小麥SPL家族基因在非生物脅迫下的表達(dá)分析

賀金秋,苗敬南,馬 超,樊紫薇,王超麗,李歡歡,趙 月,劉文軒

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南鄭州 450002)

SPL(SQUAMOSA promoter binding protein)是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,具有高度保守的SBP結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域由70～80個(gè)氨基酸構(gòu)成,具有2個(gè)鋅指位點(diǎn)(Cys-Cys-His和Cys-Cys-Cys-His)[1-2]。研究表明,SPL家族基因不僅參與植物生長(zhǎng)發(fā)育[3-6],還參與植物激素和光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物和非生物脅迫響應(yīng)等過(guò)程[7]。

前人已在擬南芥、水稻和玉米中分別鑒定到17、19和31個(gè)SPL基因家族成員[8]。在小麥中,多位學(xué)者也對(duì)SPL家族基因進(jìn)行了全基因組鑒定,除Li等[9]鑒定到48個(gè)SPL基因外,其他學(xué)者均鑒定到56個(gè)SPL基因[10-13]。部分小麥SPL基因的功能也得到深入研究。Liu等[14]利用基因編輯技術(shù)將TaSPL8基因敲除后,發(fā)現(xiàn)小麥植株葉片直立,葉枕結(jié)構(gòu)缺失;Li等[11]研究發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)TaSPL13基因會(huì)影響小麥的花序結(jié)構(gòu),導(dǎo)致小花和籽粒數(shù)量增加;Cao等[15]研究發(fā)現(xiàn),小麥TaSPL16基因可促進(jìn)擬南芥早開(kāi)花,并影響種子大小。SPL基因家族部分成員含有miR156結(jié)合位點(diǎn),在轉(zhuǎn)錄水平上受miR156負(fù)調(diào)控[16]。在模式植物擬南芥和水稻中,miR156-SPL模塊參與調(diào)控植物開(kāi)花、株型結(jié)構(gòu)、果實(shí)發(fā)育以及生物和非生物脅迫響應(yīng)等過(guò)程[17-18];在小麥中,miR156-SPL模塊通過(guò)與DWARF53基因相互作用調(diào)節(jié)小麥植株結(jié)構(gòu)[19]。小麥SPL基因參與小麥不同組織(器官)的生長(zhǎng)發(fā)育。然而,關(guān)于小麥SPL基因家族在缺氮、缺磷、高鹽、低溫、干旱、高溫等逆境條件下的研究卻鮮有報(bào)道。

本研究利用最新的中國(guó)春小麥參考基因組信息,基于全基因組搜索的方法鑒定小麥SPL基因家族成員,并根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)其在逆境脅迫條件下的表達(dá)模式進(jìn)行系統(tǒng)分析,以期為研究小麥SPL基因家族在響應(yīng)非生物脅迫過(guò)程中的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 小麥SPL基因家族成員的鑒定

從Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)(http: //pfam.xfam.org/)下載SBP結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型(HMM)文件(Pfam ID: PF03110),用HMMER 3.1軟件從小麥族多組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)WheatOmics 1.0(http://202.194.139.32/)下載最新的小麥基因組文件(IWGSC RefSeq v2.1)[20],從中篩選獲得所有包含小麥SBP結(jié)構(gòu)域的蛋白序列,利用DNAMAN軟件和SMART在線軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/)對(duì)所有候選序列進(jìn)行分析,去除不完整讀碼框序列和冗余序列。從TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.arabidopsis.org)下載擬南芥SPL蛋白序列,從水稻基因組注釋工程(http://rice.plantbiology.msu.edu/)下載水稻SPL蛋白序列。

1.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

用ClustalX軟件對(duì)小麥、擬南芥和水稻SPL蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì),參數(shù)為默認(rèn)值。用MEGA 8.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),bootstrap值設(shè)置為1 000。

1.3 miR156靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)

從miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.mirbase.org/)檢索小麥所有miR156序列,將miR156和SPL基因家族所有成員的轉(zhuǎn)錄本序列上傳到psRNATarget在線軟件(https://www.zhaolab.org/psRNATarget/analysis),對(duì)miR156靶位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.4 小麥SPL家族基因的表達(dá)模式分析

