差異過(guò)篩法體外分離培養(yǎng)原代大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞及其鑒定*

劉海琴， 張帆， 李柏霖， 唐元瑜△

差異過(guò)篩法體外分離培養(yǎng)原代大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞及其鑒定*

劉海琴1， 張帆2， 李柏霖3， 唐元瑜3△

（1海軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院上海長(zhǎng)征醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，上海 200003；2福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院，福建 福州 350122；3福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122）

采用差異過(guò)篩法培養(yǎng)純度高、活性好的原代大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（BMECs）。取4周齡SD大鼠腦皮質(zhì)，經(jīng)剪碎、細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾、收集網(wǎng)下濾過(guò)物、II型膠原酶消化后，置于CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代培養(yǎng)。通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、血管性血友病因子（vWF）免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定所培養(yǎng)的目的細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后血管段周?chē)莱龆趟笮蔚募?xì)胞；48 h后島嶼狀的細(xì)胞集落形成；72 h后細(xì)胞鋪滿瓶底，呈典型的單層、鋪路石樣、鑲嵌式貼壁生長(zhǎng)；免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，所培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)棕紅色，vWF表達(dá)為陽(yáng)性。差異過(guò)篩法能夠成功分離培養(yǎng)出原代大鼠BMECs。

腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞；原代培養(yǎng)；差異過(guò)篩法；血管性血友病因子；大鼠

腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（brain microvascular endothelial cells， BMECs），不僅是構(gòu)成血腦屏障的細(xì)胞組份之一，而且還是體內(nèi)重要的內(nèi)分泌和代謝器官［1］。它在維持腦血管的通透性、調(diào)節(jié)腦組織與血液間的物質(zhì)交換、平衡血液凝固纖溶系統(tǒng)、合成和分泌與血管平滑肌舒張/收縮相關(guān)的細(xì)胞因子以及調(diào)控免疫應(yīng)答與炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，是開(kāi)展腦卒中、阿爾茨海默病等神經(jīng)系統(tǒng)病變和構(gòu)建血腦屏障的重要載體和工具細(xì)胞［2-3］。

目前國(guó)內(nèi)外尚未報(bào)道建株成功的大鼠BMECs，研究者只能從原代培養(yǎng)入手開(kāi)展相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。自Panula等［4］首次成功分離培養(yǎng)出大鼠BMECs以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者多以物理過(guò)篩法［5-6］、化學(xué)酶消化法［7-8］和組織塊法［9-10］進(jìn)行BMECs的培養(yǎng)。其中，化學(xué)酶消化法因操作繁瑣、需要使用昂貴的膠原酶/分散酶，常導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)成本偏高，并且化學(xué)酶的作用時(shí)間也較難把握；組織塊法則存在組織塊不易貼壁、易受雜細(xì)胞污染等弊端；而物理過(guò)篩法也常因篩網(wǎng)質(zhì)量、操作手法等不同而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果缺乏穩(wěn)定性，差異性較大，重復(fù)性較差。針對(duì)以上不足，本課題組參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，結(jié)合有限課題經(jīng)費(fèi)，積極改良和優(yōu)化BMECs的原代培養(yǎng)方法，采用實(shí)驗(yàn)成本較低的差異過(guò)篩法成功培養(yǎng)出了數(shù)量足夠、活性較好、純度較高的大鼠BMECs?，F(xiàn)將相關(guān)結(jié)果報(bào)道如下。

材料和方法

1　動(dòng)物

SPF級(jí)4周齡的Sprague-Dawley大鼠4只，雌雄不拘，購(gòu)自上海斯萊克動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為SCXK（閩）2022-0004。

2　主要試劑

胎牛血清和M199培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco；肝素購(gòu)自南京新百藥業(yè)有限公司；II型膠原酶購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)公司；Trition X-100購(gòu)自Solarbio；兔抗大鼠血管性血友病因子（von Willebrand factor， vWF）抗體購(gòu)自北京博奧森生物科技公司；生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG、鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（streptavidin-biotin complex， SABC）細(xì)胞免疫組化試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine， DAB）試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物公司。

