8個(gè)春石斛栽培種花瓣揮發(fā)性成分差異分析

孔蘭 葉秀仙 林榕燕 鐘淮欽

摘 要：為研究不同春石斛栽培種花瓣中揮發(fā)性成分組成特點(diǎn)及其差異，采用頂空固相微萃取（HS-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）技術(shù)，分析了雜交紫花、黑毛珍珠、紅爵士、火鳥公主、黃鉆戒、臺灣公主、大漢王后和耳環(huán)等8個(gè)春石斛栽培種花瓣揮發(fā)性成分及其相對含量，并應(yīng)用主成分分析和聚類分析確定品種間的親疏關(guān)系。結(jié)果表明：8個(gè)栽培種共檢測到130種揮發(fā)性成分，以萜烯類化合物為主；春石斛花瓣中的主要揮發(fā)性成分為β-羅勒烯、β-石竹烯、芳樟醇、α-蒎烯、水楊酸甲酯和辛醇，因其組成和含量的變化導(dǎo)致了品種間的香氣感官差異；主成分分析結(jié)果顯示8個(gè)栽培種具有明顯的區(qū)域分布特征。此外，聚類分析將8個(gè)栽培種分為3組：黑毛珍珠和雜交紫花為一組，火鳥公主、紅爵士和黃鉆戒為一組，臺灣公主、大漢王后和耳環(huán)為一組。該研究結(jié)果為春石斛香氣物質(zhì)的利用和香型品種的培育提供了參考。

關(guān)鍵詞：春石斛；揮發(fā)性成分；HS-SPME/GC-MS；萜烯類化合物；主成分分析

中圖分類號：S 682.31 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ??文章編號：0253-2301（2023）06-0034-10

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.06.005

Difference Analysis of the Volatile Components in the Petals ofEight Cultivated Species of Dendrboium

KONG Lan， YE Xiu-xian， LIN Rong-yan， ZHONG Huai-qin*

（Fujian Engineering Technology Research Center for Characteristic Floriculture / Crop Research Institute，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350013， China）

Abstact： In order to study the composition characteristics of volatile components in the petals of different cultivated species of Dendrboium and their differences， the headspace solid-phase microextraction （HS-SPME） combined with the gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） was used to analyze the volatile components and their relative contents in the petals of eight cultivated species of Dendrboium， including Zajiaozihua， Heimaozhenzhu， Hongjueshi， Huoniaogongzhu， Huangzuanjie， Taiwangongzhu， Dahanwanghou and Erhuan. And the principal component analysis and cluster analysis were used to determine the relationship between the varieties. The results showed that a total of 130 volatile components were detected in the eight cultivated species， mainly terpenoids. The main volatile components in the petals of Dendrboium were β-ocimene， β-caryophyllene， linalool， α-pinene， methyl salicylate and octyl alcohol. The changes of their composition and content led to the difference of aroma sensory between the varieties. The results of principal component analysis showed that the eight cultivated species had obvious regional distribution characteristics. In addition， the eight cultivated species were divided into three groups by cluster analysis： Heimaozhenzhu and Zajiaozihua were a group; Huoniaogongzhu， Hongjueshi and Huangzuanjie were a group; Taiwangongzhu， Dahanwanghou and Erhuan were a group. The results of this study could provide reference for the utilization of aroma substances and the cultivation of aroma type varieties of Dendrboium.

Key words： Dendrboium； Volatile components； HS-SPME/GC-MS； Terpenoids； Principal component analysis

石斛Dendrobium為蘭科Orchidaceae樹蘭亞科Epidendroideae中第二大屬的附生植物，具有極高的藥用、食用和觀賞價(jià)值［1-2］。按照花期的不同，石斛可分為秋石斛和春石斛，其中春石斛因其株型優(yōu)美，花色艷麗，花多且密等特點(diǎn)而深受消費(fèi)者青睞［3-4］。近年來，春石斛還被園林專家通過掛板或捆綁的方式，應(yīng)用在街道、公園和風(fēng)景區(qū)中美化環(huán)境。

