第3組的有效接種量最多，接種量過(guò)大導(dǎo)致制曲過(guò)程對(duì)淀粉質(zhì)的消耗過(guò)多所致。結(jié)合產(chǎn)品品質(zhì)控制的需求與生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，種曲有效接種量?jī)?yōu)選為接種3‰折算為80億個(gè)/g、100億個(gè)/g干基孢子數(shù)的種曲。

綜合以上理化指標(biāo)，3組中第2組醬油的各項(xiàng)指標(biāo)均能達(dá)到生產(chǎn)所需的優(yōu)選水平，因此可繼續(xù)以制曲接種3‰折算后干基孢子數(shù)為100億個(gè)/g的種曲進(jìn)行后續(xù)應(yīng)用試驗(yàn)。

2.3 優(yōu)選種曲有效接種量應(yīng)用試驗(yàn)

按照2.2中最終確定的優(yōu)選種曲有效接種量在廣式高鹽稀態(tài)醬油釀造工藝中開(kāi)展應(yīng)用試驗(yàn)，其試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 優(yōu)選種曲有效接種量應(yīng)用試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，按照制曲接種3‰折算后干基孢子數(shù)為100億個(gè)/g的種曲進(jìn)行醬油制曲與發(fā)酵應(yīng)用試驗(yàn)，其培養(yǎng)所得成熟大曲的整體感官菌絲豐滿(mǎn)、孢子量適中，均在生產(chǎn)可接受水平內(nèi)，大曲中性蛋白酶活均在2 000 U·g-1以上的較高水平；所得的大曲進(jìn)行醬油發(fā)酵時(shí)，其120 d醬油發(fā)酵液的總酸含量均值為1.79 g/100 mL，氨基酸態(tài)氮含量均值為1.08 g/100 mL，全氮均值為1.59 g/100 mL，還原糖均值為4.45 g/100 mL，各項(xiàng)理化指標(biāo)均能達(dá)到前期試驗(yàn)的優(yōu)選水平及以上，整體質(zhì)量水平優(yōu)良穩(wěn)定。

3 結(jié)論

本文考察了不同種曲（米曲霉孢子）有效接種量對(duì)醬油制曲與發(fā)酵的影響，結(jié)果表明，隨著種曲有效接種量的提升，在制曲時(shí)，成熟大曲的中性蛋白酶活整體呈先上升后穩(wěn)定的趨勢(shì)，接種量提升能夠促進(jìn)米曲霉加快生長(zhǎng)，但提升較多會(huì)導(dǎo)致制曲過(guò)程產(chǎn)孢子時(shí)間大大提前，甚至成熟大曲的孢子量超出生產(chǎn)可接受水平，就生產(chǎn)而言，孢子數(shù)過(guò)多可能影響工人操作，同時(shí)也不便于后期清潔[15]。在試驗(yàn)范圍內(nèi)，種曲有效接種量相對(duì)較低的試驗(yàn)組，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，其總酸與還原糖含量相對(duì)較高，能夠達(dá)到生產(chǎn)較優(yōu)水平；而種曲有效接種量相對(duì)較高時(shí)，發(fā)酵過(guò)程全氮溶出與氨基酸生成的速率較快，特別是發(fā)酵前期，發(fā)酵結(jié)束時(shí)氨基酸態(tài)氮的積累量相對(duì)較高，但對(duì)全氮的最終積累量無(wú)優(yōu)勢(shì)。綜合來(lái)看，種曲有效接種量?jī)?yōu)選為制曲接種3‰折算后干基孢子數(shù)為100億個(gè)/g的種曲。使用該種曲有效接種量進(jìn)行制曲，培養(yǎng)所得大曲的中性蛋白酶活可穩(wěn)定達(dá)到2 000 U·g-1以上的較高水平，且不會(huì)出現(xiàn)成熟大曲孢子量超出生產(chǎn)可接受水平的問(wèn)題；進(jìn)一步制醪發(fā)酵至120 d時(shí)，獲得的醬油總酸含量均值為1.79 g/100 mL，氨基酸態(tài)氮含量均值為1.08 g/100 mL，全氮含量均值為1.59 g/100 mL，還原糖含量均值為4.45 g/100 mL，醬油品質(zhì)能夠達(dá)到國(guó)標(biāo)中的特級(jí)醬油標(biāo)準(zhǔn)，品質(zhì)優(yōu)良。

為了生產(chǎn)便利，設(shè)定制曲原料總質(zhì)量為Z，將種曲有效接種量?jī)?yōu)選為制曲接種3‰折算后干基孢子數(shù)為100億個(gè)/g的種曲進(jìn)行換算，即制曲接種時(shí)適宜的種曲使用量W=Z×3‰×100÷S（S為使用的種曲的干基孢子數(shù)）。如此，針對(duì)不同培養(yǎng)工藝/不同批次干基孢子數(shù)差異大的種曲，使用時(shí)直接套用上述公式計(jì)算出對(duì)應(yīng)的種曲使用量進(jìn)行接種，就可以確保制曲接入的種曲量不同，但接入的孢子量相同，從而提升了制曲的質(zhì)量與穩(wěn)定性，為不同培養(yǎng)工藝的種曲與同工藝孢子數(shù)差異較大的不同批次種曲在企業(yè)大生產(chǎn)中的種曲接種量控制提供了一種參考方案。