陜西省小麥不同部位鐮刀菌分離鑒定及毒素化學(xué)型分析

左宏旭,雷 瓊,劉叩晗,王欣桐,王保通

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實驗室,陜西楊凌 712100;2.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程分院,陜西楊凌 712100)

鐮刀菌屬(Fusariumspp.)真菌可使小麥穗部、莖稈和莖基部分別產(chǎn)生赤霉病、稈腐病和莖基腐病,同時其產(chǎn)生的鐮刀菌毒素不僅嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量和品質(zhì),也危害人畜健康,是制約中國小麥產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要因素[1-2]。

小麥赤霉病由鐮刀菌復(fù)合群引起,其中禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)為優(yōu)勢病原菌[3-4]。20世紀(jì)80年代,全國小麥赤霉病研究協(xié)作組對國內(nèi)21個省(直轄市、自治區(qū))的小麥赤霉病病原菌進(jìn)行了調(diào)查,認(rèn)為國內(nèi)小麥赤霉病病原菌至少存在18種,其中禾谷鐮刀菌占比高達(dá)約94.5%[5]。受地域氣候以及作物輪作的影響,不同麥區(qū)的小麥赤霉病優(yōu)勢病原菌不同,西北麥區(qū)、華北麥區(qū)、黃淮麥區(qū)及其以北的麥區(qū)以禾谷鐮刀菌為優(yōu)勢病原菌,而長江中下游麥區(qū)的優(yōu)勢病原菌為亞洲鐮刀菌(F.asiaticum)[6]。與小麥赤霉病相比,小麥稈腐病研究較少,但兩種病害由相同的病原菌引起[7];小麥莖基腐病與赤霉病和稈腐病也有部分相似的病原菌,也因地域氣候的不同存在不同的病原菌種群,但假禾谷鐮刀菌(F.pseudograminearum)是小麥莖基腐病的優(yōu)勢病原菌[8-12]。因此,鐮刀菌屬病原菌可侵染小麥的不同部位,部分病原菌能夠同時侵染小麥的穗部、莖稈和莖基部,這使得小麥赤霉病、稈腐病和莖基腐病可能互相成為侵染源,加重整株小麥的患病率和病害嚴(yán)重度。

B型單端孢霉烯族毒素是鐮刀菌產(chǎn)生的主要毒素,主要可分為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)和雪腐鐮刀菌烯醇(nivalenol, NIV)兩類毒素,其中DON毒素存在兩種乙?；苌?分別為3-乙酰DON(3-ADON)和15-乙酰DON(15-ADON)[13]。禾谷鐮刀菌產(chǎn)生的毒素大多為15-ADON[14-15],少數(shù)為3-ADON和NIV[16]。

2010年以來,全國大力推行秸稈還田政策,導(dǎo)致小麥病殘體上的病原菌大量繁殖,極大增加了鐮刀菌越冬菌群的數(shù)量,成為來年的初侵染源[17]。因此,探究小麥不同部位鐮刀菌的病原菌種類及其毒素化學(xué)型對于大田精確防治鐮刀菌病害及種群動態(tài)監(jiān)測具有重要意義。本研究對陜西省部分地區(qū)小麥進(jìn)行取樣分析,明確其穗部、莖稈和莖基部的鐮刀菌病原菌種類及其毒素化學(xué)型,以期為制定大田綜合防治策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

于2022年小麥灌漿期,從陜西省渭南市、寶雞市、咸陽市和西安市采集小麥發(fā)病樣本,選擇在穗部、莖稈和莖基部至少有一處發(fā)病的小麥,采用棋盤式取樣法在每個采樣田塊中隨機(jī)選取10～15株具有明顯發(fā)病癥狀的小麥,用信封袋封裝、編號并留存。

