急性心肌梗死對(duì)心臟發(fā)育基因SOX9及血清炎性因子的影響

樊漣漪,鄧勝利

(1.空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院 骨科麻醉,陜西 西安 710038;2.遵義醫(yī)科大學(xué) 麻醉醫(yī)學(xué)院,貴州省麻醉與器官重點(diǎn)保護(hù)實(shí)驗(yàn)室,貴州 遵義 563099;3.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 麻醉科,貴州 遵義 563099)

缺血性心臟病目前是人類死亡的主要原因之一,而心肌梗死(myocardial infarction,MI)尤其急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是缺血性心臟病最常見原因,它發(fā)病驟急,患者預(yù)后極差［1]。

SOX家族蛋白是一組具有高度保守結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子,SOX9的下調(diào)可導(dǎo)致心室心肌細(xì)胞減少,影響心肌的正常生長［2],另缺失SOX9的胚胎大多在妊娠中期即死亡,其原因可能是由于心內(nèi)膜墊細(xì)胞遷移受阻和凋亡增加［3],導(dǎo)致此類胚胎心內(nèi)膜墊嚴(yán)重發(fā)育不良,誘發(fā)充血性心衰。隨后研究發(fā)現(xiàn),SOX9是心肌缺血損傷后導(dǎo)致后期心臟纖維化的主要調(diào)控因子［4]。近來文獻(xiàn)報(bào)道缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)過表達(dá)時(shí)SOX9表達(dá)增加,而HIF-1已被證實(shí)可通過多種途徑發(fā)揮心肌保護(hù)效應(yīng)［5]。還有研究認(rèn)為,SOX9可調(diào)控與心肌缺血密切相關(guān)的AP-1、Wnt等基因［6-9]。以上研究提示SOX9可能與心肌的缺血損害存在一定相關(guān),明確它們之間關(guān)系可能會(huì)對(duì)尋找抗心肌缺血損害的治療靶點(diǎn)提供新思路。

目前眾多的研究證實(shí),SOX9與炎性反應(yīng)的調(diào)控有關(guān)［10],但其研究卻表現(xiàn)出不同的觀點(diǎn)與結(jié)果。在肝臟方面研究認(rèn)為,抑制SOX9可減少白介素6(interleukin 6,IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor a,TNF-α)等炎性因子的釋放,進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的肝缺血損傷［11];在軟骨細(xì)胞炎癥中研究發(fā)現(xiàn),SOX9表達(dá)的上調(diào)與血清IL-6等炎性因子的增高呈正比［12],即SOX9的表達(dá)與炎性反應(yīng)呈正相關(guān)。然在牙髓炎的研究中,敲除SOX9卻可導(dǎo)致白介素8(interleukin 8,IL-8)表達(dá)增加,加速誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生［13],呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。但在發(fā)生AMI時(shí),心肌SOX9與炎性因子及心肌損害標(biāo)志物之間的關(guān)系如何尚未見報(bào)道。

基于上述原因,本研究通過建立大鼠心肌梗死模型,觀察AMI缺血不同時(shí)間對(duì)心肌SOX9的表達(dá)變化及血清高敏肌鈣蛋白(high-sensitivity cardiac troponin, hs-cTn)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme-MB,CK-MB)等心肌損害標(biāo)志物與IL-6、TNF-α炎性因子的改變;同時(shí)測量心肌梗死面積,觀察線粒體超微結(jié)構(gòu),以明確SOX9與急性心肌缺血損害、心肌損害標(biāo)志物及炎性因子之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 本實(shí)驗(yàn)選用健康SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,實(shí)驗(yàn)時(shí)體重250～300 g,周齡為8～9周。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組,分別建立急性心肌梗死模型與假手術(shù)模型:心肌梗死組(MI組,n=45)與假手術(shù)組(Sham組,n=36)。兩組模型建立成功后又隨機(jī)分為0.5、8、24 h進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測。Sham組各時(shí)點(diǎn)大鼠建模各12只,共36只均存活。MI組0.5 h時(shí)點(diǎn)建模15只,存活13只;8 h時(shí)點(diǎn)建模15只,存活12只;24 h時(shí)點(diǎn)建模15只,存活11只;MI組總體死亡9只。