3　實(shí)驗(yàn)方法

3.1大鼠BMECs的原代培養(yǎng)選取4周齡SD大鼠4只，予75％酒精浸泡消毒、斷頸處死后，剪開(kāi)顱骨，用無(wú)菌眼科鑷取出大腦皮質(zhì)。在玻璃培養(yǎng)皿中去除腦干、小腦及皮質(zhì)表面的軟腦膜、大血管等。用眼科剪把大腦皮質(zhì)剪碎成大小約1mm×1 mm×1 mm的組織小塊，并將其轉(zhuǎn)移至孔徑為150 μm的細(xì)胞篩網(wǎng)上過(guò)濾，所得濾液再通過(guò)75 μm細(xì)胞篩網(wǎng)，收集網(wǎng)下濾液至15 mL錐底離心管內(nèi)；500×離心5 min，棄上清，向沉淀中加入5 mL 0.1％ II型膠原酶，37 ℃水浴震搖消化15～20 min；PBS液漂洗消化后的沉淀物，予M199完全培養(yǎng)液4 mL吹打混勻重懸，接種于50 mL Nunc培養(yǎng)瓶中，并將其靜置于37 ℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中，每隔24 h換液1次。

3.2大鼠BMECs的形態(tài)學(xué)觀察將培養(yǎng)有BMECs的培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)、貼壁、出芽及融合等生長(zhǎng)狀況，并拍照記錄。

3.3大鼠BMECs中vWF免疫細(xì)胞化學(xué)染色接種于培養(yǎng)皿中的BMECs增殖生長(zhǎng)接近80%融合度時(shí)，用PBS漂洗5 min×3次，繼而滴加預(yù)冷的4％多聚甲醛，常溫固定細(xì)胞15 min；PBS漂洗5 min×3次，滴加0.3% Triton X-100常溫透膜溶脂15 min；PBS漂洗5 min×3次，滴加5%牛血清白蛋白室溫封閉非特異性抗原20 min；甩棄封閉液，滴加1∶300稀釋的兔抗大鼠vWF多克隆抗體，置于濕盒中4 ℃過(guò)夜；PBS漂洗5 min×3次，滴加羊抗兔IgG（Ⅱ抗），37 ℃孵育30 min；PBS漂洗5 min×3次，滴加SABC，37 ℃孵育30 min；PBS漂洗5 min×3次，DAB室溫顯色2 min；PBS再次漂洗后，置于倒置顯微鏡下觀察并拍照。

結(jié)果

1　大鼠BMECs形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)，接種于培養(yǎng)瓶中的腦微血管段呈長(zhǎng)短不一的單枝短棍狀，或收縮折疊成串珠樣（圖1）。培養(yǎng)24 h后，血管段呈“蜈蚣樣”出芽生長(zhǎng)，在其周?chē)莱龆趟笮位蚨嘟切蔚膬?nèi)皮樣細(xì)胞（圖2A～C）；48 h后可見(jiàn)島嶼狀或團(tuán)簇樣分布的細(xì)胞集落形成（圖2D～F）。72 h后集落逐漸融合（圖3A～C），細(xì)胞鋪滿瓶底，呈典型的單層鵝卵石樣鑲嵌式貼壁生長(zhǎng)（圖3D～F）。

Figure 1.　Observation of primary rat brain tissues and brain microvascular segments. A： appearance of SD rat brain tissues； B and C： the cerebral microvascular segments appeared as short sticks. Scale bar=50 mm （A）， 200 μm （B） or 100 μm （C）.

Figure 2.　"Budding" and island-like cell clusters of brain microvascular cells. A， B and C： after 24 h， the vascular segment grew， with short spindle-shaped cells crawling out； D， E and F： after 48 h， cell colonies were gradually formed. Scale bar=200 μm （A， B， D， E and F） or 100 μm （C）.

