miR-144-3p/SLC7A11軸通過調(diào)控鐵死亡增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對順鉑的敏感性*

廖鳳兒， 陶瑩， 駱婕， 李筠， 郭琴

miR-144-3p/SLC7A11軸通過調(diào)控鐵死亡增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對順鉑的敏感性*

廖鳳兒， 陶瑩， 駱婕， 李筠， 郭琴△

（廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510062）

探討微小RNA-144-3p（microRNA-144-3p， miR-144-3p）在卵巢癌細(xì)胞對順鉑耐藥中的作用并分析其作用機(jī)制與溶質(zhì)載體家族7成員11（solute carrier family 7 member 11， SLC7A11）和鐵死亡是否有關(guān)。將miR-144-3p mimic轉(zhuǎn)染入耐順鉑人卵巢癌細(xì)胞株A2780/DDP和SKOV3/DDP后，RT-qPCR法檢測miR-144-3p的表達(dá)豐度；CCK-8法檢測細(xì)胞對順鉑的敏感性；集落形成實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞增殖情況；試劑盒法評估細(xì)胞內(nèi)丙二醛（malondialdehyde， MDA）和谷胱甘肽（glutathione， GSH）的水平；Fe2+探針及活性氧簇（reactive oxygen species， ROS）熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)Fe2+含量及ROS水平；透射電子顯微鏡觀察線粒體形態(tài)；雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-144-3p與SLC7A11之間的靶向結(jié)合。建立耐藥細(xì)胞株A2780/DDP異種移植瘤模型，體內(nèi)評估m(xù)iR-144-3p對腫瘤生長的影響。耐藥細(xì)胞株A2780/DDP和SKOV3/DDP中的miR-144-3p表達(dá)顯著低于親本細(xì)胞株A2780和SKOV3（<0.05）。轉(zhuǎn)染miR-144-3p mimic可抑制細(xì)胞增殖，增強(qiáng)耐藥細(xì)胞株對順鉑的敏感性（<0.01）。雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示SLC7A11是miR-144-3p的作用靶點(diǎn)。過表達(dá)SLC7A11可通過鐵死亡途徑逆轉(zhuǎn)miR-144-3p對細(xì)胞增殖及化療敏感性的作用（<0.05）。異種移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-144-3p可顯著抑制瘤體生長，抑制SLC7A11及谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4， GPX4）蛋白表達(dá)（<0.01），提高4-羥基壬烯醛（4-hydroxynonenal， 4-HNE）水平（<0.01）。miR-144-3p通過靶向SLC7A11而增強(qiáng)耐藥卵巢癌細(xì)胞對順鉑的敏感性，其作用機(jī)制可能涉及鐵死亡過程。

