嵌合抗原受體T細(xì)胞的設(shè)計(jì)、制備及挑戰(zhàn)

張 雷,徐 林,胡 威

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 胸部腫瘤科,貴州 遵義 563006;2．遵義醫(yī)科大學(xué) 免疫學(xué)教研室,貴州 遵義 563099)

嵌合抗原受體T細(xì)胞(chimeric antigen receptor T-cell,CAR-T)免疫療法是通過(guò)基因工程等手段修飾T淋巴細(xì)胞,使其能夠識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associated antigen,TAA)的嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR),從而特異性識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞的一種過(guò)繼細(xì)胞療法(adoptive cell therapy,ACT),被廣泛應(yīng)用于腫瘤靶向細(xì)胞治療的研究。CAR-T是近年來(lái)癌癥免疫治療領(lǐng)域的重大突破之一,其在血液惡性腫瘤中的臨床成功正推動(dòng)著日益復(fù)雜的免疫細(xì)胞療法的發(fā)展,并可能在未來(lái)幾年應(yīng)用于實(shí)體瘤和非惡性疾病的治療［1]。

目前,CAR-T療法已經(jīng)經(jīng)歷了四代技術(shù)革新,每一代的結(jié)構(gòu)創(chuàng)新都使其更安全和高效。大量研究顯示,CAR蛋白的活性因整體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)而有所不同,信號(hào)結(jié)構(gòu)域的選擇,也會(huì)顯著影響治療的結(jié)果,新的CAR-T的設(shè)計(jì)理念和方法仍在不斷探索中,但尚沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)的模式［2]。本文介紹了CAR的結(jié)構(gòu)演變及CAR-T細(xì)胞治療的臨床前研究常用的設(shè)計(jì)和制備方法,并闡述當(dāng)前該領(lǐng)域所面臨的挑戰(zhàn),以期為CAR-T細(xì)胞治療的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用提供有價(jià)值的參考。

1 CAR-T的結(jié)構(gòu)組成及更新?lián)Q代

1.1 CAR-T的結(jié)構(gòu)組成 CAR是一種人工設(shè)計(jì)合成的抗原受體分子,它可以賦予T細(xì)胞針對(duì)靶抗原的特異性特征,從而增強(qiáng)T細(xì)胞識(shí)別靶抗原信號(hào)和活化的功能。CAR的結(jié)構(gòu)主要分為胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域以及胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域［3]。當(dāng)CAR的抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域與其靶抗原結(jié)合時(shí),整個(gè)蛋白質(zhì)都會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化,從而改變了胞內(nèi)某些氨基酸的暴露和反應(yīng)性,導(dǎo)致幾種翻譯后修飾的催化,啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián),最終導(dǎo)致T細(xì)胞激活,然后釋放穿孔素和顆粒酶直接殺傷腫瘤細(xì)胞或誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌、T細(xì)胞增殖等。

胞外結(jié)構(gòu)域主要由抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)組成?？乖R(shí)別結(jié)構(gòu)域是CAR-T最重要的結(jié)構(gòu),最常采用的是單鏈可變片段(single-chain fragment variable,scFv),由抗體的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)通過(guò)連接肽連接而成,是抗體活性的最小功能結(jié)構(gòu)單位,CAR-T通過(guò)scFv特異性地識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原,CAR-T細(xì)胞的腫瘤靶向性往往由scFv決定。

鉸鏈區(qū)大多是柔性鏈的結(jié)構(gòu),該區(qū)域主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)scFv與靶抗原表位之間的生物物理相互作用,鉸鏈區(qū)的長(zhǎng)度決定了T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的距離,適宜的長(zhǎng)度賦予scFv靈活性,可以影響scFv功能的發(fā)揮以及T細(xì)胞的活化增殖,有助于提高療效［4]?，F(xiàn)在使用的鉸鏈區(qū)主要有IgG1分子、IgG4分子、IgD分子、CD8分子和CD28分子的鉸鏈區(qū)。

跨膜結(jié)構(gòu)域的功能包括將CAR錨定在細(xì)胞膜上,將CAR的胞外結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域連接,起到穩(wěn)定整個(gè)嵌合抗原受體蛋白的作用,同時(shí)能夠有效地傳遞跨膜信號(hào),是將配體識(shí)別信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的橋梁。通常所使用的跨膜結(jié)構(gòu)域與鉸鏈區(qū)或胞內(nèi)的共刺激結(jié)構(gòu)域是重合的,CD8α分子、CD28分子或ICOS分子的跨膜區(qū)在CAR中較常見(jiàn)。