Figure 3.　Fusion and spreading of cell clusters with an island-like shape. A， B and C： cell colonies gradually fused； D， E and F： after 72 h， the cells exhibited a cobblestone-like arrangement， and covered the bottom of the bottle in an inlaid pattern. Scale bar=200 μm （A to E） or 100 μm （F）.

2　大鼠BMECs中vWF免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果

采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)vWF，鏡下可見(jiàn)胞質(zhì)淡染成棕紅色，陽(yáng)性細(xì)胞率達(dá)99%以上（圖4A、B）；蘇木素襯染胞核，顯示為藍(lán)色（圖4C）。

Figure 4.　Expression of von Willebrand factor （vWF） detected by immunocytochemical staining. Brownish yellow staining in the cytoplasm indicated positive vWF expression （A to C）， while hematoxylin staining （blue） indicated the nuclei （C）. Scale bar=100 μm （A） or 50 μm （B and C）.

討論

差異過(guò)篩法的基本原理是使大腦皮質(zhì)先后通過(guò)兩種孔徑大小不同的細(xì)胞篩網(wǎng)，以去除大的神經(jīng)組織塊和大血管等，避免后續(xù)原代培養(yǎng)工作中出現(xiàn)神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、血細(xì)胞等雜細(xì)胞污染，并可減少消化時(shí)使用的昂貴膠原酶的用量，以縮短消化時(shí)間，提高消化效率，最終高效地獲得純度較高、數(shù)量足夠的BMECs。因其操作簡(jiǎn)單、污染機(jī)率小、實(shí)驗(yàn)成本低，不需要使用高速離心機(jī)和昂貴的白蛋白分離液，即可獲得純度較高的BMECs，是近年來(lái)深受廣大研究者喜歡的體外分離原代BMECs的常用方法之一。

選擇合適孔徑大小的細(xì)胞篩網(wǎng)是實(shí)施差異過(guò)篩法體外培養(yǎng)大鼠BMECs的關(guān)鍵，因?yàn)樗婕霸鶥MECs培養(yǎng)后期目的細(xì)胞的純化問(wèn)題。而細(xì)胞篩網(wǎng)的孔徑大小與其目數(shù)相關(guān)。一般而言，篩網(wǎng)孔徑（μm）=15 000/目數(shù)，如常用的100目篩網(wǎng)，其孔徑為150 μm，200目篩網(wǎng)孔徑則為75 μm。細(xì)胞篩網(wǎng)是目前分選管徑大小不同的腦微血管進(jìn)行體外培養(yǎng)BMECs的簡(jiǎn)易工具之一。

微血管是構(gòu)成腦微循環(huán)的基本結(jié)構(gòu)單位之一，包括微動(dòng)脈、微靜脈和真毛細(xì)血管［11］。其中，微動(dòng)脈管徑較小，僅為7～9 μm，微靜脈管徑較大，為40～150 μm，真毛細(xì)血管則為20～30 μm。在進(jìn)行體外組織細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，微血管的管徑越趨于粗大，其周?chē)霈F(xiàn)平滑肌細(xì)胞的可能性也就越大。實(shí)驗(yàn)研究表明，在149 μm篩網(wǎng)上收集到的較粗大微血管段所培養(yǎng)出的細(xì)胞，經(jīng)倒置顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、透射電鏡對(duì)Weibel-Palade小體和細(xì)胞器的觀測(cè)，以及vWF免疫細(xì)胞化學(xué)染色的檢測(cè)，其鑒定結(jié)果多為平滑肌細(xì)胞［12-13］。所以，原代BMECs的培養(yǎng)應(yīng)盡量選用孔徑小的細(xì)胞篩網(wǎng)以獲得管徑較小的微血管段，這樣可達(dá)到減少血管平滑肌細(xì)胞污染、提高BMECs純度的目的。