花香是影響植物觀賞價(jià)值和消費(fèi)者接受度的關(guān)鍵因素，也是觀賞花卉重要的育種目標(biāo)［5］。目前在建蘭Cymbidium ensifolium［6］、茉莉Jasminum sambac［7］、百合Lilium［8］、姜花Hedychium coronarium［9］、鐵蘭Tillandsia［10］、杜鵑Rhododendron fortunei［11］等植物花瓣中的揮發(fā)性成分已有較多研究，石斛中有關(guān)揮發(fā)性成分的研究也已有報(bào)道。其中，李崇暉等［12］采用固相微萃取（SPME）方法結(jié)合GC-MS技術(shù)測定了鼓槌石斛、羅河石斛、細(xì)葉石斛和密花石斛盛花期的花朵揮發(fā)性成分，發(fā)現(xiàn)這4種石斛揮發(fā)性成分的組成和含量差異明顯。宋小蒙等［13］利用SPME-GC-MS技術(shù)從金釵石斛花朵中鑒定出63種揮發(fā)性成分，其中萜烯類及其衍生物是其主要揮發(fā)性成分，與水蒸氣蒸餾法（24種）相比，揮發(fā)性成分更為全面；王元成等［14-15］利用SPME-GC-MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)萜烯類化合物是腫節(jié)石斛、細(xì)葉石斛、玫瑰石斛、棒節(jié)石斛、翅梗石斛和束花石斛的主要揮發(fā)性成分，還發(fā)現(xiàn)酯類和醇類化合物是報(bào)春石斛的主要揮發(fā)性成分。Du等［16］利用該技術(shù)測定了鼓槌石斛花瓣揮發(fā)性成分在不同開花期的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)萜類、雜環(huán)化合物和酯類是其主要揮發(fā)性成分。上述研究多集中在春石斛原生種，目前培育的春石斛栽培種具有花型大、花期長、花瓣厚、花香等特點(diǎn)，觀賞價(jià)值比原生種更高，但揮發(fā)性成分研究少有報(bào)道。

本研究利用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對8個(gè)春石斛栽培種花瓣中的揮發(fā)性成分進(jìn)行了定性分析，應(yīng)用主成分分析和聚類分析確定品種間的親疏關(guān)系，為今后春石斛特征香氣物質(zhì)的利用和香型品種的培育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

雜交紫花、黑毛珍珠、紅爵士、火鳥公主、黃鉆戒、臺灣公主、大漢王后和耳環(huán)為供試材料（圖1），包括7個(gè)有香型品種和1個(gè)無香型品種，均種植于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所居家園藝溫室。

1.2 試驗(yàn)方法

2022年4月于晴天上午9：00～14：00采摘盛花期的鮮花放入25 mL萃取瓶中，每個(gè)樣品重量為2 g，3次重復(fù)。將裝有鮮花瓣的萃取瓶于40℃水浴鍋中平衡10 min，插入預(yù)先老化1 h的PDMS/CAR/DVB纖維頭，萃取30 min。萃取完后取出纖維頭，插入GC-MS進(jìn)樣口，于250℃解析5 min，進(jìn)行進(jìn)樣，分流比為2∶1。

GC-MS檢測條件：升溫程序：柱溫50℃保持2 min，先以5℃·min-1速率升至180℃，再以15℃·min-1速率升至250℃。質(zhì)譜條件：電離方式EI，電子能量70 eV，四級桿溫度150℃，離子源溫度230℃，接口溫度280℃，質(zhì)量掃描范圍35～500 amu。

定性分析：根據(jù)總離子流色譜圖，各色譜峰對應(yīng)質(zhì)譜通過保留時(shí)間和NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的對比，以及相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行香氣成分鑒定。利用離子流峰面積歸一化法（各色譜峰面積與總峰面積之比），計(jì)算各組分在總揮發(fā)物中的相對含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

通過邁維云平臺（https：//cloud.metware.cn/）完成8個(gè)春石斛品種的主成分分析，以便了解各樣本之間的總體代謝物差異。130種揮發(fā)性成分按照含有此種揮發(fā)性成分的數(shù)據(jù)賦為1，未檢測到該種揮發(fā)性成分的數(shù)據(jù)賦為0的原則建立遺傳相似矩陣，然后利用NTSYSpc軟件完成聚類分析，獲得樹狀關(guān)系圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 8個(gè)春石斛栽培種花瓣揮發(fā)性成分概況

