基于1H-NMR和16S rDNA測序技術探討針與灸不同刺激方法對大鼠結腸代謝物和腸道菌群的影響*

曹思慧， 陳琳， 何灝龍， 李祖強， 劉瓊， 劉密

基于1H-NMR和16S rDNA測序技術探討針與灸不同刺激方法對大鼠結腸代謝物和腸道菌群的影響*

曹思慧， 陳琳， 何灝龍， 李祖強， 劉瓊， 劉密△

（湖南中醫(yī)藥大學針灸推拿與康復學院，湖南 長沙 410208）

觀察針刺與艾灸兩種不同干預方法對健康SD大鼠結腸代謝物和腸道菌群調節(jié)作用的差異。將33只健康SD大鼠隨機分為空白組、針刺組和艾灸組，每組各11只?？瞻捉M大鼠仰臥固定在治療臺上，不予任何干預，連續(xù)7 d；針刺組以不銹鋼針灸針針刺大鼠雙側上巨虛穴和天樞穴，留針15 min，連續(xù)干預7 d；艾灸組采用溫和灸，將艾條置于大鼠雙側上巨虛穴和天樞穴上方3～5 cm處，使皮膚溫度維持在（45±5） ℃之間，每次15 min，連續(xù)干預7 d。干預結束后，取各組大鼠結腸組織和糞便樣品，運用質子核磁共振（proton nuclear magnetic resonance，1H-NMR）技術檢測各組大鼠結腸組織代謝物，分析并篩選大鼠結腸組織差異代謝物；16S核糖體DNA（ribosomal DNA， rDNA）測序技術檢測各組大鼠腸道菌群豐度和多樣性的變化情況，并比較差異菌群。代謝組學檢測結果顯示，與空白組相比，針刺組大鼠結腸組織中代謝物組氨酸、纈氨酸和丁酸含量顯著上升（<0.05），艾灸組大鼠結腸組織中代謝物膽堿和肌醇含量顯著上升（<0.05或<0.01）；與針刺組相比，艾灸組大鼠結腸組織中代謝物甲酸和乙酸含量顯著上升（0.05）。菌群多樣性分析顯示，與空白組相比，針刺組和艾灸組大鼠腸道菌群的Chao1指數(shù)和基于豐度的覆蓋估計值（abundance-based coverage estimator， ACE）均顯著上升（<0.05）；在菌群門和屬水平上，針、灸干預后部分有益菌豐度上升，部分條件致病菌豐度下降。針刺與艾灸兩種不同干預方法對健康SD大鼠結腸代謝物和腸道菌群的調節(jié)存在差異性：針刺更擅長調節(jié)酸類代謝失衡所導致的胃腸道疾病，艾灸更適用于脂質代謝異常引發(fā)的代謝類疾?。会槾膛c艾灸對腸內微生態(tài)環(huán)境具有良性調節(jié)作用；針刺能通過影響腸道菌群的結構和豐度緩解胃腸道疾病。

針灸；代謝組學；腸道菌群；質子核磁共振；16S核糖體DNA測序

針刺與艾灸均屬于中醫(yī)外治療法，臨床一般并稱為“針灸”，二者均以中醫(yī)基礎理論和經絡腧穴理論為指導，既獨立又統(tǒng)一，相輔相成。針刺通過將針具針體刺入皮膚，施以不同補瀉手法，對相應穴區(qū)組織產生機械刺激而發(fā)揮作用［1］；艾灸則通過用艾條在體表相應腧穴進行熏熨，對穴區(qū)皮膚產生溫熱刺激從而發(fā)揮療效［2］。針刺與艾灸的作用方式和起效機制均存在差異，故二者適應癥不盡相同［3-4］。目前研究者多通過研究疾病動物模型，從炎癥因子和相關蛋白表達量等方面闡述針刺與艾灸之間的差異［5-7］，少見有針灸干預正常健康動物后對其代謝物與腸道菌群的變化差異進行分析比較的研究。

研究顯示，代謝組學能及時靈敏地揭示外界因素刺激下生物機體的整體應答與調節(jié)，闡明干預手段的內在機制［8］，與針灸效應的多層次、多靶點整體特性相吻合。同時，由于腸道菌群廣泛參與了多種疾病的發(fā)展變化，而針灸可以通過調控腸道菌群對多種疾病產生治療作用［9-10］。故本研究采用質子核磁共振（proton nuclear magnetic resonance，1H-NMR）代謝組學和16S核糖體DNA（ribosomal DNA， rDNA）高通量測序技術，以健康SD大鼠為研究對象，觀察針刺與艾灸干預后大鼠結腸代謝產物和腸道菌群的變化，分析針和灸兩種不同刺激方法的作用差異，以期為臨床選擇合適的治療手段提供參考資料。