早在上世紀(jì)70年代，研究者采用微孔過(guò)濾法首次獲得并觀察到大鼠腦微血管的直徑在300 μm以下［14］。而在培養(yǎng)原代大鼠BMECs時(shí)，若采用200目和250目?jī)煞N孔徑不同的篩網(wǎng)連續(xù)過(guò)濾腦組織，可獲得管徑為61～74 μm的微血管段［5］；采用100目和200目雙層篩網(wǎng)，則可獲得75～150 μm的微血管段［15-16］。這種不同孔徑的連續(xù)過(guò)篩法比僅使用單層篩網(wǎng)過(guò)濾的效果好，它既能除去較大組織塊和大血管段，又能達(dá)到收集微血管段的目的［17］。而本課題組所采用的連續(xù)差異過(guò)篩法，雖然篩網(wǎng)仍然選用的是孔徑為150和75 μm的雙層篩網(wǎng)，但我們探索出的是完全不同于以往研究者使用的過(guò)篩方法，即通過(guò)收集75 μm篩網(wǎng)以下的濾液，確保了獲得的是管徑更為細(xì)小的微血管段，并且體會(huì)到：在濾液通過(guò)最后一道75 μm篩網(wǎng)時(shí)，可適度左右傾斜、晃動(dòng)篩網(wǎng)，盡量讓濾液因其重力而自由濾下，宜避免施加外力，過(guò)度沖洗，以防止篩網(wǎng)上的大血管順勢(shì)流下，進(jìn)入到75 μm篩網(wǎng)下的濾液中；同時(shí)適當(dāng)增加過(guò)篩面積，避免篩網(wǎng)網(wǎng)眼堵塞，以提高微血管的濾過(guò)率。最后，細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和vWF免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果提示，所培養(yǎng)的目的細(xì)胞形態(tài)勻質(zhì)性較高，雜細(xì)胞污染較少，BMECs純度較高，陽(yáng)性細(xì)胞率高達(dá)99％以上。

總之，本課題組采用差異過(guò)篩法，將剪碎的腦組織先后依次通過(guò)150和75 μm篩網(wǎng)，最后收集網(wǎng)下濾液，從而分離出了管徑更為細(xì)小的微血管，所培養(yǎng)的目的細(xì)胞勻質(zhì)性更高，很好地解決了原代BMECs的細(xì)胞純化問(wèn)題，成功建立了一種操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性強(qiáng)，可培養(yǎng)出純度高、活力強(qiáng)的原代大鼠BMECs的培養(yǎng)方法，這亦為體外血腦屏障的建立及腦血管疾病的研究奠定了重要的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Utilizing differential sieving method for culturing primary rat brain microvascular endothelial cells

LIU Haiqin1， ZHANG Fan2， Li BoLin3， TANG Yuanyu3△

（1，，，200003，；2，，350122，；3，，350122，）

To establish a method for isolating and culturing primary rat brain microvascular endothelial cells （BMECs） with high purity using the differential sieving technique.Brain tissue from 4-week-old SD rats was minced， passed through a cell strainer， and digested with type II collagenase to obtain brain microvascular segments， which were then placed in a CO2incubator for primary culture. The cells were identified by morphological observation and immunocytochemical staining for von Willebrand factor （vWF）.After 24 h of culture，short spindle-shaped endothelial cells migrated out from the microvascular segments. Forty-eight hours later， the cells formed island-like colonies. After 72 h， the cells covered the bottom of the container and exhibited a typical cobblestone-like pattern. Immunocytochemical staining for vWF showed brownish-red cytoplasm， indicating positive expression.The differential sieving method can successfully isolate and culture primary rat BMECs with exceptional purity.

brain microvascular endothelial cells； primary culture； differential sieving method； von Willebrand factor； rats

R329.21； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2023.09.024

1000-4718（2023）09-1724-05

2023-05-17

2023-07-02

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No. 81072714）；福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No. 2017J01545）

Tel： 0591-22861152； E-mail： 2422198977@qq.com

（責(zé)任編輯：盧萍，羅森）