由表1可知，從8個(gè)春石斛栽培種盛花期花朵中共鑒定到130種揮發(fā)性成分，主要包括萜烯類（54種，41.54%）、酯類（19種，14.62%）、醇類（17種，13.08%）、酮類（9種，6.92%）、烷烴類

（8種，6.15%）、醛類（5種，3.85%）、酸類（3種，2.31%）和其他（15種，11.54%）等8類。其中揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量最多的是萜烯類（單萜類23種、倍半萜類19種），其次是酯類和醇類。

2.2 8個(gè)春石斛揮發(fā)性類別比較分析

不同春石斛栽培種揮發(fā)性成分的數(shù)量和相對含量略有不同（表1）。臺灣公主花瓣中揮發(fā)性成分種類最多，有65種，其次是大漢王后（55種）、耳環(huán)（53種）和火鳥公主（51種），雜交紫花中最少，僅有16種。由圖2可知，黃鉆戒（91.19%）、黑毛珍珠（85.86%）、臺灣公主（79.97%）、耳環(huán)（68.01%）、大漢王后（66.98%）和火鳥公主（62.69%）盛花期花瓣中揮發(fā)性成分均以萜烯類化合物為主，其中黑毛珍珠以倍半萜類化合物居多，其他品種以單萜類化合物居多。此外，耳環(huán)和大漢王后中還含有較多的醇類化合物（18.08%，21.80%）；火鳥公主中酯類化合物相對含量（18.02%）也較高；黑毛珍珠、耳環(huán)和大漢王后中均未檢測到酸類化合物。紅爵士以萜烯類化合物和酯類化合物為主要揮發(fā)性成分，兩者相對含量差異不大，萜烯類化合物相對含量（39.95%）略多于酯類化合物（34.48%），其次是醇類化合物（19.41%）。無香型春石斛雜交紫花以酯類化合物（66.11%）為主，未檢測到醇類化合物。結(jié)果表明，萜烯類化合物、酯類化合物和醇類化合物是有香型春石斛重要的揮發(fā)性成分來源。

2.3 8個(gè)春石斛主要揮發(fā)性成分比較

由表1可知，黑毛珍珠中的揮發(fā)性成分以β-石竹烯（48.34%）、（3E）-4，8-二甲基-1，3，7-壬三烯（15.11%）和α-衣蘭烯（6.79%）為主；臺灣公主中的主要揮發(fā)性成分包括β-羅勒烯（18.57%）、芳樟醇（11.15%）、α-蒎烯（10.75%）、β-石竹烯（9.16%）和α-法呢烯（7.48%）；大漢王后中的主要揮發(fā)性成分包括β-羅勒烯（20.27%）、辛醇（16.4%）、α-蒎烯（13.33%）、β-石竹烯（10.2%）和α-法呢烯（4.63%）；火鳥公主中的主要揮發(fā)性成分為β-羅勒烯（23.09%）、芳樟醇（18.35%）、水楊酸甲酯（13.95%）和1-亞甲基-4-（1-甲基乙烯基）環(huán)己烷（7.92%）；紅爵士中的主要揮發(fā)性成分包括水楊酸甲酯（27.97%）、β-羅勒烯（21.98%）、辛醇（11.8%）、β-石竹烯（7.76%）和α-法呢烯（3.81%）；黃鉆戒中的主要揮發(fā)性成分包括β-羅勒烯（30.92%）、β-石竹烯（18.52%）、（3E）-4，8-二甲基-1，3，7-壬三烯（8.06%）、芳樟醇（7.54%）和α-蒎烯（6.14%）；耳環(huán)中的主要揮發(fā)性成分包括β-石竹烯（17.13%）、辛醇（15.61%）、β-羅勒烯（14.86%）、α-蒎烯（14.55%）和水楊酸甲酯（5.53%）；而無香型雜交紫花以酯類化合物為主，其中水楊酸-2-乙基己基酯（17.21%）相對含量最高，其次是苯甲酸辛酯（14.19%）、癸二酸-2-丁烯丙酯（10.51%）、肉豆蔻酸異丙酯（9.17%）和水楊酸己酯（9.03%）。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，7個(gè)有香型春石斛栽培種中同時(shí)含有的揮發(fā)性成分僅有9種，分別為己醛、3-己烯-1-醇、己醇、α-蒎烯、β-羅勒烯、芳樟醇、β-欖香烯、Z，Z，Z-1，5，9，9四甲基-1，4，7，-環(huán)己三烯和水楊酸-2-乙基己基酯，其中α-蒎烯、β-羅勒烯、芳樟醇和β-欖香烯屬于萜烯類化合物，且在不同春石斛栽培種中的含量差異明顯。α-蒎烯在臺灣公主、大漢王后和耳環(huán)中的相對含量較高，而在紅爵士中幾乎沒有，僅為0.43%；β-羅勒烯是黃鉆戒、大漢王后、火鳥公主和臺灣公主的主要揮發(fā)性成分，在紅爵士和耳環(huán)中的相對含量也較高，而黑毛珍珠中相對含量較低，僅為0.11%；芳樟醇在火鳥公主和臺灣公主中的相對含量較高，其次是黃鉆戒，而在其他品種中的相對含量為1.17%～2.12%；β-欖香烯在7個(gè)有香型栽培種中的相對含量普遍較低，為0.16%～1.64%。此外，β-石竹烯在不同春石斛栽培種中的相對含量也具有顯著差異，它是黑毛珍珠（48.34%）和耳環(huán)（17.13%）中相對含量最高的揮發(fā)性成分，而在火鳥公主中未檢測到該物質(zhì)。推測上述揮發(fā)性成分在種類和含量上的差異導(dǎo)致了不同品種春石斛釋放出不同的香氣。