材料和方法

1　動物

SPF級7周齡雄性SD大鼠33只，體重150～180 g，由廈門大學動物實驗室提供。質量檢測單位：中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，實驗單位許可證編號：SYXK（閩）2013-0006，質量合格證碼：SCXK（京）2014-0004。實驗室溫度維持在23～26 oC，濕度50％～70%。適應性喂養(yǎng)7 d后隨機標號分為3組（空白組、針刺組、艾灸組），每組各11只。實驗進行過程中各項操作與處理方式均符合《關于善待實驗動物的指導性意見》規(guī)定。

2　主要試劑及儀器

10%水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司）；QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit試劑盒（Qiangen）；5 mm核磁管（Norell）；Avance III HD 600 MHz核磁共振譜儀（Bruker）；NMR Suite核磁共振光譜處理軟件（Chenomx）；MultiskanTMGO全波長酶標儀（Thermo Scientific）；HiSeq 2500高通量測序儀（Illumia）；0.25 mm×25 mm針灸針（蘇州醫(yī)療用品有限公司）；溫灸純艾條（長沙艾醫(yī)生物科技公司）。

3　處理方法

3.1腧穴選擇與定位選擇大鼠雙側上巨虛穴與天樞穴，穴位參照文獻定位［11-12］。天樞穴：位于大鼠胸劍聯(lián)合下40 mm，前正中線旁開5 mm，腹直肌及其鞘處；上巨虛穴：位于大鼠膝關節(jié)外下方腓骨小頭下約10 mm處，足三里穴向下約5 mm處。

3.2干預方法33只SD大鼠適應性喂養(yǎng)7 d后隨機分為3組，每組11只，正常喂養(yǎng)。干預方法參考文獻［13-14］方案。（1）空白組：正常飲食，與針刺組和艾灸組大鼠于相同時間進行抓取捆綁，固定于鼠板上，不予以任何干預與治療，連續(xù)7 d。（2）針刺組：正常飲食，抓取捆綁，固定于鼠板上。穴區(qū)消毒后用毫針（0.25 mm×25 mm）垂直刺入天樞穴和上巨虛穴3～5 mm，行捻轉手法20 s后留針15 min，連續(xù)7 d。（3）艾灸組：正常飲食，抓取捆綁，固定于鼠板上，穴區(qū)消毒后點燃艾條置于天樞穴與上巨虛穴上方約3～5 cm處15 min，置一直徑約5 mm的有孔隔熱材料于穴位表面，灸時用體表溫度傳感器測定皮膚溫度，使溫度保持在（45±5） ℃之間，連續(xù)7 d。

4　觀察指標及檢測方法

4.1大鼠體重及進食量監(jiān)測參照文獻［15］方法，于干預結束后1 d（上午9：00）使用精密電子秤稱量大鼠體重2次，取2次測量的平均值作為大鼠最終體重；于干預前1 d和干預結束前1 d的同一時間（上午9：00），以每只大鼠50 g飼料的標準投放飼料，次日稱量剩余飼料重量，計算大鼠24 h的進食量。

4.2核磁樣本制備、檢測與數(shù)據(jù)處理將大鼠固定在鼠板上，用10%水合氯醛（0.5 mL/100 g）腹腔注射進行麻醉。剖開腹腔，采集約1.0 cm×0.5 cm大小的結腸組織作為標本，用生理鹽水沖洗后置于-80 ℃冰箱中保存。參考文獻［16-17］方法：取（100±50） mg結腸組織，按4 mL/g比例加入冰甲醇中，0 ℃條件下組織勻漿機勻漿1 min；再按4 mLg和2.85ml/g的比例分別加入甲醇和雙蒸水中，勻漿1 min，渦旋1 min充分提?。混o置于冰上15 min后，用2 mL離心管于4 ℃、16 873×離心15 min。取上清液0.5 mL轉移至新的離心管中，經氮吹儀濃縮去除甲醇。待樣品完全干燥后，溶于D2O（內含0.015%總懸浮顆粒物）600 μL并充分混勻，取上清液550 μL移入5 mm核磁管中，使用Avance III HD 600 MHz核磁共振譜儀和1D NOESYGPPRLD譜脈沖序列（Bruker Biospin Pulse Program Library）采集1H-NMR數(shù)據(jù)。