從小麥族多組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)WheatOmics 1.0下載小麥SPL基因在缺氮、缺磷、高鹽、低溫、干旱、高溫脅迫以及熱旱共脅迫下的表達(dá)譜數(shù)據(jù)。每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量用TPM(transcript per million)值來(lái)表示,用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換,用基迪奧生物云工具(https://www.omicshare.com/tools/)中的熱圖工具繪制熱圖。與對(duì)照相比,表達(dá)量變化倍數(shù)大于2,被認(rèn)為是脅迫響應(yīng)基因。隨機(jī)挑選4個(gè)SPL基因,進(jìn)一步對(duì)缺磷、高鹽(200 mmol·L-1NaCl)、低溫(4 ℃)、干旱和高溫(42 ℃)脅迫條件下這些基因的表達(dá)模式進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,具體處理方法:挑選大小均勻的中國(guó)春小麥種子,用75%的酒精消毒3 min,無(wú)菌水沖洗4～5次后將種子擺放于含有霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液的水培盒中,置于光照培養(yǎng)箱(24 ℃光照16 h,18 ℃黑暗8 h)中進(jìn)行培養(yǎng),每隔兩天換一次營(yíng)養(yǎng)液。正常生長(zhǎng)一周后,將其分別進(jìn)行脅迫處理,以未處理的樣品作為對(duì)照(CK)。缺磷和高鹽脅迫處理時(shí),先倒掉營(yíng)養(yǎng)液,然后分別加入缺磷霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液及高鹽霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng);干旱脅迫是將正常生長(zhǎng)一周的幼苗從營(yíng)養(yǎng)液中移出,置于濾紙上,在室溫條件下脫水干旱。將未處理和處理不同時(shí)間的葉片取樣后用液氮冷凍保存。每個(gè)處理進(jìn)行3次重復(fù)。

用Trizol試劑(天根,北京)提取RNA,用HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)試劑盒(諾唯贊,南京)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一條鏈,以小麥Actin基因?yàn)閮?nèi)參,以cDNA為模板,用SYBR Green Realtime PCR Master Mix(Takara,大連)在CFX96定量PCR儀(Bio-Rad,美國(guó))上進(jìn)行qRT-PCR。PCR擴(kuò)增體系參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,PCR擴(kuò)增程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 5 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,40個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量,每個(gè)樣品3個(gè)技術(shù)重復(fù)。qRT-PCR所用引物序列如表1所示。

表1 qRT-PCR所用的引物Table 1 Primers used in this study for qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥SPL基因家族成員的鑒定

從最新小麥基因組(IWGSC RefSeq v2.1)對(duì)用SBP結(jié)構(gòu)域(Pfam ID:PF03110)進(jìn)行檢索,共發(fā)現(xiàn)73個(gè)蛋白含有SBP結(jié)構(gòu)域。用DNAMAN和SMART軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析,同時(shí)去除重復(fù)蛋白序列,最終獲得56個(gè)含有SBP結(jié)構(gòu)域的SPL基因家族成員。

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA 8.0軟件對(duì)小麥(56個(gè))、水稻(19個(gè))和擬南芥(17個(gè))SPL蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果表明,SPL蛋白被劃分為7個(gè)亞家族(圖1)。Class III亞家族中含有的SPL蛋白最多,有23個(gè),其中小麥12個(gè);其次為Class VII亞家族,有21個(gè)SPL蛋白,其中小麥17個(gè);Class V和Class VI亞家族中的SPL蛋白最少,均不含擬南芥SPL蛋白。

黑圓點(diǎn)表示這些基因含有miR156靶位點(diǎn)。Black dots indicate the genes containing the miR156 target sites.圖1 小麥、擬南芥和水稻SPL蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of SPL proteins in wheat, Arabidopsis and rice

2.3 miR156靶位點(diǎn)的序列比對(duì)分析

從miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索小麥miR156序列(UGACAGAAGAGAGUGAGCACA),并將該序列和56個(gè)小麥SPL基因的轉(zhuǎn)錄本序列上傳到psRNATarget在線軟件,對(duì)包含miR156靶位點(diǎn)的小麥、擬南芥和水稻SPL基因進(jìn)行預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)這些基因主要分布在Class I、Class II、Class IV、Class V和Class VI亞家族中(圖1),說(shuō)明miR156調(diào)控SPL基因表達(dá)的分子調(diào)控機(jī)制在不同物種之間具有較高的保守性。小麥有27個(gè)SPL基因含有miR156靶位點(diǎn),除了Class V亞家族中3個(gè)基因的miR156靶位點(diǎn)位于3’UTR區(qū)外,其余24個(gè)基因均位于CDS區(qū)(圖2)。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),Class II和Class IV亞家族中15個(gè)小麥SPL基因的miR156靶位點(diǎn)與tae-miR156序列之間只有第8個(gè)堿基不互補(bǔ),其他堿基均互補(bǔ);Class V亞家族3個(gè)小麥SPL基因不互補(bǔ)堿基對(duì)最多,在第1、2、8位均不互補(bǔ)。