2.4 8個(gè)春石斛主要揮發(fā)性成分主成分分析

為了可視化8個(gè)春石斛栽培種花朵中揮發(fā)性成分的組成差異，對130種揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行了主成分分析（Principal Component Analyses，PCA）。由圖3可知，第一主成分和第二主成分分別解釋了樣本間28.97 %和19.57 %的變異。在第一主成分上，臺灣公主、耳環(huán)和大漢王后與黑毛珍珠、雜交紫花、黃鉆戒、火鳥公主和紅爵士明顯分開，說明臺灣公主、耳環(huán)和大漢王后的代謝物與其他5個(gè)品種的代謝物差異顯著。在第二主成分上，火鳥公主和紅爵士的揮發(fā)性成分較接近，耳環(huán)和大漢王后的揮發(fā)性成分較接近，而黑毛珍珠、雜交紫花、黃鉆戒和臺灣公主的揮發(fā)性成分相對獨(dú)立。

2.5 8個(gè)春石斛主要揮發(fā)性成分聚類分析

130種揮發(fā)性成分的聚類分析結(jié)果顯示，8個(gè)栽培種被分為3類（圖4）。第Ⅰ類包括黑毛珍珠和雜交紫花，其揮發(fā)性成分的數(shù)量最少。第Ⅱ類包括火鳥公主、紅爵士和黃鉆戒，含有較多的萜烯類（β-羅勒烯、芳樟醇、β-石竹烯）和酯類（水楊酸甲酯）化合物。第Ⅲ類包括臺灣公主、大漢王后和耳環(huán)，其揮發(fā)性化合物的數(shù)量最多，含有較多的萜烯類（β-羅勒烯、α-蒎烯、β-石竹烯）、醇類（辛醇）和酯類（水楊酸甲酯）化合物。其中大漢王后和耳環(huán)聚為同一支，且與臺灣公主互為姐妹支，說明它們含有的揮發(fā)性成分種類相似性較高，這與主成分分析結(jié)果一致。

3 討論與結(jié)論

花香在開花植物的生長、發(fā)育和進(jìn)化過程中起著關(guān)鍵的作用，是評價(jià)品質(zhì)性狀的一個(gè)重要因素，影響著花卉植物的觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值?；ㄏ阌啥喾N低分子量的揮發(fā)性物質(zhì)組成的，然而這些揮發(fā)性小分子不易覺察，成分復(fù)雜且多變，使其相關(guān)研究較于花色、花型等觀賞性狀而言起步較晚［5］。近年來有關(guān)石斛揮發(fā)性成分的研究相繼被報(bào)道，尤其是對原生種石斛揮發(fā)性成分的分析。本研究利用HS-SPME/GC-MS技術(shù)對8個(gè)春石斛栽培種花瓣中的揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析，共鑒定到130種揮發(fā)性成分，包括萜烯類、酯類、醇類、烷烴類、酮類、醛類、酸類和其他。但不同春石斛栽培種，其揮發(fā)性成分明顯不同，特別是特征性揮發(fā)性成分。