1.2 病原菌的分離與純化

采用組織分離法對采集到的樣本進(jìn)行病原菌分離,將發(fā)病癥狀明顯的部位于病健交界處裁剪成邊長約5 cm的小方塊,先置于2%的次氯酸鈉溶液中浸泡消毒1 min,再用75%的酒精消毒20 s,無菌水沖洗3次[18],然后用滅菌濾紙吸干水分后將樣品接種于PDA培養(yǎng)基中,置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。

依據(jù)菌落顏色和形態(tài)對分離到的真菌進(jìn)行初步判斷,在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 d后產(chǎn)生棉白色絲狀菌絲,3 d后菌落產(chǎn)生淺洋紅色色素,5～7 d后菌絲長滿整個培養(yǎng)基,色素變?yōu)樽霞t色的菌株初步斷定為鐮刀菌[19]。將這些候選鐮刀菌的菌餅接種至CMC液體培養(yǎng)基中,25 ℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)3 d后,用濾紙濾去菌絲得到孢子懸浮液,在顯微鏡下可觀察到這些孢子有隔膜且呈鐮刀狀,將孢子懸液濃度稀釋至1×103個·mL-1;制備3%的水瓊脂并用無菌刀片分割成邊長為3 mm的小方塊,吸取1 μL稀釋后的孢子懸液點(diǎn)于其上[19]。在顯微鏡下選取僅有一個分生孢子的瓊脂塊,將其接種于PDA培養(yǎng)基上,25 ℃培養(yǎng)3 d,即為純化的鐮刀菌病原菌。

1.3 病原菌分子鑒定

采用真菌基因組DNA小量快速提取的方法[20]提取分離純化的病原菌基因組DNA,并以此為模板,采用真菌核糖體DNA(rDNA)的ITS區(qū)段通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[21]。PCR反應(yīng)體系為50 μL,包括2×M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix 25 μL,ITS1和ITS4引物各2 μL,DNA模板1 μL,ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性25 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35個循環(huán);72 ℃再延伸5 min,4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物交由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序,將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對。

1.4 鐮刀菌毒素化學(xué)型的鑒定

采用引物Tri13P1(5’-CTCSACCGCATCGAAGASTCTC-3’)和Tri13P2(5’-GAASGTCGCARGACCTTGTTTC-3’)對鐮刀菌產(chǎn)毒化學(xué)型進(jìn)行分析[22]。PCR反應(yīng)體系為25 μL,包括2×M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix 12.5 μL,Tri13P1和Tri13P2引物各1 μL,DNA模板0.5 μL,ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性1 min,58 ℃退火40 s,72 ℃延伸40 s,共35個循環(huán);72 ℃再延伸6 min,4 ℃保存[22]。用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。3-ADON型、15-ADON型和NIV型菌株的預(yù)期擴(kuò)增片段長度分別為644、583和859 bp[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥不同部位鐮刀菌種群的分布

結(jié)合菌落形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定,通過單孢分離技術(shù)共分離到156株鐮刀菌菌株(表1),部分鐮刀菌的PCR結(jié)果見圖1。從穗部分離到62株菌株,其中禾谷鐮刀菌56株,黃色鐮刀菌(F.culmorum)4株,亞洲鐮刀菌2株,分別占比90.32%、6.45%和3.23%;從莖稈分離到43株菌株,其中禾谷鐮刀菌39株,黃色鐮刀菌4株,分別占比90.70%和9.30%;從莖基部分離到51株菌株,其中假禾谷鐮刀菌43株,三線鐮刀菌(F.tricinctum)4株,禾谷鐮刀菌3株,層出鐮刀菌(F.proliferatum)1株,分別占比84.32%、7.84%、5.88%和1.96%(表2)。

M:DL2000;1～11:鐮刀菌菌株;N:陰性對照。M:DL2000; 1-11: Fusarium strains; N: Negative control.圖1 部分鐮刀菌菌株ITS區(qū)段的PCR結(jié)果Fig.1 PCR results of ITS fragments in partial Fusarium strains

表1 供試菌株來源Table 1 Sources of the tested strains

表2 分離到的菌株分布及種群組成Table 2 Distribution and population composition of the isolated strains