CAR的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域在啟動(dòng)配體識(shí)別觸發(fā)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域由共刺激結(jié)構(gòu)域(costimulatory domain)(或共刺激分子)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(signaling domain)組成。共刺激結(jié)構(gòu)域在產(chǎn)生T細(xì)胞活化的第二信號(hào)中起關(guān)鍵作用,第二信號(hào)還可增強(qiáng)第一信號(hào)的作用,雙重信號(hào)的共同刺激可使T細(xì)胞完全活化,有效地延長(zhǎng)存活,維持增殖,并促進(jìn)細(xì)胞因子釋放。已知的T細(xì)胞共刺激分子包括CD28、4-1BB、ICOS、CD134分子等。目前運(yùn)用最多的是CD28和4-1BB分子。

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域主要是T細(xì)胞受體TCR/CD3的ζ鏈,CD3ζ鏈?zhǔn)且粋€(gè)具有誘導(dǎo)酪氨酸激酶功能的結(jié)構(gòu)域,它包含3個(gè)免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs, ITAMs),是磷酸化位點(diǎn),它能募集一種蛋白激酶ZAP70,雙重磷酸化ITAM,導(dǎo)致信號(hào)級(jí)聯(lián)的激活。CD3ζ鏈被認(rèn)為是所有CAR結(jié)構(gòu)中必須包括的一個(gè)內(nèi)部結(jié)構(gòu)域。在T細(xì)胞中,ITAM的數(shù)量和多樣性以及功能性CD3ζ對(duì)于優(yōu)化信號(hào)傳導(dǎo)至關(guān)重要［5-8]。

1.2 CAR-T的迭代更新 人們現(xiàn)階段主要根據(jù)CAR不同的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)將CAR分為4代。第一代CAR的胞內(nèi)區(qū)只采用CD3ζ鏈,TCR與CD3分子構(gòu)成復(fù)合物后通過(guò)CD3ζ鏈傳遞激活T細(xì)胞的第一信號(hào),只有基本的識(shí)別靶抗原和激活T細(xì)胞的功能。T細(xì)胞存活時(shí)間短,增殖能力低,對(duì)腫瘤細(xì)胞無(wú)殺傷功能或殺傷功能較弱,所以第一代CAR-T的臨床結(jié)果并不理想［9],并未引起人們的重視。

隨著對(duì)T細(xì)胞活化過(guò)程的進(jìn)一步研究,研究人員發(fā)現(xiàn)共刺激分子提供的第二信號(hào)對(duì)于T細(xì)胞的活化至關(guān)重要。因此,第二代的CAR-T使用了一個(gè)共刺激分子,目前在臨床上,只有CD28和4-1BB用于商業(yè)上第二代CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品。大規(guī)模臨床試驗(yàn)結(jié)果表明,表達(dá)CD28和4-1BB的CAR-T具有相似的抗癌活性,同時(shí)兩者的功能和毒副效應(yīng)具有差異性。通常表達(dá)CD28共刺激結(jié)構(gòu)域的CAR驅(qū)動(dòng)更強(qiáng)大的T細(xì)胞擴(kuò)增,促進(jìn)效應(yīng)譜系細(xì)胞分化,顯著提升T細(xì)胞的殺傷效果,但持久性低［10]。而表達(dá)4-1BB的CAR-T與靶抗原結(jié)合后分裂速度較慢,更多表現(xiàn)為記憶表型,降低CAR-T細(xì)胞的耗竭率,提高其在體內(nèi)的存活時(shí)間［11-13]。隨著第二代靶向CD19的CAR-T細(xì)胞的改進(jìn)以及國(guó)際臨床試驗(yàn)的成功進(jìn)行,2017年FDA批準(zhǔn)了首款CAR-T細(xì)胞療法產(chǎn)品上市［14]。目前全球已經(jīng)上市7款CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品,均為第二代CAR-T細(xì)胞［15]。