圖2 27個(gè)小麥SPL基因miR156靶位點(diǎn)的序列比對(duì)分析Fig.2 Multiple alignment of tae-miR156 target sites of the 27 wheat SPL genes

2.4 小麥SPL基因在非生物脅迫中的表達(dá)模式

2.4.1 缺氮、缺磷和高鹽脅迫下的表達(dá)模式

從小麥族多組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得56個(gè)小麥SPL基因在缺氮(材料為生長(zhǎng)15 d的小麥幼苗,處理后取葉片)、缺磷(材料為生長(zhǎng)14 d的小麥幼苗,處理后分別取葉片和根部)、高鹽脅迫(材料為生長(zhǎng)9 d的小麥幼苗,處理后取根部)的RNA-seq數(shù)據(jù),并分析這些基因的表達(dá)模式。結(jié)果(圖3)發(fā)現(xiàn),葉片中有12個(gè)小麥SPL基因響應(yīng)缺氮脅迫,其中在缺氮脅迫處理1 h后,有2個(gè)基因下調(diào)表達(dá),分別是TraesCS5B02G286000和TraesCS7A02G208000,后者的下調(diào)幅度最大;復(fù)氮培養(yǎng)24 h后,僅TraesCS2A02G232400上調(diào)表達(dá),有9個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。

NS-1 h:缺氮處理1 h的葉片;NR-1 h:復(fù)氮處理1 h的葉片;NR-24 h:復(fù)氮處理24 h的葉片;P-R-10 d:缺磷處理10 d的根;P-S-10 d:缺磷處理10 d的葉片;S-6 h:高鹽處理6h的根部;S-12 h:高鹽處理12 h的根部;S-24 h:高鹽處理24 h的根部;S-48 h:高鹽處理48h的根部。圖中每個(gè)單元格對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)為脅迫處理樣品與對(duì)照樣品中基因表達(dá)水平差異倍數(shù)的對(duì)數(shù)值。NS-1 h: Leaves treated with nitrogen deficiency for 1 h; NR-1 h: Leaves treated with nitrogen recovery for 1 h; NR-24 h: Leaves treated with nitrogen recovery for 24 h; P-R-10 d: Roots treated with phosphorus deficiency for 10 d; P-S-10 d: Leaves treated with phosphorus deficiency for 10 d; S-6 h: Roots treated with high salt for 6 h; S-12 h: Roots treated with high salt for 12 h; S-24 h: Roots treated with high salt for 24 h; S-48 h: Roots treated with high salt for 48 h. The data corresponding to each cell in the figure is logarithmic value of fold change in gene expression level between stress treatment and CK.圖3 小麥SPL基因在缺氮、缺磷和高鹽脅迫下的表達(dá)模式Fig.3 Expression profiles of wheat SPL genes under nitrogen deficiency, phosphorus deficiency and high salt stresses

缺磷脅迫處理10 d后,共有16個(gè)小麥SPL基因表達(dá)量變化顯著。根中有1個(gè)SPL基因(TraesCS7A02G208000)下調(diào)表達(dá),10個(gè)SPL基因上調(diào)表達(dá),其中TraesCS7B02G158500上調(diào)幅度最大;葉片中有13個(gè)基因上調(diào)表達(dá),其中TraesCS6B02G183400上調(diào)幅度最大,僅TraesCS2B02G250900下調(diào)表達(dá)。

在高鹽脅迫處理后6、12、24和48 h四個(gè)不同時(shí)間點(diǎn),根部共有22個(gè)SPL基因表達(dá)量發(fā)生變化,且多數(shù)為上調(diào)表達(dá),其中TraesCS5D02G294400上調(diào)表達(dá)幅度最高,在處理24 h時(shí)表達(dá)量最高。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),在缺氮、缺磷、高鹽脅迫下表達(dá)量發(fā)生顯著變化的SPL基因主要分布在Class I～Class Ⅳ亞家族。