微小RNA-144-3p；卵巢癌；順鉑耐藥；鐵死亡；溶質(zhì)載體家族7成員11

卵巢癌是高發(fā)于50歲以上女性的常見生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一；由于早期癥狀不顯著，多數(shù)患者在首診時(shí)已經(jīng)處于中晚期［1］。鉑類藥物為主的基礎(chǔ)化療對于乳腺癌治療具有重要的臨床意義，但由于腫瘤的異質(zhì)性和耐藥性，治療效果不盡如人意，預(yù)后不佳，且增加了患者的痛苦及治療成本［1-3］。關(guān)于化療耐藥的成因、機(jī)制以及尋找有效的化療耐藥逆轉(zhuǎn)方法一直是腫瘤基礎(chǔ)及臨床研究的重要課題。大量的研究表明，微小RNA（microRNA， miRNA， miR）可通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中相關(guān)基因的表達(dá)和復(fù)雜的信號(hào)通路，影響腫瘤細(xì)胞對多種化療藥物的敏感性［4-5］。miR-144-3p是miR-144/miR-451家族的成員之一，參與調(diào)控多種生物學(xué)過程［6］，且研究顯示其在肝癌［7］、結(jié)直腸癌［8］、宮頸癌［9］以及卵巢癌［10］等多種腫瘤中表達(dá)水平較低，可通過多種靶基因調(diào)控腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。且在卵巢癌細(xì)胞SKOV3中，長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA， lncRNA） HCG11 （HLA complex group 11）可與miR-144-3p/PBX3競爭性內(nèi)源RNA（competitive endogenous RNA， ceRNA）網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控癌細(xì)胞的增殖及遷移［10］。此外，淫羊藿苷可上調(diào)miR-144-3p的表達(dá)，進(jìn)而靶向胰島素樣生長因子2受體（insulin-like growth factor 2 receptor， IGF2R）抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移，抑制腫瘤的進(jìn)展［11］。但miR-144-3p對卵巢癌細(xì)胞順鉑敏感性的影響及具體作用機(jī)制尚未有系統(tǒng)明確的闡釋。因此，本研究選取卵巢癌耐藥細(xì)胞系A(chǔ)2780/DDP和SKOV3/DDP（為人卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780和SKOV3經(jīng)長期順鉑刺激誘導(dǎo)建立的耐順鉑卵巢癌細(xì)胞系），通過轉(zhuǎn)染miR-144-3p mimic探討其對卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥性的影響，同時(shí)從細(xì)胞鐵死亡的角度初步分析其可能的作用機(jī)制。

材料和方法

1　材料與試劑

A2780、SKOV3及耐藥株A2780/DDP和SKOV3/DDP為本實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫留存；細(xì)胞培養(yǎng)用RPMI-1640培養(yǎng)液（Sigma-Aldrich）及胎牛血清（武漢三利生物技術(shù)有限公司）；注射用順鉑（山東齊魯制藥有限公司）；鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1（Fer-1）和鐵螯合劑甲磺酸去鐵胺（desferrioxamine mesylate， DFO）購自MedChemExpress；Hiperfect相關(guān)轉(zhuǎn)染試劑（Qiagen）；溶質(zhì)載體家族7成員11（solute carrier family 7 member 11， SLC7A11）、谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4， GPX4）、4-羥基壬烯醛（4-hydroxynonenal， 4-HNE）和GAPDH抗體購于Abcam；CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)、丙二醛（malondialdehyde， MDA）檢測及谷胱甘肽（glutathione， GSH）檢測試劑盒（廣州優(yōu)寧維生物科技有限公司）；Fe2+探針檢測試劑購于DojinDo；miR-144-3p mimic及其陰性對照（negative control， NC）miRNA、SLC7A11-3'UTR螢光素酶表達(dá)載體［SLC7A11-野生型（wild-type， WT）-3'UTR和SLC7A11-突變型（mutant， MUT）-3'UTR］、SLC7A11過表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA-SLC7A11，圖3中標(biāo)示分組時(shí)簡化為SLC7A11）及其對照質(zhì)粒（pcDNA）由廣州金唯智生物科技有限公司提供。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染卵巢癌A2780、SKOV3及A2780/DDP、SKOV3/DDP細(xì)胞株均培養(yǎng)于含10% FBS和1%青-鏈霉素的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液中。為維持耐藥性，A2780/DDP的培養(yǎng)液中添加1 mg/L的順鉑。細(xì)胞培養(yǎng)箱環(huán)境均為37 ℃、5% CO2。培養(yǎng)過程中需定期換液，匯合至約80%時(shí)消化傳代。

在A2780/DDP或SKOV3/DDP細(xì)胞行轉(zhuǎn)染前1周，用正常培養(yǎng)基（不含順鉑）培養(yǎng)。參考說明書步驟，用Hiperfect轉(zhuǎn)染試劑將miR-144-3p mimic/NC和（或）pcDNA-SLC7A11/pcDNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞中培養(yǎng)48 h。經(jīng)鑒定轉(zhuǎn)染效率后，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2CCK-8實(shí)驗(yàn)將生長良好的卵巢癌細(xì)胞接種至96孔板中，接種密度為1×108/L，各組細(xì)胞用或不用Fer-1（5 μmol/L）和DFO（5 μmol/L）處理30 min，再培養(yǎng)48 h，向每孔加入10 μL CCK-8試劑繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h。用酶標(biāo)儀在波長450 nm處測定各孔的吸光度（）值，參考標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞的相對活力并評估其對順鉑的敏感性。