第三代CAR-T包含了兩種不同的共刺激分子,目的是進(jìn)一步提高T細(xì)胞在體內(nèi)的存續(xù)性和細(xì)胞毒性［16]。根據(jù)實(shí)驗(yàn),第三代CAR-T相比于第二代展現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞因子釋放、更長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間以及更好的腫瘤根除能力［17]。然而,第三代CAR-T相對(duì)于第二代CAR-T的優(yōu)勢(shì)目前仍然是一個(gè)充滿爭(zhēng)議的話題［18],其引起的細(xì)胞因子釋放綜合征(CRS)等安全性問(wèn)題的發(fā)生率明顯增加,這可能歸因于兩個(gè)共刺激域的重復(fù)信號(hào)傳遞,目前第三代CAR-T在臨床上仍未普及［19]。具有CD28和4-1BB共刺激分子的CAR-T細(xì)胞是最常用的第三代CAR-T細(xì)胞。其他共刺激分子如OX-40和ICOS也用于各種研究中,不同共刺激結(jié)構(gòu)域可以誘導(dǎo)T細(xì)胞分化或產(chǎn)生細(xì)胞因子,同時(shí)共刺激結(jié)構(gòu)域的順序不同也可以使CAR-T細(xì)胞的功能產(chǎn)生差異,從而影響其抗腫瘤效應(yīng)［20]。

第四代CAR-T又稱(chēng)通用細(xì)胞因子介導(dǎo)殺傷的重定向T細(xì)胞(T cell redirected for universal cytokine-mediated killing, TRUCKs),在二/三代的基礎(chǔ)上整合結(jié)構(gòu)性或誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)基因信號(hào),例如細(xì)胞因子和趨化因子的信號(hào),從而使其具有促進(jìn)T細(xì)胞增殖、提升T細(xì)胞效應(yīng)能力、趨化效應(yīng)細(xì)胞至靶細(xì)胞周?chē)哪芰?如細(xì)胞因子IL-7、IL-12、趨化因子CCL19等;或者加入自殺基因,在出現(xiàn)不良反應(yīng)時(shí)可誘導(dǎo)CAR-T細(xì)胞自我毀滅。改進(jìn)后的四代CAR-T,能夠招募和活化更多的免疫細(xì)胞,抵抗腫瘤微環(huán)境,擴(kuò)大局部腫瘤殺傷效果［21- 22]。目前,第四代CAR-T的功能和療效仍在進(jìn)一步探索中,其設(shè)計(jì)也在不斷完善,諸多問(wèn)題尚待解決。

1.3 新一代CAR-T 通用型CAR-T細(xì)胞(universal chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy,UCAR-T),是將特異性的CAR引入健康人同種異體T細(xì)胞中的技術(shù),即經(jīng)過(guò)基因編輯的同種異體CAR-T細(xì)胞,屬于“現(xiàn)貨型”或“off-the-shelf”產(chǎn)品。該技術(shù)可使用siRNAs來(lái)沉默供體細(xì)胞中MHC-I、MHC-II、TCR和免疫檢查點(diǎn)分子的表達(dá),這種沉默使它們不易于被宿主的免疫系統(tǒng)識(shí)別,從而降低并減少了引起移植物抗宿主病(graft-versus-host-disease,GVHD)和宿主抗移植物反應(yīng)(host-versus-graft-reaction,HVGR)等免疫排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn),提高UCAR-T細(xì)胞在受體體內(nèi)的存活能力,緩解免疫抑制對(duì)T細(xì)胞的耗損,提高UCAR-T細(xì)胞的功能［23]。UCAR-T細(xì)胞的研究,一方面解決了自體CAR-T細(xì)胞的T細(xì)胞取材過(guò)程復(fù)雜、制備時(shí)間較長(zhǎng)、成本高的弊端;另一方面還可抑制T細(xì)胞耗盡、減少CAR-T細(xì)胞的靶毒性,進(jìn)而提高CAR-T細(xì)胞的活性水平和毒性［24],有望形成下一代CAR-T技術(shù),給癌癥治療領(lǐng)域帶來(lái)了全新的診治思維與前景。