2.4.2 低溫、高溫、干旱脅迫以及熱旱共脅迫下的表達(dá)模式

從小麥族多組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得56個(gè)小麥SPL基因在低溫(材料為生長(zhǎng)14 d的小麥幼苗,處理后取葉片)、高溫、干旱脅迫以及熱旱共脅迫下的RNA-seq數(shù)據(jù),并分析這些基因的表達(dá)模式。結(jié)果(圖4)表明,低溫脅迫處理后,小麥幼苗葉片中有6個(gè)SPL基因顯著上調(diào)表達(dá),其中TraesCS3A02G432500和TraesCS3D02G425800上調(diào)幅度最大;高溫脅迫處理下,有14個(gè)小麥SPL基因的表達(dá)量變化顯著,其中根中有3個(gè),葉片中有1個(gè),籽粒中有12個(gè),除TraesCS6B02G183400在根中上調(diào)表達(dá)外,其余基因均下調(diào)表達(dá),其中TraesCS6A02G110100下調(diào)幅度最大;干旱脅迫處理下,有13個(gè)小麥SPL基因的表達(dá)量變化顯著,相較于葉片和籽粒,小麥根中響應(yīng)干旱脅迫的SPL基因較多,其中9個(gè)上調(diào)表達(dá),1個(gè)下調(diào)表達(dá);熱旱共脅迫處理下,小麥的根、葉片及籽粒中共有21個(gè)SPL基因響應(yīng)熱旱共脅迫,其中TraesCS3B02G468400在葉片中上調(diào)幅度最大。響應(yīng)熱旱共脅迫的SPL基因主要分布于Class Ⅰ、Class Ⅲ和Class Ⅳ亞家族。

對(duì)響應(yīng)不同脅迫的小麥SPL基因進(jìn)行歸類,共發(fā)現(xiàn)36個(gè)基因響應(yīng)脅迫處理(表達(dá)量變化倍數(shù)大于2)。除TraesCS1B02G266100、TraesCS1D02G254700、TraesCS2D02G232800、TraesCS4A02G359500、TraesCS5B02G265600、TraesCS7A02G246500、TraesCS7A02G260500、TraesCS7B02G144900、TraesCS7B02G142200、TraesCS7D02G245200基因外,其余26個(gè)基因均響應(yīng)2種及以上脅迫,其中TraesCS3D02G425800響應(yīng)7種脅迫(表2)。

表2 26個(gè)響應(yīng)多個(gè)非生物脅迫的小麥SPL基因Table 2 26 wheat SPL genes responding to multiple abiotic stresses

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),大部分位于相同亞家族的小麥SPL基因在同一脅迫下表達(dá)模式相似,說(shuō)明小麥SPL基因可能存在功能冗余。如Class I亞家族中的TraesCS6A02G110100、TraesCS6B02G138400和TraesCS6D02G098500在高鹽脅迫條件下均下調(diào)表達(dá)。但也存在例外,如Class Ⅳ亞家族中的TraesCS5A02G286700、TraesCS5B02G286000和TraesCS5D02G294400屬于部分同源基因,但它們?cè)诟珊得{迫條件下分別表現(xiàn)出下調(diào)、上調(diào)和無(wú)變化三種表達(dá)模式。

隨機(jī)挑選四個(gè)響應(yīng)2種及以上非生物脅迫的小麥SPL基因(TraesCS7A02G208000、TraesCS6B0G138400、TraesCS6D02G145200和TraesCS7A02G249100),利用qRT-PCR驗(yàn)證它們?cè)诓煌{迫下的表達(dá)模式。從表3可以看出,缺磷脅迫處理下,TraesCS7A02G208000和TraesCS6B02G138400的表達(dá)量均呈先升后降的變化趨勢(shì),在處理9 d時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值;而TraesCS7A02G249100和TraesCS6D02G145200的表達(dá)量呈“降-升-降”的變化趨勢(shì),分別在處理6 d和9 d時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值,均與對(duì)照差異顯著(圖5)。高鹽脅迫處理下,TraesCS6B02G138400和TraesCS6D02G145200的表達(dá)量均顯著低于對(duì)照;TraesCS7A02G208000的表達(dá)量呈先升后降的變化趨勢(shì),在處理6 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值,且與對(duì)照差異顯著;TraesCS7A02G249100的表達(dá)量無(wú)顯著變化。低溫脅迫處理下,TraesCS6B02G138400和TraesCS7A02G208000的表達(dá)量變化趨勢(shì)相反,分別呈“升-降-升”和“降-升-降”的變化趨勢(shì),在處理1 h和12 h表達(dá)量達(dá)到峰值,均與對(duì)照差異顯著;而其他兩個(gè)基因的表達(dá)量在各處理時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著變化。干旱脅迫和高溫脅迫處理下,4個(gè)小麥SPL基因的表達(dá)量均有所下降(除高溫脅迫1 h后TraesCA7A02G208000的表達(dá)量顯著高于對(duì)照外),部分處理時(shí)間的表達(dá)量與對(duì)照差異顯著。qRT-PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基本一致。