2.3集落形成實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后，消化接種至6孔板中，接種密度為每孔500個(gè)，細(xì)胞繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，期間定時(shí)更換培養(yǎng)液。取出培養(yǎng)板，加4%多聚甲醛固定后經(jīng)結(jié)晶紫染液染色，沖洗后于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆形成，并拍照進(jìn)行定量分析。

2.4雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)采用雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析miR-144-3p與SLC7A11間的靶向結(jié)合。利用HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑將SLC7A11-3'UTR螢光素酶表達(dá)載體（SLC7A11-WT-3'UTR/SLC7A11-MUT-3'UTR）和（或）miR-144-3p mimic轉(zhuǎn)入卵巢癌細(xì)胞中。依據(jù)說明書，用發(fā)光檢測儀測定螢光素酶反應(yīng)強(qiáng)度。報(bào)告基因活性以螢火蟲螢光素酶活性強(qiáng)度與內(nèi)參照海腎螢光素酶活性強(qiáng)度的比值來表示。

2.5MDA及GSH檢測各組細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后，離心收集細(xì)胞，PBS洗滌后重懸，超聲破碎并收集細(xì)胞上清液，依據(jù)試劑盒操作說明加入相應(yīng)的工作液孵育，酶標(biāo)儀測定各孔的吸光度（）值。參考標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算MDA及GSH的含量。

2.6透射電子顯微鏡檢測通過透射電子顯微鏡觀察線粒體形態(tài)，各組細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后于2.5%戊二醛中4 ℃固定過夜，PBS洗滌，加1% OsO4進(jìn)一步處理2 h，經(jīng)過乙醇梯度脫水、滲透及包埋制成超薄切片，切片經(jīng)尿酸乙酯和檸檬酸鉛雙重染色后，透射電子顯微鏡下觀察線粒體的結(jié)構(gòu)并拍照。

2.7Fe2+含量及ROS檢測細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌，加FerroOrange工作液（檢測細(xì)胞內(nèi)Fe2+含量）或ROS綠色熒光探針DCFH-DA（ROS活性檢測）孵育，熒光顯微鏡下觀察并拍照進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)定量分析。

2.8裸鼠異種移植瘤模型將攜帶miR-NC或miR-144-3p mimic的慢病毒轉(zhuǎn)染至A2780/DDP細(xì)胞，并用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。18只6周齡裸鼠［廣州賽業(yè)百沐生物科技有限公司SCXK（粵）2020-0055］隨機(jī)分為3組：對照（control，ctrl組（接種A2780/DDP細(xì)胞）、NC組（接種轉(zhuǎn)染miR-NC的A2780/DDP細(xì)胞）及mimic組（接種轉(zhuǎn)染miR-144-3p mimic的A2780/DDP細(xì)胞），每組6只。將經(jīng)過相應(yīng)處理的三組細(xì)胞分別注射至裸鼠頸背部皮下（每只接種3.5×106個(gè)細(xì)胞），所有裸鼠接受注射后于標(biāo)準(zhǔn)條件下繼續(xù)飼養(yǎng)30天，每天腹腔注射2 mg/kg順鉑。定期測量腫瘤大小，至第30天犧牲裸鼠，取出瘤體稱重，測量瘤體大小，同時(shí)提取腫瘤組織蛋白，以備后續(xù)分析使用。