運用MestReNova軟件對代謝物譜峰進行基線校正，SIMCA-P 14.1軟件進行多元統(tǒng)計分析。采用Pareto Scaling法進行歸一化及常用對數(shù)轉化，首先采用主成分分析（principal component analysis， PCA）對不同組別進行可視化組間分離，后用偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis， PLS-DA）最大化組間差異，進行代謝模式識別并找尋差異代謝物，得到得分圖（score plot）、載荷圖（loading plot）與VIP（variable importance in projection）圖。交叉驗證（cross-validation， CV）檢驗模型質量，默認PLS-DA模型中VIP值>1且<0.05的代謝物為差異有統(tǒng)計學意義。相關代謝通路信息主要源于HMDB和KEGG數(shù)據(jù)庫。

4.3糞便樣本制備、檢測與數(shù)據(jù)處理參考文獻［18］方法：干預結束次日使用無菌EP管采集各組大鼠糞便，置于-80 ℃冰箱保存。取大鼠糞便約200 mg，按照DNA提取試劑盒說明書提取糞便菌群總基因組DNA并檢測濃度、純度及完整性。采用341F和806R引物對16S rDNA的V3～V4區(qū)進行擴增、純度檢測及熒光定量。后用Illumina建庫策略進行16S建庫，Qubit 3.0熒光定量儀對文庫濃度進行初步定量、稀釋，最后使用qPCR方法對文庫有效濃度進行精確定量。文庫檢測合格后，使用高通量測序平臺（HiSeq）進行測序。對得到原始數(shù)據(jù)進行質控、過濾、拼接，按照97％的相似性閾值對非重復性序列進行劃分，得到不同的操作單元（operational taxonomic unit， OTU）聚類，對OTU聚類與注釋結果進行統(tǒng)計，最后基于OTU豐度表進行α多樣性分析、β多樣性分析和物種LEfSe差異分析。

5　統(tǒng)計學分析

采用SPSS 25.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。若符合正態(tài)分布及方差齊性，則數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，組間均數(shù)比較使用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著差異（least significant difference， LSD）法；若不符合方差齊性，則用Dunnet T3分析；若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則數(shù)據(jù)以中位數(shù)表示，組間差異比較采用秩和檢驗。以<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1　各組大鼠體重和進食量比較

與空白組相比，針刺組和艾灸組大鼠干預前后進食量和干預后體重的差異均無統(tǒng)計學顯著性（>0.05），見圖1。

Figure 1.　Comparison of food intake before and after intervention （A） and body weight after intervention （B） of the rats in each group. E： blank group； F： acupuncture group； G： moxibustion group. Mean±SD. n=11.

2　代謝組學分析

2.1空白組與針刺組大鼠結腸組織代謝物的比較空白組與針刺組大鼠結腸組織樣本PCA得分圖結果顯示，兩組樣本不能進行直觀的組間分離。進一步對兩組樣本數(shù)據(jù)進行PLS-DA建模差異最大化分析。PLS-DA載荷圖顯示，組氨酸、丁酸鹽等多個代謝物對兩組樣本的區(qū)分有較高貢獻率。篩選出VIP值>1且<0.05的代謝物，結果顯示，與空白組相比，針刺組大鼠結腸組織中代謝物尿嘧啶和蘇氨酸的含量均顯著下降（<0.05或<0.01），組氨酸、纈氨酸和丁酸鹽的含量均顯著上升（<0.05）。見圖2及表1。

Figure 2.　Diagram of colonic tissue metabolism patterns in blank group （E） and acupuncture group （F）. A： principal component analysis （PCA） score chart； B： partial least squares discriminant analysis （PLS-DA） score chart； C： variable importance in projection （VIP） value diagram in PLS-DA mode； D： PLS-DA loading diagram. n=11.

表1　空白組與針刺組結腸組織差異代謝物比較

*<0.05，**<0.01blank group； ↑： increaseblank group； ↓： decreaseblank group.