表3 不同脅迫處理下4個(gè)小麥SPL基因的相對(duì)表達(dá)量Table 3 Expression of the four wheat SPL genes under different stresses

3 討論

本研究從最新的中國(guó)春小麥基因組(IWGSC RefSeq v2.1)中鑒定到56個(gè)小麥SPL基因,而擬南芥、水稻和玉米中分別鑒定到17、19和31個(gè)SPL基因[8]。說(shuō)明小麥中SPL基因的數(shù)目遠(yuǎn)多于其他物種,原因可能是小麥為異源六倍體植物,在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷了兩次天然雜交和染色體加倍。本研究通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化分析將56個(gè)小麥SPL基因分成7個(gè)亞家族,而Song等[10]、Li等[11]和Zhu等[12]分別將其分成5、8和10個(gè)亞家族,盡管每個(gè)亞家族中SPL基因的數(shù)目不一致,但序列相似的基因都聚在同一分支。本研究發(fā)現(xiàn),Class Ⅴ和Class Ⅵ亞家族中沒(méi)有對(duì)應(yīng)的擬南芥SPL基因家族成員,推測(cè)Class Ⅴ和Class Ⅵ亞家族可能是在單子葉植物和雙子葉植物分化后在單子葉植物中獨(dú)立進(jìn)化出的分支。

Cui等[21]研究表明,擬南芥AtSPL9基因通過(guò)miR156-SPL9-DFR途徑響應(yīng)高鹽和干旱脅迫。本研究對(duì)不同脅迫下小麥SPL基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)響應(yīng)缺氮、缺磷、高鹽、低溫、高溫、干旱脅迫和熱旱共脅迫的小麥SPL基因家族成員主要集中在Class I～Class Ⅴ亞家族,而Class Ⅵ和Class Ⅶ亞家族成員基本上不響應(yīng)上述脅迫。Zhu等[12]研究發(fā)現(xiàn),大部分小麥SPL基因具有組織表達(dá)特異性,其中46個(gè)小麥SPL基因主要在穗部表達(dá)。本研究進(jìn)行脅迫處理的樣品取材部位主要為小麥葉片和根部,Class Ⅵ和Class Ⅶ亞家族成員在穗部是否特異表達(dá)需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。miR156是植物小RNA家族中表達(dá)豐度最大的家族,通過(guò)靶向SPL基因家族成員參與調(diào)控植株開(kāi)花以及株型建成等過(guò)程[18]。在擬南芥中,miR156通過(guò)調(diào)控AtSPL3/4/5和AtSPL9的表達(dá)直接激活下游基因MADS-box,從而促進(jìn)開(kāi)花[22];miR156-SPL10通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞分裂反應(yīng),控制根的再生[23]。miR156-SPL模塊也參與植物非生物脅迫,Ding等[24]發(fā)現(xiàn),擬南芥miR156-SPL模塊通過(guò)調(diào)控下游相關(guān)熱響應(yīng)基因的表達(dá)來(lái)適應(yīng)環(huán)境溫度變化;Kouhi等[25]發(fā)現(xiàn),紅花miR156-SPL模塊可使紅花幼苗在長(zhǎng)期輕度干旱時(shí)繼續(xù)存活,并提高開(kāi)花率。本研究發(fā)現(xiàn),27個(gè)小麥SPL基因可能受miR156調(diào)控,這為進(jìn)一步探索miR156-SPL模塊在小麥中的功能提供了參考。

本研究鑒定到36個(gè)與非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)的小麥SPL基因,其中TraesCS3D02G425800響應(yīng)7種非生物脅迫,后續(xù)將通過(guò)過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因技術(shù)或CRISPR-Cas9技術(shù)對(duì)該基因進(jìn)行驗(yàn)證,深入研究該基因的功能。