深綠木霉TraT2A對5種作物的促生作用研究

張國印,梁巧蘭,魏列新

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730070)

木霉菌(Trichoderma)是一類重要的植物病害生防菌,根據(jù)GAMS和BISSETT分類系統(tǒng),其屬于半知菌亞門(Deuteromycotina)、絲孢綱(Hyphomycetes)、絲孢目(Hyphomycetales)、粘孢菌(Gloiosporae)類[1-2],普遍存在并廣泛分布于植物根際土壤、腐爛植被和其他基質(zhì)中[3]。木霉菌具有多種生防機(jī)制,包括競爭作用、重寄生作用、抗生作用、誘導(dǎo)抗病作用[4];此外,木霉菌含部分促進(jìn)植物生長的基因,定殖在植物根際時(shí),能夠改善土壤微生態(tài)環(huán)境、影響植物激素的合成與運(yùn)輸、降低土壤pH值和提高養(yǎng)分利用率,因此木霉菌可以促進(jìn)植物生長[4-7]。據(jù)報(bào)道,哈茨木霉(Trichodermaharzianum)處理過的黃瓜和砂糖橘與對照相比,根長和葉綠素b含量均顯著增加[8-9]。魯海菊等[10]研究表明,把內(nèi)生木霉菌(EndophyticTrichoderma) P3.9菌株接種于枇杷主干韌皮部第30天,處理組的葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)比對照大0.01 mg·g-1,株高每株比對照大5 mm。王禹佳等發(fā)現(xiàn)[11],綠色木霉(Trichodermavirid)處理后莖粗和葉綠素含量分別提高了42.8%和60.6%,相比對照差異顯著。Rao等[12]發(fā)現(xiàn)T.atrovirideLZ42處理后,番茄幼苗地上部分和根的干質(zhì)量明顯增加,并且其釋放的揮發(fā)性有機(jī)化合物VOCs影響番茄幼苗主根的生長方向,促進(jìn)番茄幼苗主根的生長。深綠木霉(T.atroviride) T1處理后的番茄根長、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量相比對照分別提高了34.91%、30.27%和15.04%[13];深綠木霉(T.atroviride) D16菌肥(15 g)與丹參苗共培養(yǎng)后,在盆栽和大田環(huán)境下干質(zhì)量分別是同期對照組的5.61倍和1.42倍[14];106個(gè)·mL-1的深綠木霉(T.atroviride) H18-1-1孢子懸浮液處理小白菜后,可使其鮮質(zhì)量增加88%[15];深綠木霉(T.atroviride) HB20111對西洋參的種子包衣處理后,其第一年的出苗率為87%,明顯高于對照組56.5%[16]。

TraT2A作為深綠木霉(T.atroviride)T2菌株發(fā)酵液的蛋白提取物[17],高濃度對百合灰霉病菌(Botrytiscinereal)和百合葉斑病菌(Alternariaalternate)具有較高的抑制作用,抑制率分別為47.44%和72.12%,低濃度對百合灰霉病菌(B.cinerea)具有較高的誘導(dǎo)抗病作用,誘導(dǎo)效果可達(dá)55.89%[18-21];而且,200倍液TraT2A處理百合鱗片后有明顯的促生效果,發(fā)芽率和每鱗片發(fā)芽數(shù)分別為100%、5.85個(gè)[22]。但是,TraT2A對其他作物的促生作用研究尚未進(jìn)行。為此,本試驗(yàn)以TraT2A蛋白為研究對象,測定了TraT2A蛋白處理后對小麥、玉米、豇豆、辣椒和黃瓜5種作物種子的發(fā)芽率、幼苗生長、葉綠素含量等生理指標(biāo)的影響,旨在明確其對以上5種作物生長的促生作用。研究結(jié)果可為TraT2A生物菌肥的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試藥劑:深綠木霉T2菌株發(fā)酵液蛋白提取物(TraT2A)由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院農(nóng)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵提取(TraT2A在595 nm處的OD值為3.26,產(chǎn)量為200 mL·L-1)[20];80%丙酮、石英砂、連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)、1%TTC溶液、磷酸緩沖液、1 mol·L-1硫酸、0.4 mol·L-1琥珀酸鈉、0.6%硫代巴比妥酸、10%三氯乙酸,均為分析純。

供試作物種子:小麥(黑龍江豐鴻種業(yè)有限公司)、玉米(山東壽光創(chuàng)跡農(nóng)業(yè)有限公司)、豇豆(河北慶灃種業(yè)有限公司)、辣椒(河北慶灃種業(yè)有限公司)和黃瓜(河北慶灃種業(yè)有限公司)。