2.2空白組與艾灸組大鼠結腸組織代謝物的比較空白組與艾灸組大鼠結腸組織樣本PCA得分圖顯示，兩組樣本代謝模式有分離趨勢。PLS-DA載荷圖顯示，醋酸鹽、膽堿等多個代謝物對兩組樣本間的區(qū)分有較高貢獻率。篩選VIP值>1且<0.05的代謝物，結果顯示，與空白組相比，艾灸組大鼠結腸組織中代謝物乳酸、甘氨酸和絲氨酸的含量均顯著下降（<0.05或<0.01），膽堿和肌醇的含量均顯著上升（<0.05或<0.01）。見圖3及表2。

Figure 3.　Diagram of colonic tissue metabolism patterns in blank group （E） and moxibustion group （G）. A： principal component analysis （PCA） score chart； B： partial least squares discriminant analysis （PLS-DA） score chart； C： variable importance in projection （VIP） value diagram in PLS-DA mode； D： PLS-DA loading diagram. n=11.

表2　空白組與艾灸組結腸組織差異代謝物比較

*<0.05，**<0.05blank group； ↑： increaseblank group； ↓： decreaseblank group.

2.3針刺組與艾灸組大鼠結腸組織代謝物的比較針刺組與艾灸組大鼠結腸組織樣本PCA得分圖顯示，兩組樣本代謝模式無法進行直觀的組間區(qū)分。進一步進行PLS-DA分析，結果顯示組間區(qū)分明確。PLS-DA載荷圖顯示，組氨酸、丁酸鹽等多個代謝物對樣本間的區(qū)分有較高貢獻率。進一步篩選VIP值>1且<0.05的代謝物，結果顯示，與針刺組相比，艾灸組大鼠結腸組織中代謝物膽堿和甘油膽堿磷酸的含量均顯著下降（<0.05或<0.01），甲酸和乙酸的含量均顯著上升（<0.05）。見圖4及表3。

Figure 4.　Diagram of colonic tissue metabolism patterns in acupuncture group （F） and moxibustion group （G）. A： principal component analysis （PCA） score chart； B： partial least squares discriminant analysis （PLS-DA） score chart； C： variable importance in projection （VIP） value diagram in PLS-DA mode； D： PLS-DA loading diagram. n=11.

表3　針刺組與艾灸組結腸組織差異代謝物比較

*<0.05，**<0.01acupuncture group； ↑： increaseacupuncture group； ↓： decreaseacupuncture group.

2.4差異性代謝物的代謝通路分析采用MetaboAnalyst 5.0軟件并結合KEGG數(shù)據(jù)庫對差異代謝物進行代謝通路分析。（1）空白組-針刺組：與空白組相比，針刺組大鼠結腸組織發(fā)生變化的主要代謝為：甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，以及?；撬岷蛠喤；撬岽x，見圖5A。（2）空白組-艾灸組：與空白組相比，艾灸組大鼠結腸組織發(fā)生變化的主要代謝為：甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，以及甘油磷脂代謝，見圖5B。（3）針刺組-艾灸組：與艾灸組相比，針刺組大鼠結腸組織發(fā)生變化的主要代謝通路為：甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，?；撬岷蛠喤；撬岽x，以及甘油磷脂代謝，見圖5C。

Figure 5.　Metabolite-related metabolic pathways changing in colon tissues of the rats in each group. A： blank group and acupuncture group； B： blank group and moxibustion group； C： acupuncture group and moxibustion group.

3　腸道菌群結果分析

3.1OTU Venn圖分析如圖6所示，空白組、針刺組和艾灸組的OTU總數(shù)分別為1 382、1 837和1 591，空白組、針刺組和艾灸組特有的OTU數(shù)分別為256、532和383。從整體上看，與空白組相比，針刺和艾灸干預后大鼠部分腸道菌群豐度顯著上升（<0.05）。

Figure 6.　Venn diagram of operational taxonomic unit （OTU） number of intestinal flora in the rats of each group. E： blank group； F： acupuncture group； G： moxibustion group.

3.2α多樣性分析Chao1指數(shù)和基于豐度的覆蓋估計值（abundance-based coverage estimator， ACE）是菌群α多樣性分析的常用指標［19］，二者的值越大代表群落豐富度越高。本實驗中，與空白組相比，針刺組和艾灸組大鼠腸道菌群Chao1指數(shù)和ACE均顯著上升（<0.05），見圖7。

Figure 7.　Comparison of intestinal flora abundance index and diversity index of the rats in each group. A： Chao1 index； B： abundance-based coverage estimator （ACE）. E： blank group； F： acupuncture group； G： moxibustion group.