2.9Western blot實(shí)驗(yàn)用RIPA法提取細(xì)胞及瘤體組織中的蛋白，取等量蛋白上樣進(jìn)行Western blot電泳并轉(zhuǎn)印至PVDF膜，加5%的脫脂奶粉-TBST封閉90 min。依據(jù)說明書，加入Ⅰ抗SLC7A11（1∶2 000）、GPX4（1∶1 000）、4-HNE（1∶4 000）和GAPDH（1∶10 000）4 ℃過夜，洗滌膜后，加HRP-標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗（1∶4 000）進(jìn)行孵育（25 ℃，2 h）。TBST洗滌后，將PVDF膜轉(zhuǎn)移至暗室中經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光顯影、定影并對所得結(jié)果進(jìn)行蛋白表達(dá)的定量分析。

2.10RT-qPCR實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后采用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，取2 μg總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。用以模板、引物和Taq PCR Master Mix試劑構(gòu)成反應(yīng)體系行RT-qPCR。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，40個(gè)循環(huán)。記錄Ct值，分別以U6和GAPDH為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法評估m(xù)iR-144-3p和SLC7A11 mRNA的相對表達(dá)水平。miR-144-3p的正向引物序列為5'-GCAGAGTACAGTATAGATGATG-3'，反向引物序列為5'-TGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6的正向引物序列為5'-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3'，反向引物序列為5'-GGAACGCTTCACGAATTTGC-3'；SLC7A11的正向引物序列為5'-TTGTTTTGCACCCTTTGACAAT-3'；反向引物序列為5'-GACGATGCATATCTGGGCATT-3'；GAPDH的正向引物序列為5'-CATGTTCGTCATGGGTGTGAA-3'，反向引物序列為5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'。

3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以GraphPad Prism 8.3軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和制圖。計(jì)量資料結(jié)果表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）。兩組均數(shù)間比較用檢驗(yàn)；多組間兩兩比較則用單因素方差分析事后Bonferroni檢驗(yàn)。以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1　miR-144-3p過表達(dá)可提高乳腺癌順鉑耐藥細(xì)胞化療敏感性

與親本細(xì)胞相比，CCK-8檢測結(jié)果顯示順鉑對A2780/DDP和SKOV3/DDP細(xì)胞活力的抑制作用顯著降低（<0.05）；同時(shí)，順鉑耐藥細(xì)胞中miR-144-3p表達(dá)顯著降低（<0.05），與NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-144-3p mimic可顯著增強(qiáng)A2780/DDP和SKOV3/DDP細(xì)胞對順鉑的敏感性（<0.01），提高順鉑對細(xì)胞集落形成的抑制效果（<0.01），見圖1。

Figure 1.　miR-144-3p enhanced the sensitivity of cisplatin-resistant ovarian cancer cells to cisplatin. A： comparison of cisplatin sensitivity of A2780， A2780/DDP， SKOV3 and SKOV3/DDP cells； B： the expression of miR-144-3p in A2780， A2780/DDP， SKOV3 and SKOV3/DDP cells； C： transfection with miR-144-3p mimic increased the sensitivity of A2780/DDP and SKOV3/DDP cells to cisplatin； D： detection of transfection efficiency； E： transfection with miR-144-3p mimic inhibited colony formation of A2780/DDP and SKOV3/DDP cells. Mean±SD. n=3. #P<0.05 vs A2780 cells；△P<0.05 vs SKOV3 cells；**P<0.01 vs NC group.

2　miR-144-3p與SLC7A11的靶向結(jié)合

TargetScan及miRDB數(shù)據(jù)庫檢索顯示miR-144-3p與SLC7A11之間有潛在的結(jié)合位點(diǎn)，序列信息如圖2A所示。螢光素酶活性結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染SLCTA11-WT-3'UTR和miR-144-3p mimic可顯著降低A2780/DDP細(xì)胞內(nèi)螢光素酶的活性（<0.01），表明miR-144-3p可靶向結(jié)合SLC7A11，見圖2B。