儀器設(shè)備:電子天平AR224CN(上海奧豪斯儀器有限公司)、紫外可見分光光度計(jì)UV-9000S(上海元析儀器有限公司)、高速冷凍離心機(jī)5430R(德國Eppendorf艾本德有限公司)、LED頂置人工氣候箱QRDN-1500T-4(杭州琦勝電子科技有限公司)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱HGZF-11/H-101-3(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 深綠木霉TraT2A蛋白對5種作物種子萌發(fā)的影響 選取大小一致、成熟飽滿的小麥、玉米、豇豆、辣椒和黃瓜種子,于70%酒精中消毒1 min,5%NaClO溶液消毒5 min,無菌水沖洗3次后,對照組用無菌水浸泡8 h,處理組無菌水浸泡3 h后再用不同濃度TraT2A浸泡5 h。用滅菌濾紙吸取多余液體后,放置于滅菌培養(yǎng)皿中(培養(yǎng)皿底部墊有海綿,上覆1層滅菌濾紙)保濕催芽,每皿20粒。處理組分別加入100.00 mg·mL-1、20.00 mg·mL-1、10.00 mg·mL-1和2.00 mg·mL-1的TraT2A,對照組(CK)加入無菌水,每皿10 mL,每個(gè)處理重復(fù)3次。置于溫度25℃、相對濕度60%、暗/光交替(16 h/8 h)恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),采用稱重法每日補(bǔ)充等量的TraT2A和無菌水,3 d后統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽數(shù),計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù),然后將各發(fā)芽種子裝入稱量瓶中,放置于烘箱中,在105℃下處理30 min后,將溫度調(diào)至80℃烘干,再用電子天平稱量[23],計(jì)算活力指數(shù)。

式中,Gt為t時(shí)間內(nèi)的發(fā)芽數(shù),Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

活力指數(shù)=發(fā)芽指數(shù)×單株平均干質(zhì)量

1.2.2 深綠木霉TraT2A蛋白對5種作物幼苗形態(tài)指標(biāo)的影響 按1.2.1小節(jié)方法處理5種作物種子,每個(gè)培養(yǎng)皿20粒,3次重復(fù),培養(yǎng)7 d后,用刻度尺測量胚根和胚軸,然后用濾紙吸干植株表面水分,立即用電子天平稱量其質(zhì)量,即鮮質(zhì)量,然后按1.2.1小節(jié)方法測定干質(zhì)量,最后計(jì)算促生率。

1.2.3 深綠木霉TraT2A蛋白對5種作物幼苗生理指標(biāo)的影響 根據(jù)發(fā)芽期到幼苗期形態(tài)指標(biāo)的測定數(shù)據(jù),選取TraT2A對5種作物促生效果最好的濃度進(jìn)行生理生化測定。每種作物挑選30粒種子,設(shè)3組重復(fù)。先對作物種子進(jìn)行催芽處理,方法同1.2.1小節(jié),處理組加入10.00 mL的TraT2A蛋白,對照組加入10.00 mL無菌水。3 d后移栽到裝滅菌土的花盆中,花盆直徑28 cm,高25 cm,每盆種10株幼苗。采用稱重法每日補(bǔ)充等量的TraT2A和滅菌水,在14 d時(shí)進(jìn)行部分生理生化指標(biāo)測定(葉綠素含量、根系活力和丙二醛含量)。

幼苗葉綠素含量測定采用分光光度法[24],根系活力采用TTC法(氯化三苯基四氮唑法)測定[25-26],丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法測定[27],最后計(jì)算促生率。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 利用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,各處理的差異顯著性檢驗(yàn)采用Duncan新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 深綠木霉發(fā)酵液蛋白提取物TraT2A對5種作物種子萌發(fā)的影響

由表1可知,4種不同濃度TraT2A處理5種作物種子后,與對照相比發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均有顯著提高(P<0.05),且對不同作物的促生效果不同。其中10 mg·mL-1TraT2A處理的5種作物的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均為最高,黃瓜的發(fā)芽率最高為93.66%,小麥的發(fā)芽指數(shù)最高為15.16,玉米的活力指數(shù)最大為12.55,與對照發(fā)芽率(80.00%)、發(fā)芽指數(shù)(13.58)和活力指數(shù)(7.37)相比,分別提高了16.64%、11.63%和70.31%(圖1)。100 mg·mL-1TraT2A處理后的促生率最低(表1),其中玉米的發(fā)芽率最低,為80.67%;豇豆的發(fā)芽指數(shù)最低,為10.01,辣椒的活力指數(shù)最低,為3.57,但均高于對照。其他濃度處理的作物的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)數(shù)值均介于上述處理濃度之間(P<0.05)。10 mg·mL-1TraT2A對5種作物的活力指數(shù)促生效果最為明顯,促生率最大,其次是發(fā)芽指數(shù),對種子發(fā)芽率的促生率最低(圖1)。除發(fā)芽率之外,黃瓜種子的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)促生率均最高,且和其他作物的促生率之間存在顯著差異;玉米的發(fā)芽率、小麥的發(fā)芽指數(shù)和小麥的活力指數(shù)促生率最低,其他作物的上述3個(gè)指標(biāo)促生率介于二者之間(P<0.05)。