3.3β多樣性分析β多樣性分析通過分析各類菌群在樣品中的含量，計算出不同樣品間的多樣性值，進而對不同菌群的結構進行比較。在主坐標分析（principal coordinates analysis， PCoA）主成分（principal component， PC）圖中，每一個點代表一個樣本，不同顏色表示不同組別，點與點的距離與樣本相似性成正比。如圖8所示，橫坐標PC1的貢獻率為10.014%，縱坐標PC2的貢獻率為8.343%，3組樣品可以較好區(qū)分，針刺組與空白組腸道菌群構成區(qū)分更顯著。

Figure 8.　The principal coordinates analysis （PCoA） score plot of intestinal flora β diversity of the rats in each group. E： blank group； F： acupuncture group； G： moxibustion group.

3.4門水平和屬水平比較對各組大鼠腸道菌群門水平的相對豐度進行統(tǒng)計（圖9），最主要的為厚壁菌門（）、變形桿菌門（）、擬桿菌門（）、綠彎菌門（）、放線菌門（）、酸桿菌門（）、軟壁菌門（）、疣微菌門（）、P_TM7、芽單胞菌門（）、藍藻菌門（）等。其中，與空白組相比，針刺干預后放線菌門、綠彎菌門、酸桿菌門和芽單胞菌門相對豐度均顯著上升（<0.05），P_TM7和厚壁菌門則顯著下降（<0.05）；艾灸干預后變形桿菌門、綠彎菌門、放線菌門、酸桿菌門、軟壁菌門、疣微菌門、P_TM7、芽單胞菌門和藍藻菌門相對豐度的變化差異無統(tǒng)計學意義（>0.05），但有上調趨勢。

Figure 9.　Comparison of phylum-level composition of intestinal flora in the rats of each group.

在屬水平上（圖10），相對豐度較高的菌屬種類主要包括乳酸桿菌屬（）、鞘氨醇單胞菌屬（）、巴氏桿菌科（）、普雷沃菌屬（）、韋榮球菌屬（）、聚集桿菌屬（）、梭菌屬（）、消化鏈球菌（）、S24-7、羅斯氏菌屬（）、支原體（）等。其中，與空白組相比，針刺干預后鞘氨醇單胞菌屬和韋榮球菌屬相對豐度顯著上升（<0.05），巴氏桿菌科、普雷沃菌屬、聚集桿菌屬、梭菌科、消化鏈球菌科、S24-7和羅斯氏菌呈上調趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（>0.05），乳酸桿菌屬和支原體呈現(xiàn)下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（>0.05）；艾灸干預后乳酸桿菌屬、梭菌科和支原體略有下降，其余均有上調趨勢，但差異均無統(tǒng)計學意義（>0.05）。

Figure 10.　Comparison of genus-level composition of intestinal flora in the rats of each group.

3.5物種差異分析LEfSe分析即運用線性判別分析（linear discriminant analysis， LDA）進行多個分組間的比較，找到不同樣本產生顯著性差異影響的菌群。LDA值得分圖展示的是有顯著差異的菌群種類，柱狀圖的長度代表顯著差異物種的影響大小。如圖11、12所示，3組大鼠均有差異菌屬?？瞻捉M優(yōu)勢菌種為厚壁菌門（）、屬、布魯氏菌科（）等；針刺組優(yōu)勢菌種有變形桿菌門（）、綠彎菌門（）、酸桿菌門（）、芽單胞菌門（）等；艾灸組為孤島桿菌屬（）、微小微單胞菌屬（）、孿生菌科（）等。

Figure 11.　Linear discriminant analysis （LDA） score map of intestinal flora with significant differences of the rats in each group.

Figure 12.　Evolution relationship diagram of significantly differential bacterial communities in rat feces. E： blank group； F： acupuncture group； G： moxibustion group.