為確證miR-144-3p與SLC7A11之間的調(diào)控關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)采用RT-qPCR及Western blot評估了A2780/DDP細(xì)胞中miR-144-3p對SLC7A11表達(dá)的影響。檢測結(jié)果表明，A2780/DDP細(xì)胞中轉(zhuǎn)入miR-144-3p mimic后，SLC7A11的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（<0.01），見圖2C、D。同時(shí)利用R語言分析TCGA數(shù)據(jù)庫中卵巢癌的mRNA表達(dá)譜信息，結(jié)果顯示卵巢癌組織中SLC7A11的表達(dá)較正常卵巢組織顯著升高（<0.01），圖2E。結(jié)果提示miR-144-3p可負(fù)調(diào)控SLC7A11的表達(dá)，影響卵巢癌的進(jìn)展。

Figure 2.　miR-144-3p directly targeted SLC7A11 in A2780/DDP cells. A： predicted SLC7A11 3'UTR binding site for miR-144-3p； B： relative luciferase activity in transfected A2780/DDP cells； C and D： the mRNA （C） and protein （D） expression levels of SLC7A11 in A2780/DDP cells after transfected with miR-144-3p mimic； E： the SLC7A11 mRNA expression profile of ovarian cancer in TCGA database. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs NC group；△△P<0.01 vs normal tissue.

3　miR-144-3p調(diào)控SLC7A11介導(dǎo)的鐵死亡增強(qiáng)A2780/DDP細(xì)胞對順鉑的敏感性

為研究miR-144-3p增強(qiáng)A2780/DDP細(xì)胞對順鉑的敏感性與SLC7A11之間的相關(guān)性及可能的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)在A2780/DDP細(xì)胞中同時(shí)轉(zhuǎn)入miR-144-3p mimic和pcDNA-SLC7A11。轉(zhuǎn)染效率檢測顯示，與mimic+pcDNA組相比，mimic+SLC7A11組A2780/DDP細(xì)胞中SLC7A11的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著升高（<0.05），見圖3A、I。與mimic+pcDNA組相比，mimic+SLC7A11組A2780/DDP細(xì)胞對順鉑的敏感性降低（<0.05），細(xì)胞集落形成顯著增多（<0.05），見圖3B、C。考慮到SLC7A11是調(diào)控鐵死亡的關(guān)鍵基因之一，用鐵死亡抑制劑Fer-1和鐵螯合劑DFO干預(yù)細(xì)胞，結(jié)果顯示，與mimic+pcDNA組相比，F(xiàn)er-1和DFO的作用與過表達(dá)SLC7A11一致，其能增加A2780/DDP細(xì)胞在順鉑（32 μmol/L）條件下的細(xì)胞活力（<0.05），見圖3D。進(jìn)一步檢測miR-144-3p對細(xì)胞鐵死亡相關(guān)指標(biāo)的影響，結(jié)果顯示，相較于NC+pcNDA組，轉(zhuǎn)染miR-144-3p mimic可增加A2780/DDP細(xì)胞內(nèi)Fe2+含量（<0.01）和ROS水平（<0.01），見圖3E、F；透射電鏡下可觀察到線粒體的皺縮伴隨膜密度增加，見圖3G。此外，miR-144-3p mimic轉(zhuǎn)染還參與下調(diào)胞內(nèi)GSH的水平，上調(diào)MDA的水平（<0.01），促進(jìn)4-HNE的表達(dá)，抑制GPX4的表達(dá)（<0.01），誘導(dǎo)A2780/DDP細(xì)胞鐵死亡；而共轉(zhuǎn)染miR-144-3p mimic和pcDNA-SLC7A11，可部分消除miR-144-3p mimic對鐵死亡相關(guān)指標(biāo)的影響（<0.05），見圖3H、I。這些結(jié)果提示，miR-144-3p/SLC7A11軸可增強(qiáng)卵巢癌耐藥細(xì)胞A2780/DDP對順鉑的敏感性，該作用可能與鐵死亡有關(guān)。