另外,隨著CAR-T細(xì)胞療法取得了革命性的成功,科學(xué)家對(duì)基于CAR細(xì)胞治療的其他效應(yīng)細(xì)胞展開(kāi)了大量研究,自然殺傷細(xì)胞(natural killer cells,NK)和巨噬細(xì)胞(macrophages,Mφ)由于良好的性能,成為制造下一代CAR細(xì)胞的兩個(gè)候選細(xì)胞。與T細(xì)胞不同的是,它們是固有免疫系統(tǒng)的成員,可以在沒(méi)有MHC的情況下直接識(shí)別靶細(xì)胞,也不會(huì)引起GVHD。嵌合抗原受體NK細(xì)胞(chimeric antigen receptor natural killer cells,CAR-NK)具有來(lái)源廣泛、制備時(shí)間短、安全性可靠、應(yīng)用范圍廣泛、毒副風(fēng)險(xiǎn)低等優(yōu)點(diǎn);而嵌合抗原受體巨噬細(xì)胞(chimeric antigen receptor macrophages,CAR-M)則比CAR-T和CAR-NK在免疫抑制性微環(huán)境中更容易浸潤(rùn)腫瘤,進(jìn)而調(diào)控腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophage,TAM)的比例和表型,扭轉(zhuǎn)抑制性腫瘤微環(huán)境,創(chuàng)造促炎環(huán)境,發(fā)揮積極抗腫瘤作用。隨著研究的繼續(xù)深入,CAR-NK與CAR-M可能會(huì)成為CAR-T的補(bǔ)充和替代療法,并有望成為治療實(shí)體瘤的一種有效策略［25-27]。

2 CAR-T的制備方法

臨床上自體CAR-T細(xì)胞的生產(chǎn)是通過(guò)多種方法進(jìn)行的,這些方法都包含相同的常規(guī)步驟:從患者身上分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs),從PBMCs中分離出T淋巴細(xì)胞,利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、病毒載體等方法將CAR基因?qū)隩細(xì)胞中形成CAR-T細(xì)胞,再通過(guò)體外擴(kuò)增CAR-T細(xì)胞到治療所需的細(xì)胞數(shù)量,再重新注入患者體內(nèi)進(jìn)行治療。臨床前研究中的制備過(guò)程也大致相同。常規(guī)CAR-T療法開(kāi)發(fā)流程包括靶標(biāo)抗原的選擇和鑒定、CAR結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)與合成、CAR基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)、CAR-T細(xì)胞的擴(kuò)增和培養(yǎng)。盡管在目前的試驗(yàn)中,該過(guò)程的總體輪廓是相似的,但在制造CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的過(guò)程中,仍有各種各樣的選擇,該過(guò)程遠(yuǎn)未標(biāo)準(zhǔn)化,通常需要大量的人工處理步驟［28]。

2.1 篩選靶抗原與單鏈抗體scFv的產(chǎn)生 ①抗原篩選:首先需要選擇與目標(biāo)疾病相關(guān)的靶標(biāo)抗原(通常是腫瘤相關(guān)抗原TAA),并對(duì)該抗原在正常組織中的表達(dá)情況進(jìn)行評(píng)估,從而篩選出特異性強(qiáng)而毒副作用弱的靶標(biāo)抗原。②獲得特異性高的抗體:可通過(guò)單克隆抗體開(kāi)發(fā)或從文庫(kù)中篩選已知的抗體,選擇特異性高、穩(wěn)定性好、親和力適當(dāng)?shù)目贵w作為CAR的抗原識(shí)別部分。③對(duì)獲得的單克隆抗體的單鏈可變片段(scFv)基序列進(jìn)行測(cè)序分析。④分離純化T細(xì)胞,對(duì)其進(jìn)行測(cè)序,找到T細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)活化受體的區(qū)域序列。

2.2 CAR的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和合成 通過(guò)基因工程技術(shù)將識(shí)別TAA的單克隆抗體的單鏈可變片段(scFv)基因序列與鉸鏈區(qū)/跨膜域、TCR/CD3ζ和CD28或4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域的受體基因序列在體外進(jìn)行重組,形成完整的CAR基因。此外,如前所述CAR分子結(jié)構(gòu)的每一個(gè)部分都相對(duì)獨(dú)立并協(xié)同影響CAR-T細(xì)胞的功能,對(duì)其活化、持久性、抗腫瘤作用及毒副作用至關(guān)重要,因此還需考慮CAR信號(hào)傳遞和激活的機(jī)制等因素,對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化,如跨膜結(jié)構(gòu)域和鉸鏈結(jié)構(gòu)域的差別,會(huì)影響CAR的表達(dá)從而影響CAR-T功能發(fā)揮,進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,研究表明精心設(shè)計(jì)CAR的結(jié)構(gòu)以及選擇驅(qū)動(dòng)CAR基因表達(dá)的啟動(dòng)子可以改善CAR的表達(dá)［29]。一般以scFv和共刺激分子為切入點(diǎn),根據(jù)靶向的抗原的不同設(shè)計(jì)和優(yōu)化CAR分子。除了對(duì)“經(jīng)典”CAR結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾以外,研究還探索了新型的設(shè)計(jì)策略,如多抗原靶向(針對(duì)抗原逃逸的雙價(jià)串聯(lián)CAR)、門(mén)控邏輯:“AND”門(mén)與“NOT”門(mén)(能特異性識(shí)別正常組織的CAR),攜帶自殺基因的CAR等。CAR分子的設(shè)計(jì)包含了多個(gè)模塊,其胞內(nèi)和胞外結(jié)構(gòu)域的優(yōu)化設(shè)計(jì)一直在研究中［30]。