討論

針刺屬于機械刺激，表現(xiàn)為生物力學作用；艾灸屬于溫熱刺激，表現(xiàn)為生物熱傳導效應。針灸防治疾病的起效機制是多層次、多靶點的復雜網絡關系［20］。1H-NMR代謝組學技術能對生物體內的代謝物進行鑒定和量化［21-22］，分析疾病發(fā)生發(fā)展的過程或闡明干預措施的內在機制［23］，因此對針灸作用機制的研究，需要代謝組學技術的支持。此外，針灸能通過調節(jié)腸道菌群而對多種疾病產生治療作用［24-27］。以往對針灸作用機制的研究，多以某一疾病動物模型為觀察對象。因此，以無疾病、健康大鼠為觀察對象，通過分析各組大鼠結腸差異代謝物和腸道菌群的結構變化來探討針刺與艾灸的作用差異是本實驗的特色。

在本實驗中，針刺和艾灸干預后3組大鼠組間體重比較和干預前后攝食量比較均無顯著差異，針刺和艾灸干預并未對健康大鼠正常飲食造成影響。1H-NMR代謝組學結果顯示，針刺和艾灸干預均引起了大鼠結腸組織代謝模式的變化，說明在大鼠天樞穴和上巨虛穴進行針灸干預后，大鼠機體產生了與結腸代謝相關的生物學效應，這與中醫(yī)學《靈樞》中所說的“夫十二經脈者，內屬于臟腑，外絡于肢節(jié)”一致，即體表經穴所接收的刺激能影響內在臟腑的生理功能［28］。

本實驗結果顯示，與空白組相比，針刺組大鼠結腸組織代謝模式的改變主要表現(xiàn)為丁酸鹽和組氨酸代謝，以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成。丁酸鹽屬于短鏈不飽和肪酸，在維持腸上皮細胞完整性、抑制腸道炎癥等方面具有重要的作用［29-31］，同時還能促進腸道黏液分泌和上皮屏障形成，進而降低致病菌及代謝產物對人體的不良影響［32］。組氨酸可降低胃酸濃度并抑制植物神經緊張而引起的消化道潰爛［33］。纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸三者作為支鏈氨基酸，對促進腸道發(fā)育和氨基酸轉運有重要作用［34-35］。由此筆者合理推斷，針刺可能通過影響與胃腸道疾病相關的代謝產物，如丁酸鹽和組氨酸等，從而對胃腸道疾病產生治療作用。與空白組相比，艾灸組大鼠結腸組織代謝模式的改變主要為膽堿、肌醇和甘油磷脂代謝。膽堿是動物生長所必需的營養(yǎng)素，能作為神經遞質維持基本的神經信號傳遞［36］。研究顯示，膽堿可有效提高肝臟脂肪代謝的效率，對脂肪的合成、氧化以及轉運具有調控作用［37-38］，能顯著降低肝臟脂肪沉積并輔助體內脂肪的再分配、促進脂肪代謝［39-40］，這與本單位以往的研究［41-42］結果一致。這說明艾灸對與脂質代謝類疾病相關的代謝產物（如膽堿和肌醇等）的調節(jié)，是治療高脂血癥、高膽固醇癥等疾病的作用機制之一。

腸道菌群是人體最大的微生態(tài)系統(tǒng)，能與宿主互利共生［43］。在本實驗中，與空白組相比，針刺組和艾灸組大鼠在針、灸干預后，腸道菌群組成的豐度顯著升高，說明針灸對維持腸道微生態(tài)的平衡具有積極的影響作用，與以往研究［15］結果一致。既往研究顯示，放線菌門包含了許多有益菌屬，如雙歧桿菌屬［44］，能在人體腸道內形成益生菌環(huán)境并改善消化問題［45］。雙歧桿菌所產生的乳酸還可以被霍式真桿菌利用轉化為丁酸鹽［46］，前文闡述了丁酸鹽是腸道免疫調節(jié)和抗炎的重要參與者。此外，綠彎菌門與一些腸道疾病（如炎癥性腸?。┯嘘P，但具體的機制還需進一步研究［47-48］。也有研究表明，酸桿菌門也是腸道疾病的重要影響因素，腸道炎性疾病患者腸道中酸桿菌門的數(shù)量顯著減少［49-50］。在本實驗中，針刺干預后放線菌門、綠彎菌門和酸桿菌門均顯著增加。由此推測，針刺可以通過調節(jié)以上菌群，對胃腸道功能發(fā)揮調節(jié)作用。而艾灸干預后綠彎菌門、放線菌門、酸桿菌門、軟壁菌門、疣微菌門等雖有上調趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義，這可能與本次實驗的樣本量較少（=11）有關。β多樣性分析結果顯示，空白組與艾灸組樣本相似度高、差異較小，而與針刺組樣本相對差異較大，提示短期（7 d）內在健康生理情況下，對天樞穴和上巨虛穴進行針刺刺激比進行艾灸刺激對大鼠腸道菌群結構的影響更大，調節(jié)作用更快，但具體機制還需進一步研究。