1.2 主要試劑及儀器 2、3、5 氯化三苯基四氮唑(2、3、5-triphenytetrazoliumchloride,TTC)、酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA,北京索萊寶科技有限公司);蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);兔多抗SOX9(艾博抗上海貿(mào)易有限公司);ALC-V8型小動(dòng)物呼吸機(jī)、JEM-1400plus型透射電子顯微鏡、Varioskan Flash型多功能酶標(biāo)儀、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、垂直電泳儀、濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀。

1.3 方法

1.3.1 心梗模型的建立 建立MI模型:參照文獻(xiàn)［14]建立。MI模型:采用2%戊巴比妥鈉(3 mL/kg)對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔內(nèi)注射麻醉。行氣管插管成功后連接呼吸機(jī),呼吸機(jī)參數(shù)設(shè)置為呼吸頻率:80次/min,潮氣量為15 mL/kg,吸呼比為1∶1,吸入95%氧氣與5%二氧化碳混合氣體;消毒鋪巾,于大鼠左側(cè)胸壁3～4肋間下橫向開胸,逐層暴露心臟,在冠狀動(dòng)脈左側(cè)主干處、左心耳下方2～3 mm處位置,將冠狀動(dòng)脈左前降支(left anterior descending coronary artery,LAD)用6.0帶線縫合針穿過并結(jié)扎(進(jìn)針深度1～1.5 mm,寬約2.0 mm)。結(jié)扎后即刻可見:結(jié)扎區(qū)域及左室前壁心肌組織變白,心電圖顯示ST段抬高,此為心梗建模成功的標(biāo)志;而假手術(shù)對(duì)照組則只對(duì)LAD血管穿線不結(jié)扎。術(shù)畢用青霉素10萬U肌肉注射預(yù)防感染。

1.3.2 TTC染色法檢測大鼠心肌梗死面積 稱取0.1 g TTC 37 ℃恒溫孵育約25 min;將剪取的心臟置于-80 ℃冰箱中冷凍7～8 min;均勻橫切至5～7片,于37 ℃1%TTC染液中恒溫染色15～20 min;置于4%多聚甲醛中固定,24 h后相機(jī)拍照備用;使用Image-J軟件對(duì)照片進(jìn)行測量分析,計(jì)算心肌梗死面積。其梗死面積(%)=心肌切片白色梗死面積/心肌切片左室總面積×100%。

1.3.3 透射電鏡觀察大鼠心肌線粒體超微結(jié)構(gòu) 切取左室前壁中線靠近結(jié)扎區(qū)心肌組織,將標(biāo)本切至1 mm×1 mm×1 mm大小,并置于4%的戊二醛ep管中固定,于透射電鏡下進(jìn)行心肌超微結(jié)構(gòu)的檢測。按Flameng標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。

1.3.4 ELISA法檢測血清中hs-cTn、CK-MB、肌紅蛋白(myoglobin,Mb)及IL-6、TNF-α的含量 按相關(guān)試劑盒說明書,通過ELISA法對(duì)血清中hs-cTn、CK-MB、Mb及IL-6、TNF-α等指標(biāo)進(jìn)行檢測。

1.3.5 Western-blot法檢測SOX9蛋白的相對(duì)表達(dá)量 根據(jù)試劑說明書提取心肌組織總蛋白,同時(shí)按步驟進(jìn)行BCA法測蛋白濃度,將提取的蛋白變性后于-20 ℃保存,制備好電泳裝置后,進(jìn)行電泳、電轉(zhuǎn)、封閉、抗體孵育后,最后曝光,應(yīng)用ImageJ軟件進(jìn)行條帶分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌梗死面積的變化 Sham組各時(shí)間點(diǎn)未發(fā)生心肌梗死現(xiàn)象;MI組與Sham組相比,各時(shí)點(diǎn)兩組之間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),MI組出現(xiàn)不同程度的心肌梗死灶;MI組內(nèi)心肌梗死面積24 h時(shí)點(diǎn)大于8 h時(shí)點(diǎn),8 h時(shí)點(diǎn)大于0.5 h時(shí)點(diǎn),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其心肌梗死面積呈現(xiàn)逐漸增加(圖1、表1)。