2.3CAR基因的轉(zhuǎn)導(dǎo) 合成CAR基因后,最關(guān)鍵的一步是通過(guò)體內(nèi)或體外的方式將mRNA傳遞并整合到T細(xì)胞中,使T細(xì)胞表達(dá)CAR。CAR基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)方式可分為病毒方式和非病毒方式,包括轉(zhuǎn)座子/轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)、體外轉(zhuǎn)錄的mRNA和病毒載體等。病毒載體是最常用的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法,慢病毒載體(lentiviral vectors, LV)在其中占主導(dǎo)地位,而逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(gamma retroviral vectors, GRV)是第二常用的方法。這兩種方法都可以產(chǎn)生安全有效的產(chǎn)品,且轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高。兩種載體的主要區(qū)別在于GRV載體只能感染分裂細(xì)胞,而LV載體還可以感染靜止細(xì)胞［31],具有能穩(wěn)定表達(dá)外源基因、感染譜廣泛等優(yōu)點(diǎn)。LV載體通常通過(guò)使用大量質(zhì)粒DNA(pDNA)進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染而產(chǎn)生,所以LV載體比使用穩(wěn)定包裝細(xì)胞系生產(chǎn)的GRV載體更昂貴。病毒載體的處理過(guò)程始于生產(chǎn)細(xì)胞系的擴(kuò)增,例如HEK293T細(xì)胞。通過(guò)分子克隆的方式將目的基因連接到慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒中,構(gòu)建重組慢病毒表達(dá)載體,然后將攜帶目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染生產(chǎn)細(xì)胞系,以轉(zhuǎn)移制備病毒顆粒所需的基因。轉(zhuǎn)染后,從細(xì)胞上清中收獲產(chǎn)生的病毒顆粒,通過(guò)離心濃縮獲得高滴度的慢病毒。通常使用抗CD3/CD28抗體結(jié)合珠活化T細(xì)胞,激活后與濃縮的慢病毒顆粒共培養(yǎng),CAR治療基因通過(guò)病毒轉(zhuǎn)染被整合到靶T細(xì)胞基因組中,實(shí)現(xiàn)外源基因的持續(xù)穩(wěn)定表達(dá),以產(chǎn)生功能齊全的CAR-T細(xì)胞,然后再培養(yǎng)擴(kuò)增CAR-T細(xì)胞。

3 CAR-T細(xì)胞面臨的挑戰(zhàn)

3.1 CAR-T細(xì)胞制造中的問(wèn)題 CAR-T細(xì)胞的體外生產(chǎn)流程是一個(gè)復(fù)雜且受到嚴(yán)格控制的過(guò)程。首先,CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品作為“活的、自體的”生物藥品,其生產(chǎn)方式的安全性、穩(wěn)定性、質(zhì)量控制、個(gè)體差異性等方面需要特殊考量,目前CAR-T細(xì)胞的生產(chǎn)技術(shù)尚未標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化,仍在一步步地探索中。其次,該生產(chǎn)全過(guò)程無(wú)菌要求高,一般的制備流程需2～4周,制造周期長(zhǎng)往往難以使患者得到及時(shí)治療［32]。優(yōu)化CAR-T細(xì)胞制造過(guò)程的一個(gè)重要途徑是縮短制造時(shí)間。陸軍軍醫(yī)大學(xué)研究的Fast CAR-T(F-CAR-T)次日制造平臺(tái)顯著縮短了CAR-T的制備時(shí)間,最近在B細(xì)胞ALL的臨床試驗(yàn)中進(jìn)行了評(píng)估(NCT03825718),與傳統(tǒng)的CAR-T細(xì)胞相比,CD19 F-CAR-T細(xì)胞在臨床前研究中表現(xiàn)出良好的增殖性,細(xì)胞表型更年輕,消耗更少,腫瘤清除更有效,顯著減少制造時(shí)間和成本［33]。