上述結(jié)果說明,陜西省小麥鐮刀菌至少存在禾谷鐮刀菌、亞洲鐮刀菌、黃色鐮刀菌、假禾谷鐮刀菌、三線鐮刀菌和層出鐮刀菌6種菌株。發(fā)生在穗部的小麥赤霉病與發(fā)生在莖稈部的小麥稈腐病的優(yōu)勢病原菌一樣,均為禾谷鐮刀菌;而發(fā)生在莖基部的小麥莖基腐病則以假禾谷鐮刀菌為優(yōu)勢病原菌。禾谷鐮刀菌可同時侵染小麥的穗部、莖稈和莖基部,占分離菌株總數(shù)的62.82%,因此,禾谷鐮刀菌是造成陜西省小麥鐮刀菌病害的優(yōu)勢病原菌。

2.2 小麥不同部位鐮刀菌的毒素化學(xué)型

通過PCR檢測鐮刀菌毒素的化學(xué)型,部分菌株的PCR結(jié)果見圖2。在分離得到的156株鐮刀菌菌株中,產(chǎn)生15-ADON毒素的菌株102株,為15-ADON化學(xué)型,占比65.38%;產(chǎn)生3-ADON毒素的菌株54株,為3-ADON化學(xué)型,占比35.26%;未檢測到能夠產(chǎn)生NIV毒素的菌株(表3)。其中從莖稈分離到的一株黃色鐮刀菌菌株檢測到15-ADON和3-ADON兩種毒素化學(xué)型。

M:DL2000;1～23:鐮刀菌菌株;N:陰性對照。M: DL2000; 1-23: Fusarium strains; N: Negative control.圖2 部分鐮刀菌毒素的PCR結(jié)果Fig.2 PCR results of toxin in partial Fusarium strains

表3 分離到的鐮刀菌產(chǎn)毒化學(xué)型Table 3 Toxic chemotype of the isolated Fusarium strains

從穗部分離到的62株菌株中,15-ADON和3-ADON化學(xué)型分別占比70.97%和29.03%,56株禾谷鐮刀菌中,15-ADON和3-ADON化學(xué)型分別占比73.21%和26.79%;從莖稈分離到的43株菌株中,15-ADON和3-ADON化學(xué)型分別占比74.42%和27.91%,39株禾谷鐮刀菌中,15-ADON和3-ADON化學(xué)型分別占比74.36%和25.64%。通過對比發(fā)現(xiàn),這兩處部位禾谷鐮刀菌的毒素化學(xué)型占比接近,推測禾谷鐮刀菌侵染小麥穗部或莖稈對其毒素的化學(xué)型不具有選擇性。從小麥莖基部分離到的51株菌株中,15-ADON和3-ADON化學(xué)型分別占比50.98%和49.02%,與小麥穗部和莖稈的鐮刀菌毒素化學(xué)型占比存在明顯差異,43株假禾谷鐮刀菌中,15-ADON和3-ADON化學(xué)型分別占比48.84%和51.16%。在整株小麥上分離到的98株禾谷鐮刀菌中,15-ADON化學(xué)型占比74.49%;而43株假禾谷鐮刀菌中,15-ADON化學(xué)型僅占比48.84%。