Figure 3.　miR-144-3p/SLC7A11 axis enhanced the sensitivity of A2780/DDP cells to cisplatin by regulating ferroptosis. A： the mRNA expression level of SLC7A11 in various groups； B： cell sensitivity to cisplatin in various groups； C： cell colony formation in various groups； D： comparison of cell viability in the presence of 32 μmol/L cisplatin in various groups； E： Fe2+ content in various groups； F： ROS level in various groups； G： mitochondrial morphology in various groups； H： concentrations of GSH and MDA in various groups； I： the expression of ferroptosis-related proteins in various groups. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs NC+pcDNA group；#P<0.05 vs mimic+pcDNA group.

4　miR-144-3p抑制異種移植瘤生長

構(gòu)建裸鼠A2780/DDP細(xì)胞異種移植瘤模型，評估m(xù)iR-144-3p的體內(nèi)抑瘤效果。結(jié)果如圖4A所示，mimic組移植瘤的瘤體大小及瘤重均顯著低于NC組（<0.01）；同時(shí)Western blot檢測結(jié)果顯示，與NC組相比，mimic組腫瘤組織中SLC7A11及GPX4的表達(dá)顯著降低（<0.01），4-HNE的表達(dá)顯著升高（<0.05），見圖4B。

Figure 4.　miR-144-3p inhibited the growth of xenograft tumors. A： tumor size and tumor weight； B： the expression of ferroptosis-related proteins. Mean±SD. n=6. *P<0.05，**P<0.01 vs NC group.

討論

目前卵巢癌細(xì)胞化療耐性的產(chǎn)生以及逆轉(zhuǎn)耐藥的方式仍是腫瘤治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)話題之一；本實(shí)驗(yàn)選取了卵巢癌耐藥細(xì)胞株A2780/DDP進(jìn)行相關(guān)耐藥靶點(diǎn)的篩選及研究。CCK-8檢測順鉑敏感性的結(jié)果顯示A2780/DDP對順鉑的抵抗力增強(qiáng)，表明該細(xì)胞可用于耐藥相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究；此外，本研究的檢測結(jié)果提示A2780/DDP細(xì)胞中miR-144-3p的表達(dá)水平顯著降低，提示miR-144-3p可能與其順鉑耐藥之間存在一定的聯(lián)系。進(jìn)一步通過miR-144-3p mimic模擬內(nèi)源性miR-144-3p，結(jié)果提示轉(zhuǎn)染miR-144-3p mimic可顯著抑制A2780/DDP細(xì)胞集落形成，增強(qiáng)細(xì)胞對順鉑的敏感性。

微小RNA通常是與靶基因的3'UTR結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，進(jìn)而影響細(xì)胞的相關(guān)生物學(xué)功能［4-5］，本研究通過生物信息學(xué)手段預(yù)測并驗(yàn)證了miR-144-3p與SLC7A11之間存在靶向結(jié)合，且miR-144-3p可抑制A2780/DDP細(xì)胞中SLC7A11的表達(dá)，同時(shí)SLC7A11在卵巢癌組織中的表達(dá)顯著升高。進(jìn)一步采用SLC7A11過表達(dá)質(zhì)粒驗(yàn)證SLC7A11在miR-144-3p增強(qiáng)A2780/DDP細(xì)胞順鉑敏感性中的作用，結(jié)果顯示，SLC7A11過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miR-144-3p mimic的作用效果。基因編碼的蛋白質(zhì)屬于一種膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可參與細(xì)胞內(nèi)外GSH的轉(zhuǎn)運(yùn)，影響細(xì)胞鐵離子的穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而影響細(xì)胞的鐵死亡進(jìn)程［12-14］。研究提示，卵巢癌組織中SLC7A11和GPX4的聯(lián)合高表達(dá)可作為預(yù)測患者鉑類化療藥物耐藥及不良預(yù)后的指標(biāo)［15］。此外，circSnx12/miR-194-5p調(diào)控軸最終可靶向SLC7A11，激活細(xì)胞鐵死亡，增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞SKOV3/DDP和A2780/DDP的化療敏感性［16］。因此，本研究進(jìn)一步評價(jià)了miR-144-3p對SLC7A11介導(dǎo)的鐵死亡的作用，結(jié)果顯示在A2780/DDP細(xì)胞中，miR-144-3p mimic可抑制SLC7A11的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Fe2+積累，促進(jìn)鐵死亡，這一作用對解釋miR-144-3p增強(qiáng)A2780/DDP細(xì)胞順鉑敏感性具有重要的價(jià)值。此外，在體異種移植瘤實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了miR-144-3p的抑瘤效果?？紤]到miR與靶基因之間的結(jié)合方式，一個(gè)微小RNA可同時(shí)調(diào)控多個(gè)靶基因的表達(dá)，miR-144-3p是否還可通過其他靶基因發(fā)揮作用仍需要進(jìn)一步深入的研究。