萜烯類化合物是植物中最多樣化的揮發(fā)性成分［17］。研究表明，萜烯類化合物是石斛最主要的香氣成分，如鼓槌石斛、細(xì)葉石斛、翅梗石斛、鐵皮石斛等原生種［12，14，18］。與前人研究一致，本研究在7個(gè)有香型春石斛栽培種花瓣中檢測到萜烯類化合物的相對含量最高（39.95%～91.19%），且種類最多；同時(shí)，相對含量在5%以上的11種揮發(fā)性成分中8種為萜烯類化合物；9種共有揮發(fā)性成分中也有4種為萜烯類化合物。根據(jù)以上結(jié)果推測萜烯類化合物是7個(gè)有香型春石斛栽培種的主要揮發(fā)性成分，也是主要賦香成分。而無香型雜交紫花則以酯類化合物為主要揮發(fā)性成分（66.11%），火鳥公主和紅爵士中酯類化合物的含量也較高，這與報(bào)春石斛和美花石斛花香主要成分為酯類化合物的結(jié)論相一致［19-20］。

植物香氣往往是許多種揮發(fā)性成分混合的產(chǎn)物，而揮發(fā)性成分（尤其是特征性揮發(fā)性成分）在種類和含量上的差異，創(chuàng)造了大自然中多樣的芬芳［21］。前人研究指出，D-檸檬烯、α-蒎烯、月桂烯、β-羅勒烯、芳樟醇、石竹烯等萜烯類化合物是蘭花中常見的揮發(fā)性成分，由于它們的嗅感閾值較低，是重要的香氣物質(zhì)［14-15，21-23］。本研究采用HS-SPME/GC-MS技術(shù)在8個(gè)春石斛栽培種花瓣中檢測到16～64種揮發(fā)性成分，其中具有檸檬香氣的β-羅勒烯在8個(gè)栽培種中出現(xiàn)的頻率最高，且在黃鉆戒、大漢王后、火鳥公主和臺灣公主中的相對含量最高，而黑毛珍珠中的相對含量極低，推測β-羅勒烯是黃鉆戒、大漢王后、火鳥公主和臺灣公主的特征性揮發(fā)性成分。β-石竹烯具有丁香氣味，是化妝品中的重要香味劑［24］。本研究發(fā)現(xiàn)黑毛珍珠（48.34%）和耳環(huán)（17.13%）中相對含量最高的揮發(fā)性成分為β-石竹烯，而雜交紫花和火鳥公主中未檢測到該物質(zhì)存在，推測β-石竹烯為黑毛珍珠和耳環(huán)的特征性揮發(fā)性成分。α-蒎烯（松木香氣）和芳樟醇（鈴蘭花香）［24］是7個(gè)有香型栽培種共有的揮發(fā)性成分。不同的是，α-蒎烯在臺灣公主、大漢王后和耳環(huán)中的相對含量較高，而芳樟醇則在火鳥公主中的相對含量較高。因此，推測它們對春石斛香氣有較大的貢獻(xiàn)。此外，還有46種揮發(fā)性成分只存在于某一品種中，如火鳥公主中的α-水芹烯，黑毛珍珠中的α-依蘭烯和臺灣公主中的α-松油醇。以上揮發(fā)性成分在種類和含量上的差異，可能共同決定了春石斛花香的多樣性。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）

收稿日期：2023-05-10

作者簡介：孔蘭，女，1987年生，助理研究員，主要從事蘭科植物分子生物學(xué)研究。

*通信作者：鐘淮欽，男，1979年生，副研究員，主要從事觀賞植物種質(zhì)資源評價(jià)與創(chuàng)新利用研究（E-mail：zhqeast@163.com）。

基金項(xiàng)目：福建省科技計(jì)劃公益類項(xiàng)目（2021R1031005）；福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自由探索項(xiàng)目（ZYTS202205）；福建省種業(yè)創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)化工程（ZYCX-LY-202102）；福建省人民政府、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院‘5511’協(xié)同創(chuàng)新項(xiàng)目（XTCXGC2021016）；福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院特色花卉科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目（CXTD2021010-2）。