3 討論

小麥赤霉病作為小麥穗部的重要病害,其病原鐮刀菌種群結(jié)構(gòu)在陜西省已有多年未被研究報道。與全國小麥赤霉病研究協(xié)作組在1975-1980年的研究結(jié)果[7]相比,本研究在穗部分離到的優(yōu)勢病原菌(禾谷鐮刀菌)占比降低了4.02%,且分離獲得了之前未有的黃色鐮刀菌和亞洲鐮刀菌,可見氣候和耕作方式的改變在一定程度上影響了陜西省小麥穗部鐮刀菌的種群結(jié)構(gòu)。與發(fā)生在穗部的小麥赤霉病相比,發(fā)生在莖稈的小麥稈腐病以及發(fā)生在莖基部的小麥莖基腐病的研究報道就顯得尤為稀少,在陜西省則更是鮮有報道。小麥稈腐病已經(jīng)在澳洲、北美等地區(qū)流行,引起了較為廣泛的關(guān)注[23],因此我們也應(yīng)重視該病害的發(fā)生與傳播。本研究結(jié)果表明,小麥稈腐病和赤霉病具有較為相似的鐮刀菌種群結(jié)構(gòu),盡管二者不同菌株占比存在差異,但在防治小麥赤霉病的同時,小麥稈腐病也可以被聯(lián)防,但還需要進(jìn)一步驗證。小麥莖基腐病則與赤霉病和稈腐病的鐮刀菌種群結(jié)構(gòu)差異較大,其優(yōu)勢病原菌為假禾谷鐮刀菌,這與朱運(yùn)啟等[24]的研究結(jié)果一致,但其占比下降了5.41%,原因可能與小麥揚(yáng)花期和灌漿期的氣候差異有關(guān)。綜合分析小麥這三個部位分離到的鐮刀菌,發(fā)現(xiàn)小麥莖基部對鐮刀菌種群結(jié)構(gòu)具有一定的選擇作用,這種選擇性可能與莖基部離土壤較近,受土壤中多種因素的影響有關(guān)。因此,小麥莖基腐病與赤霉病和稈腐病的防治方法不同,才能達(dá)到更為精確、高效的防治效果。

在鐮刀菌產(chǎn)生的毒素中,以DON毒素的產(chǎn)生量最多[25],其可干擾核糖體肽基轉(zhuǎn)移酶的活性,從而阻礙蛋白質(zhì)的合成[26]。本研究檢測到的鐮刀菌均為DON化學(xué)型,且大部分為15-ADON化學(xué)型。分析3-ADON和15-ADON化學(xué)型菌株的分布,發(fā)現(xiàn)小麥不同部位對鐮刀菌毒素化學(xué)型可能并不存在選擇性,小麥穗部和莖稈的鐮刀菌毒素化學(xué)型基本相同,而莖基部鐮刀菌毒素化學(xué)型與穗部和莖稈不同,原因可能是優(yōu)勢病原菌不同所造成的。除此之外,本研究在小麥莖稈上分離到一株可產(chǎn)生3-ADON和15-ADON兩種毒素化學(xué)型的黃色鐮刀菌,這一現(xiàn)象從未被報道,其對鐮刀菌毒素產(chǎn)生機(jī)制的研究可能存在潛在價值。

在過去,焚燒秸稈可快速消滅病殘體及其上面附著的病原菌,但隨著我國對環(huán)境保護(hù)要求的提高,秸稈還田取代了曾經(jīng)的焚燒秸稈。秸稈還田將秸稈營養(yǎng)返回田地的同時,也帶來了更多的初侵染源,造成病原菌菌源量的逐年累加[27],這也成為病害監(jiān)測預(yù)警模型建立的一個重要考量。本研究結(jié)果表明,禾谷鐮刀菌是陜西省整株小麥的鐮刀菌優(yōu)勢病原菌,其可同時侵染小麥穗部、莖稈和莖基部,在三個部位之間不斷產(chǎn)生分生孢子進(jìn)行再侵染;同時,秸稈還田使三個部位均為病原菌提供越冬場所,加重小麥鐮刀菌病害的嚴(yán)重度。因此,在未來監(jiān)測預(yù)警的模型建立中,不同部位的小麥鐮刀菌病害可以相互結(jié)合建立,以達(dá)到更加精準(zhǔn)的預(yù)警。本研究分析了小麥不同部位的鐮刀菌種群結(jié)構(gòu)和毒素化學(xué)型,為小麥鐮刀菌病害的大田精確防治及動態(tài)監(jiān)測預(yù)警提供了一定理論依據(jù),但不同部位鐮刀菌種群結(jié)構(gòu)與氣候、土壤等環(huán)境因素的具體關(guān)系,還需進(jìn)一步驗證。