在CAR-T制造中,CAR基因傳遞目前最常用的是病毒載體系統(tǒng),但鑒于病毒載體的基因傳遞方法復(fù)雜且昂貴,并且存在插入誘變的風(fēng)險(xiǎn),開(kāi)發(fā)基因傳遞的無(wú)病毒平臺(tái)是優(yōu)化CAR-T細(xì)胞制造過(guò)程的另一個(gè)重要途徑。轉(zhuǎn)座子/轉(zhuǎn)座酶是基因治療領(lǐng)域較新的表達(dá)系統(tǒng),這是一種非病毒的、基于質(zhì)粒的基因傳遞方法,該方法具有高效安全,毒副作用低的特點(diǎn),備受研究者青睞［34]。如睡美人(sleeping beauty,SB)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)和piggyBac(PB)轉(zhuǎn)座子［35-36],SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)已被用于生產(chǎn)Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)的CAR-T細(xì)胞［37-38]。與使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體相比,基于轉(zhuǎn)座子/轉(zhuǎn)座酶的基因傳遞可以攜帶更大的遺傳結(jié)構(gòu),同時(shí)能整合靶基因,且具有顯著的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)。

基因編輯技術(shù)是一種很有前途的新方法,不僅適用于產(chǎn)生基因工程的自體CAR-T細(xì)胞,也適用于“現(xiàn)貨型”同種異體CAT-T細(xì)胞,這可能解決自體T細(xì)胞療法固有的制造挑戰(zhàn)和成本過(guò)高的問(wèn)題。CRISPR-Cas9是當(dāng)前使用最為廣泛的基因編輯技術(shù),已被用于癌癥患者產(chǎn)生和臨床應(yīng)用具有可耐受不良事件的CAR-T細(xì)胞［39-40]。CRISPR-Cas9可通過(guò)敲除免疫檢查點(diǎn)分子或其他抑制性調(diào)節(jié)因子等,改善體內(nèi)CAR-T細(xì)胞的存續(xù)性。如定向刪除CBL-B(一種免疫激活的負(fù)調(diào)節(jié)因子)顯示可恢復(fù)T細(xì)胞耗竭并增強(qiáng)IFN-g和TNF-a水平以及CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞毒性［41]。在CAR-T的生產(chǎn)制造中,對(duì)CRISPR-Cas9進(jìn)行更全面的研究,以提高CAR-T細(xì)胞療法的安全性、有效性和可及性,可能會(huì)在臨床上帶來(lái)理想的治療結(jié)果［42-43]。

“體內(nèi)構(gòu)建”/“體內(nèi)重編程”的體內(nèi)CAR-T制備是另一種新興方法,與體外生成CAR-T相比可以節(jié)省時(shí)間、提高可及性和降低制造成本。在這種方法中,編碼CAR的體內(nèi)遞送載體:病毒載體［44-45]或納米顆粒載體［46-47]能夠特異性識(shí)別并結(jié)合患者的T細(xì)胞,進(jìn)行CAR基因轉(zhuǎn)導(dǎo)或進(jìn)行基因組整合實(shí)現(xiàn)體內(nèi)細(xì)胞的重編程,從而在體內(nèi)生成CAR-T細(xì)胞并清除腫瘤細(xì)胞［48],由于該CAR-T細(xì)胞是在體內(nèi)生成的,故在一定程度上可以避免移植物與宿主的反應(yīng),該方法不僅操作相對(duì)簡(jiǎn)單,而且還可以規(guī)避制造耗時(shí)長(zhǎng)和成本過(guò)高等問(wèn)題。

3.2 毒副作用和不良反應(yīng) CAR-T細(xì)胞治療后觀察到的最常見(jiàn)毒副作用或不良反應(yīng)是細(xì)胞因子釋放綜合征(cytokine release syndrome,CRS)、免疫效應(yīng)細(xì)胞相關(guān)神經(jīng)毒性綜合征(immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome,ICANS)和腫瘤溶解綜合征(tumor lysis syndrome,TLS)等,且其發(fā)生機(jī)制均不完全清楚。毒副作用的限制是目前CAR-T廣泛使用以及影響其療效的重要因素之一,也是目前急需攻克的難題,并且隨著接受CAR-T治療以及隨訪的病例數(shù)增多,逐漸觀察到長(zhǎng)期毒副作用,如持續(xù)性B細(xì)胞耗竭或發(fā)育不全、低丙種球蛋白血癥、白細(xì)胞減少癥和感染、腦水腫等,但值得注意的是,其長(zhǎng)期毒性作用小或有限,所以我們對(duì)CAR-T療法依然持樂(lè)觀態(tài)度［49-50]。