圖1 各組大鼠心肌梗死TTC染色結(jié)果

表1 各組大鼠心肌梗死面積結(jié)果

2.2 大鼠心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變及心肌線粒體Flameng評(píng)分

2.2.1 心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化 透射電鏡下Sham組各時(shí)點(diǎn)線粒體數(shù)目較多,結(jié)構(gòu)完整清晰、排列整齊,基質(zhì)內(nèi)電子密度高,肌纖維排列整齊;0.5 h時(shí)點(diǎn)MI組除線粒體基質(zhì)內(nèi)電子密度稍有降低外,余未見明顯改變;8 h時(shí)點(diǎn)MI組線粒體數(shù)量減少,部分線粒體腫脹、膜結(jié)構(gòu)消失,線粒體嵴變短變淺、斷裂,基質(zhì)內(nèi)電子密度明顯降低,肌纖維少部分溶解斷裂;24 h時(shí)點(diǎn)MI組線粒體大部分溶解消失,所殘存線粒體結(jié)構(gòu)不清,內(nèi)呈空泡狀,肌纖維溶解斷裂成團(tuán)(圖2)。

標(biāo)尺分別為2 μm和1 μm。圖2 各組大鼠心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)

2.2.2 心肌線粒體Flameng評(píng)分結(jié)果 Sham組各時(shí)點(diǎn)線粒體評(píng)分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;MI組與Sham組相比,0.5 h時(shí)點(diǎn)線粒體評(píng)分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),8 h及24 h時(shí)點(diǎn)線粒體評(píng)分明顯增加(P<0.05);MI組內(nèi)情況:與0.5 h時(shí)點(diǎn)相比,8 h及24 h時(shí)點(diǎn)線粒體評(píng)分增加,且24 h時(shí)點(diǎn)線粒體評(píng)分高于8 h時(shí)點(diǎn)(P<0.05,圖3、表2)。

*:P<0.05。圖3 各組大鼠心肌線粒體評(píng)分結(jié)果

2.3 各組大鼠血清中hs-cTn、CK-MB、Mb及IL-6、TNF-α的變化 Sham組各時(shí)點(diǎn)血清hs-cTn、CK-MB、Mb心肌損傷標(biāo)志物與IL-6、TNF-α炎性因子檢測量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。MI組與Sham組相比:8 h及24 h時(shí)點(diǎn)hs-cTn、CK-MB、Mb與IL-6、TNF-α均增加(P<0.05),但在0.5 h時(shí)點(diǎn)IL-6、TNF-α檢測量增加(P<0.05),而hs-cTn、CK-MB、Mb無差異(P>0.05);MI組內(nèi)情況:8 h及24 h時(shí)點(diǎn)所有心肌損傷標(biāo)志物與炎性因子較0.5 h時(shí)點(diǎn)增加,且24 h時(shí)點(diǎn)較8 h時(shí)點(diǎn)高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表3～7、圖4)。

表2 各組大鼠心肌線粒體Flameng評(píng)分情況

表3 各組大鼠血清hs-cTn變化情況

表4 各組大鼠血清CK-MB變化情況

表5 各組大鼠血清Mb變化情況

表7 各組大鼠血清TNF-α變化情況

A、B、C:分別為心肌損傷標(biāo)志物hs-cTn、Mb、CK-MB結(jié)果;D、E:分別為炎癥指標(biāo)IL-6、TNF-α結(jié)果;圖4 各組大鼠血清中心肌損傷標(biāo)志物及炎癥指標(biāo)檢測結(jié)果

2.4 各組大鼠心肌組織中SOX9蛋白表達(dá)量的變化 Sham組各時(shí)間點(diǎn)大鼠心肌組織中SOX9 蛋白表達(dá)量無明顯變化(P>0.05)。MI組與Sham組相比,在24 h時(shí)點(diǎn)心肌組織SOX9 蛋白表達(dá)量出現(xiàn)明顯下降(P<0.05),在0.5 h及8 h時(shí)點(diǎn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);MI組內(nèi)情況:與0.5 h時(shí)點(diǎn)相比,24 h時(shí)點(diǎn)大鼠心肌組織SOX9蛋白表達(dá)量明顯下降(P<0.05),而8 h時(shí)點(diǎn)與0.5 h時(shí)點(diǎn)及24 h時(shí)點(diǎn)與8 h時(shí)點(diǎn)相比,蛋白下降差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表8、圖5)。