綜上所述，miR-144-3p可增加卵巢癌耐藥細(xì)胞對順鉑敏感性，其機(jī)制可能與負(fù)向調(diào)控SLC7A11的表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞鐵死亡有關(guān)。

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miR-144-3p/SLC7A11 axis enhances cisplatin sensitivity in ovarian cancer cells through ferroptosis

LIAO Fenger， TAO Ying， LUO Jie， LI Yun， GUO Qin△

（，，510062，）

To explore the effect of microRNA-144-3p （miR-144-3p） on cisplatin resistance in ovarian cancer cells and determine whether its mechanism is related to solute carrier family 7 member 11 （SLC7A11） and ferroptosis.After transfecting miR-144-3p mimic into cisplatin-resistant ovarian cancer cell lines， the abundance of miR-144-3p was measured by RT-qPCR. Sensitivity to cisplatin and cell proliferation were determined by CCK-8 and colony-forming assays， respectively. The levels of malondialdehyde （MDA） and glutathione （GSH） were assessed by kit assays. Fe2+content and reactive oxygen species （ROS） level were detected using Fe2+probe and ROS fluorescent probe， respectively. Mitochondrial morpghology was observed under transmission electron microscope. Dual-luciferase reporter assay was used to identify and verify the binding between miR-144-3p and SLC7A11. Furthermore， A2780/DDP cancer cell xenograft model was established to evaluate the effect of miR-144-3p on tumor growth in.The expression of miR-144-3p in drug-resistant cell lines A2780/DDP and SKOV3/DDP was significantly lower than that in parent cell lines A2780 and SKOV3 （<0.05）. Transfection with miR-144-3p mimic inhibited cell proliferation and enhance the sensitivity of drug-resistant ovarian cancer cells to cisplatin （<0.01）. Dual-luciferase reporter assay demonstrated thatwas a target gene of miR-144-3p， and SLC7A11 overexpression reversed the effect of miR-144-3p on the cell proliferation and cisplatin sensitivity through ferroptosis （<0.05）. Additionally，xenograft experiments showed that miR-144-3p inhibited tumor growth， and down-regulated SLC7A11 and glutathione peroxidase 4 （GPX4） expression （<0.01）， along with the up-regulation of 4-hydroxynonenal （4-HNE） level （<0.01）.miR-144-3p can target SLC7A11 to enhance the sensitivity of drug-resistant ovarian cancer cells to cisplatin， and its mechanism may involve ferroptosis.

microRNA-144-3p； ovarian cancer； cisplatin resistance； ferroptosis； solute carrier family 7 member 11

R737.31； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2023.09.003

1000-4718（2023）09-1555-08

2023-05-19

2023-07-22

廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金項(xiàng)目（No. A2019364； No. A2021477）

Tel： 020-61321847； E-mail： guoqin5241@sina.com

（責(zé)任編輯：余小慧，羅森）