目前對(duì)CAR-T的不良反應(yīng)的應(yīng)對(duì)措施主要包括對(duì)癥支持治療和免疫抑制劑等。繼續(xù)優(yōu)化CAR的結(jié)構(gòu)或與其他治療方法聯(lián)合等方法的進(jìn)一步研究,以降低不良反應(yīng)的影響,提高CAR-T治療效果,才能使更多患者受益。

3.3 實(shí)體瘤適用性不佳 CAR-T療法在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療中取得了顯著的成果,但對(duì)于占所有癌癥90%的實(shí)體瘤而言,其治療效果有限,到目前為止臨床尚無(wú)獲批產(chǎn)品。其次,即使找到特異性的腫瘤抗原,CAR-T細(xì)胞也可能受限于腫瘤低表達(dá)趨化因子,而導(dǎo)致T細(xì)胞定向運(yùn)輸和浸潤(rùn)不足。另一個(gè)重要的挑戰(zhàn)是腫瘤免疫抑制性微環(huán)境TME,TME中存在著多種免疫抑制性細(xì)胞和細(xì)胞因子,能促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)并限制CAR-T功能,也會(huì)因腫瘤抗原丟失而削弱特異性識(shí)別［51-53]。

鑒于以上障礙和局限性,科學(xué)家不斷嘗試新的方法并展開(kāi)了大量研究,如進(jìn)一步優(yōu)化改進(jìn)CAR的結(jié)構(gòu)或開(kāi)發(fā)其他效應(yīng)細(xì)胞。如Meyran等［54]開(kāi)發(fā)了一種生成功能性干細(xì)胞樣CAR-T細(xì)胞(TSTEM-likeCAR-T cells)的方案,具有增強(qiáng)增殖潛能、體內(nèi)持久性和腫瘤控制能力的特點(diǎn),CAR-T細(xì)胞接受抗原刺激后增殖能力增強(qiáng)且細(xì)胞因子分泌增加,其過(guò)繼轉(zhuǎn)移能加強(qiáng)腫瘤的控制和對(duì)臨床前模型中腫瘤再攻擊的抵抗,結(jié)合抗PD-1治療可以根除已形成的腫瘤。Tousley等［55]將布爾邏輯門(mén)控應(yīng)用于CAR-T細(xì)胞,設(shè)計(jì)了邏輯門(mén)控細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)(LINK)CAR,能有效區(qū)分正常組織與癌變組織,使得CAR-T技術(shù)更有效根治實(shí)體瘤,同時(shí)防治脫靶和腫瘤外毒性。

4 CAR-T細(xì)胞的改進(jìn)策略

適當(dāng)?shù)腃AR組成和結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)可以減少脫靶效應(yīng),增強(qiáng)腫瘤的根除和持久性,然而,雖然人們認(rèn)識(shí)到這些CARs結(jié)構(gòu)和特征的微小變化可能是關(guān)鍵的功能決定因素,但這些因素之間的關(guān)系很復(fù)雜,目前還沒(méi)有通用的設(shè)計(jì)規(guī)則可以預(yù)測(cè)其在體內(nèi)的功能。