A:SOX9蛋白的免疫印跡圖;B:SOX9蛋白表達(dá)量化結(jié)果;圖5 各組大鼠心肌組織中SOX9蛋白表達(dá)量結(jié)果

2.5 大鼠心肌組織SOX9蛋白表達(dá)變化與血清炎癥因子及心肌損傷標(biāo)志物變化的相關(guān)性分析 AMI后24 h內(nèi),缺血心肌SOX9蛋白表達(dá)量隨著缺血時(shí)間的延長而逐漸下降,血清炎性因子及心肌損傷標(biāo)志物逐漸升高。SOX9蛋白水平的下降與血清炎性因子及心肌損傷標(biāo)志物含量的上升呈負(fù)相關(guān)性(相關(guān)值分別為:hs-cTn,r=-0.641;CK-MB,r=-0.707;TNF-α,r=-0.722;IL-6,r=-0.684)(P<0.05,表9、圖6)。

表9 24 h內(nèi)AMI大鼠心肌SOX9蛋白表達(dá)量與血清炎癥因子及心肌損傷標(biāo)志物水平的相關(guān)性

圖6 24 h內(nèi)AMI大鼠心肌SOX9蛋白表達(dá)量與血清炎癥因子及心肌損傷標(biāo)志物變化的相關(guān)性分析

3 討論

急性心梗后24 h內(nèi)早期予以治療可明顯減少患者死亡率及遠(yuǎn)期并發(fā)癥［15-18];同時(shí)對(duì)AMI的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn),心肌因缺血和缺氧,可迅速引發(fā)炎性因子風(fēng)暴,影響患者預(yù)后。故深入研究AMI的病理生理改變及機(jī)制,可為治療AMI尋求新的靶點(diǎn)。SOX9作為心臟發(fā)育基因,目前在AMI時(shí)的變化及相關(guān)作用不清。故本研究圍繞大鼠24 h內(nèi)AMI展開SOX9的相關(guān)研究。

目前關(guān)于大鼠MI模型的建立有冠脈結(jié)扎法［14],藥物誘導(dǎo)法［19],冰烙法［20]等。冠脈血管結(jié)扎法更加明確可靠,與臨床心梗更相符合,且模型相對(duì)穩(wěn)定［14],故本實(shí)驗(yàn)選擇冠脈結(jié)扎法進(jìn)行MI的造模。而本研究的結(jié)果示血清心肌損傷標(biāo)志物及心肌梗死面積等的增加與出現(xiàn)均證實(shí)MI模型的建立成功。

MI后出現(xiàn)不同程度的心梗面積,且心梗面積呈逐漸增加趨勢,明確說明MI模型建立成功。同時(shí)發(fā)現(xiàn)MI后8 h及24 h線粒體發(fā)生明顯破壞,且24 h較8 h破壞程度嚴(yán)重,說明缺血到達(dá)一定時(shí)間可導(dǎo)致線粒體損傷,并隨缺血時(shí)間延長而逐漸加重。而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)單純開胸及心肌缺血0.5 h不會(huì)引起線粒體明顯損害,這與既往報(bào)道一致［21]。關(guān)于在0.5 h時(shí)點(diǎn),MI組出現(xiàn)通過TTC染色顯示發(fā)生心梗,而線粒體超微結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯損傷這一“矛盾”現(xiàn)象。我們分析考慮可能主要與TTC染色判斷心梗的原理有關(guān),即TTC染色是通過組織中脫氫酶將氧化型TTC還原為還原型TTC使心肌表現(xiàn)為磚紅色;一旦脫氫酶減少則TTC不能被還原而呈現(xiàn)白色。而有研究認(rèn)為［22],心肌缺血30 min在線粒體結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化時(shí)琥珀酸脫氫酶含量則明顯下降,也即在組織結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯改變時(shí)某些酶的活性或含量已經(jīng)發(fā)生變化有關(guān)。是否還有其它原因目前不清。