綜上所述，針刺與艾灸兩種干預方法存在一定差異：針刺可能擅長通過調節(jié)酸類代謝物進而治療胃腸道疾?。话目赡芨m合用于治療脂質代謝異常引發(fā)的代謝性疾病。針、灸干預對腸道微生態(tài)環(huán)境均有積極的調節(jié)作用；針刺在短期內對腸道菌群的調節(jié)作用更快，并可能通過調節(jié)與胃腸功能相關的菌群緩解胃腸道疾病。但本實驗以正常健康大鼠為研究對象，存在一定局限性。后續(xù)研究將引入疾病模型，為臨床實踐提供更多的循證依據(jù)。

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Effects of different stimulation methods, acupuncture and moxibustion, on colonic metabolites and intestinal flora in rats analyzed by1H-NMR and 16S rDNA sequencing

CAO Sihui， CHEN Lin， HE Haolong， LI Zuqiang， LIU Qiong， LIU Mi△

（，，，410208，）

To observe the differences in the regulatory effects of acupuncture and moxibustion on colonic metabolites and gut microbiota in healthy SD rats.A total of 33 healthy SD rats were randomly divided into 3 groups： blank group， acupuncture group， and moxibustion group， with 11 rats in each group. The rats in blank group was placed in a supine position on the treatment table without interventions for 7 consecutive days. In acupuncture group， stainless steel acupuncture needles were used to puncture bilateral Shangjuxu and Tianshu points， which was retained for 15 min， and the intervention was performed for 7 consecutive days. In moxibustion group， mild moxibustion was applied by placing moxa sticks on both sides of Shangjuxu and Tianshu points， approximately 3～5 cm above the skin. The skin temperature was maintained at （45±5） ℃ for 15 min during each session， and the intervention continued for 7 days. After collecting colon tissues and fecal samples from the rats in each group， proton nuclear magnetic resonance （1H-NMR） technology was utilized to detect the metabolites in colon tissues， and the differential metabolites were screened and identified. Additionally， the abundance and diversity characteristics of intestinal flora， including differential flora， were examined by 16S ribosomal DNA （rDNA） sequencing.The results of metabolomics detection revealed that the levels of histidine， valine and butyric acid in the colons of rats in acupuncture group were significantly higher than those in blank group （<0.05）. Additionally， the levels of choline and inositol in the colons of rats in moxibustion group showed significant increases （<0.01 or<0.05）. Furthermore， there was a significant increase in the levels of formic acid and acetic acid in the colons of rats in moxibustion group compared with acupuncture group （<0.05）. The analysis of the diversity of intestinal flora showed that the Chao1 index and abundance-based coverage estimator （ACE） of the intestinal flora in acupuncture group and moxibustion group were significantly increased compared with blank group （<0.05）. At the phylum and genus levels， the abundance levels of some beneficial bacteria increased， while the abundance levels of some conditional pathogenic bacteria decreased.Acupuncture and moxibustion have different effects on the regulation of colonic metabolites and gut microbiota in healthy SD rats. Acupuncture is better at regulating gastrointestinal diseases caused by an imbalance of acid metabolism， while moxibustion is more suitable for metabolic diseases caused by abnormal lipid metabolism. Acupuncture and moxibustion have a beneficial regulatory effect on the intestinal microenvironment. Specifically， acupuncture has the potential to improve gastrointestinal diseases by influencing the structure and abundance of gut microbiota.

acupuncture and moxibustion； metabolomics； intestinal flora； proton nuclear magnetic resonance； 16S ribosomal DNA sequencing

R245； R363.2； R333

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2023.09.011

1000-4718（2023）09-1620-14

2023-06-29

2023-08-07

國家自然科學基金資助項目（No. 81774438）；湖南省教育廳資助科研項目（No. 21A0235）；湖南省中醫(yī)藥科研計劃項目（No. C2022027）；湖南省自然科學基金資助項目（No. 2023JJ30457）；長沙市自然科學基金資助項目（No. kq2208183）

Tel： 0731-88458187； E-mail： 7417091@qq.com

（責任編輯：盧萍，羅森）