4.1 改善CAR-T細(xì)胞抗原識(shí)別 除了對(duì)“經(jīng)典”CAR結(jié)構(gòu)部件進(jìn)行修飾之外,許多研究還探索了其他的設(shè)計(jì)策略［56]。含有邏輯門(mén)控的下一代CAR可以通過(guò)組合抗原,優(yōu)化識(shí)別能力,更好的區(qū)分腫瘤組織和健康組織,同時(shí)提高抗原覆蓋率克服抗原逃逸。如雙特異性CAR-T細(xì)胞靶向兩種不同的TAA,具有優(yōu)越的抗原識(shí)別能力,可以同時(shí)靶向兩個(gè)或多個(gè)不同的細(xì)胞群,當(dāng)一種抗原丟失時(shí),腫瘤的殺傷能力仍然可以保持［57]。Larson等［58]使用初始/記憶性T細(xì)胞(na?ve/memory T cells TN/MEM)表達(dá)雙特異性抗CD19/CD20在治療復(fù)發(fā)或難治性非霍奇金淋巴瘤(NCT04007029)的Ⅰ期試驗(yàn)中展現(xiàn)出極富前景的應(yīng)用價(jià)值,該雙特異性CAR-T具有穩(wěn)定的安全性和耐受性,可能是增強(qiáng)抗原識(shí)別能力、改善CAR-T細(xì)胞持久性和克服抗原逃逸的有效策略。為了提高CAR-T的敏感性和抗腫瘤能力,CAR的模式不斷從單靶點(diǎn)、雙靶點(diǎn)向多靶點(diǎn)過(guò)渡,但由于腫瘤相關(guān)抗原數(shù)量有限,而腫瘤特異性抗原(tumor-specific antigen,TSA)極為稀缺,尋找在腫瘤細(xì)胞上穩(wěn)定表達(dá)的特異性新抗原是目前CAR-T療法中的研究熱點(diǎn)［59],目前靶向EB病毒潛伏膜蛋白(epstein-barr virus latent membrane protein 1,LMP1)、黑色素瘤抗原基因(melanoma antigen gene,MAGE)、死亡受體5(death receptor 5,DR5)等各種新靶點(diǎn)CAR-T臨床試驗(yàn)也在進(jìn)行中［60]。然而,這種方法目前受到腫瘤抗原數(shù)量限制,但隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,未來(lái)將發(fā)現(xiàn)更多的腫瘤相關(guān)抗原和腫瘤特異性抗原,從而使更多患者受益。

4.2 增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的持久性 由于腫瘤微環(huán)境中過(guò)多的抑制性因素可以負(fù)面影響CAR-T的存活、浸潤(rùn)和活性,從而導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞功能減退和過(guò)早耗竭,因此提高CAR-T細(xì)胞的持久性仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。到目前為止,許多研究已經(jīng)取得了明顯的突破。如第四代CAR-T增強(qiáng)的細(xì)胞因子分泌和表達(dá)能力可抵抗或消除TME中的免疫抑制環(huán)境,克服T細(xì)胞耗竭。另外通過(guò)基因編輯工具CRISPR-Cas9對(duì)同種異體CAR-T細(xì)胞(也稱(chēng)異基因allo CAR-T)進(jìn)行操作,在一定程度上可實(shí)現(xiàn)CAR-T細(xì)胞功能的增強(qiáng)。Hu等［61]利用CRISPR-Cas9編輯生成人類(lèi)低免疫(HIP)T細(xì)胞,并在此基礎(chǔ)上制備HIP CAR-T細(xì)胞,結(jié)果顯示HIP CAR-T細(xì)胞在腫瘤清除的持久性以及CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增和持久性方面明顯優(yōu)于未修飾的allo CAR-T細(xì)胞。

4.3 增加CAR-T細(xì)胞向腫瘤部位的定向遷移 在癌癥中,趨化因子及其受體對(duì)免疫細(xì)胞的遷移及浸潤(rùn)具有重要作用,如在腫瘤微環(huán)境中,腫瘤細(xì)胞上高表達(dá)趨化因子受體的配體,在調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞遷移到腫瘤中的模式起著關(guān)鍵作用,形成腫瘤微環(huán)境的免疫特征,通常朝向促腫瘤形成狀態(tài)。癌癥趨化因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是一種新技術(shù),可提高腫瘤部位免疫細(xì)胞的募集率,由于其趨化特性,它們能夠調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞和體細(xì)胞的遷移和運(yùn)輸。趨化因子受體如CXCR1［62]、CXCR2［63]、CXCR6［64]等在CAR-T細(xì)胞中的表達(dá),具有增強(qiáng)T細(xì)胞活化和腫瘤浸潤(rùn)效果,使腫瘤消退、延長(zhǎng)生存期。

5 展望

CAR-T細(xì)胞療法應(yīng)用前景十分廣闊,但目前仍存在諸多障礙,如CAR-T的生產(chǎn)效率低、耗費(fèi)高、存在嚴(yán)重的毒副反應(yīng)、在實(shí)體瘤方面應(yīng)用不佳等問(wèn)題。但隨著CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)技術(shù)的不斷完善和成熟,新型CAR的開(kāi)發(fā)和下一代CAR的探索,都可能克服目前的局限性和障礙,從而進(jìn)一步拓寬CAR-T細(xì)胞療法的應(yīng)用范圍,推動(dòng)這一療法朝著新的領(lǐng)域和重大的突破前進(jìn),使其安全、有效、廣泛應(yīng)用于人體腫瘤或非腫瘤等疾病的治療中,以便更多的患者能夠獲益。