臨床常把心肌損傷標(biāo)志物及炎性因子用于AMI的診斷與預(yù)后判斷［23-24];有研究認(rèn)為,它們還與心肌的缺血損害程度有關(guān)［25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明伴隨缺血時(shí)間的延長心肌損害逐漸加重,而心肌損傷標(biāo)志物及炎性因子也呈逐漸上升趨勢,該結(jié)果也表明AMI的心肌損害程度與上述指標(biāo)變化存在密切相關(guān),可用這些指標(biāo)的變化來反映心肌的損害程度［25-26]。而關(guān)于本研究結(jié)果提示,IL-6、TNF-α炎性因子對(duì)AMI的缺血損害反應(yīng)早于心肌損傷標(biāo)志物。理論上可采用前述炎性因子來盡早反映心肌損害的發(fā)生,但因其特異性低,檢測結(jié)果受影響因素較多［19, 27],故仍需采用心肌損傷標(biāo)志物來對(duì)心肌損害的早期診斷與損傷程度進(jìn)行判斷。鑒于SOX9參與缺血后心肌細(xì)胞的肥大與纖維化調(diào)控,還通過上調(diào)HIF-1對(duì)抗高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損害。那么SOX9是否直接涉及AMI后心肌的缺血損傷目前不清,我們構(gòu)建MI模型,擬探討SOX9與急性心肌缺血損害的關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)心肌SOX9蛋白的檢測結(jié)果顯示,MI組在0.5 h與8 h時(shí)點(diǎn)蛋白水平雖有量的持續(xù)下降,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,直至缺血24 h時(shí)點(diǎn)才出現(xiàn)明顯降低。盡管如此,我們?nèi)园l(fā)現(xiàn)SOX9的下降與心肌的缺血損傷有關(guān)。關(guān)于AMI后SOX9的表達(dá)水平下降其機(jī)制本研究暫未涉及。但有學(xué)者發(fā)現(xiàn),在人椎間盤細(xì)胞炎性反應(yīng)中,炎癥因子的增加可通過抑制NF-κB信號(hào)通路的激活進(jìn)而下調(diào)SOX9表達(dá)［28],而本研究炎性因子的結(jié)果示心肌梗死后IL-6及TNF-α的含量呈進(jìn)行性的升高,這可能同樣是導(dǎo)致AMI時(shí)其心肌SOX9表達(dá)水平下降的原因之一。當(dāng)然明確這一機(jī)制需進(jìn)一步通過抑制炎性反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)來予以直接證明。

為了明確AMI時(shí),心肌SOX9蛋白的變化與血清心肌損傷標(biāo)志物及炎性因子的關(guān)系,我們作了相關(guān)性分析。結(jié)果顯示,24 h內(nèi)MI組各時(shí)間點(diǎn)hs-cTn、CK-MB及IL-6、TNF-α的變化與SOX9蛋白水平的改變呈負(fù)相關(guān)性。說明心肌SOX9表達(dá)的下調(diào)與血清心肌損傷標(biāo)志物及炎性因子的升高在AMI中存在某種內(nèi)在關(guān)聯(lián),如前面推測的炎性因子可能是導(dǎo)致AMI時(shí)SOX9表達(dá)水平下降的原因等。但它們之間的具體內(nèi)在關(guān)聯(lián)為何目前不清。但既往研究證實(shí)心肌損傷標(biāo)志物及炎性因子的變化與心肌的損害程度存在正相關(guān)［25-26],我們的研究結(jié)果也得到相同結(jié)論。故通過它們之間的相關(guān)性分析,一方面提示血清心肌損傷標(biāo)志物及炎性因子的變化可間接反映心肌的SOX9受損情況;另一方面進(jìn)一步佐證了SOX9與急性心肌的缺血損害有關(guān)。

綜上所述,AMI時(shí)心肌缺血可導(dǎo)致SOX9表達(dá)量下降,其改變可能與心肌的損害程度有關(guān);24 h內(nèi)血清hs-cTn、CK-MB、Mb心肌損傷標(biāo)志物與IL-6、TNF-α炎性因子的變化可以反映AMI時(shí)SOX9蛋白下降及心肌損害情況。