表1 深綠木霉TraT2A對5種作物種子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of TraT2A from T. atroviride on seed germination of five plants

2.2 深綠木霉發(fā)酵液蛋白提取物TraT2A對5種作物幼苗生長的影響

由表2可知,4種不同濃度TraT2A處理5種作物幼苗后,其胚根、胚軸、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均顯著高于對照(P<0.05),且對不同作物的促生效果不同。其中10 mg·mL-1TraT2A促生作用最為顯著,5種作物的胚根、胚軸、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均最大,尤其對玉米的胚根、胚軸、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量促生效果最好,分別為10.24、2.78、4.25 cm和0.98 cm,相比對照分別提高了35.63%、26.17%、22.81%和53.14%;而100 mg·mL-1TraT2A促生效果最差,其中小麥的鮮質(zhì)量和辣椒的干質(zhì)量最低,分別為1.84 g和0.31 g,但均高于對照(表2),其他濃度處理的作物鮮質(zhì)量和干質(zhì)量值均介于二者之間(P<0.05)。由圖2可見,10 mg·mL-1TraT2A對5種作物的干質(zhì)量促生效果最為明顯,其次是胚根、胚軸,對鮮質(zhì)量促生率最低。除黃瓜和小麥干質(zhì)量促生效果無差異外,10 mg·mL-1TraT2A對黃瓜的胚根、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量促生效果最好,并與其他作物差異顯著(P<0.05),對豇豆干質(zhì)量以及小麥、玉米和豇豆的胚根促生效果最差。10 mg·mL-1TraT2A對辣椒胚軸促生效果最好,與其他作物胚軸之間差異顯著(P<0.05);對玉米胚軸的促生效果最差。小麥與玉米和黃瓜的鮮質(zhì)量促生效果無顯著差異,促生率均較高;對豇豆鮮質(zhì)量的促生效果最差,其促生率顯著低于其他作物(P<0.05)。

圖2 10 mg·mL-1 TraT2A對5種作物胚根、胚軸、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的促生效果Fig.2 Effects of 10 mg·mL-1 TraT2A on radicle, hypocotyl, fresh mass and dry mass of five crops

表2 深綠木霉TraT2A對5種作物幼苗生長的影響Table 2 Effects of TraT2A from T. atroviride on seedling growth of five plants

2.3 深綠木霉發(fā)酵液蛋白提取物TraT2A對5種作物幼苗生理生化特性的影響

由表3可知,10 mg·mL-1的TraT2A處理5種作物幼苗后,與對照相比明顯提高了5種作物葉綠素含量和根系活力,同時(shí)降低了丙二醛含量(P<0.05)。10 mg·mL-1TraT2A處理5種作物后,小麥葉綠素含量和辣椒根系活力最小,分別為0.0636 mg·g-1和120.67 μg·g-1·h-1,均高于對照(0.0509 mg·g-1和98.00 μg·g-1·h-1);豇豆丙二醛含量最大為0.0310 nmol·g-1,低于對照(0.0410 nmol·g-1)。10 mg·mL-1TraT2A處理5種作物后,對丙二醛含量影響最大,其次是葉綠素含量,對根系活力影響最小。由圖3可見,10 mg·mL-1TraT2A對小麥的葉綠素含量和丙二醛含量影響最大,且和其他作物之間存在顯著差異(P<0.05);對黃瓜丙二醛含量和玉米葉綠素含量影響最小;對辣椒根系活力提高最大,對黃瓜根系活力提高最小(圖3),且二者根系活力與其他作物間差異顯著(P<0.05)。

圖3 10 mg·mL-1 TraT2A對5種作物葉綠素含量、根系活力和丙二醛含量的影響Fig.3 Effects of 10 mg·mL-1 TraT2A on chlorophyll content, root activity and MAD content of five crops

表3 深綠木霉TraT2A對5種作物幼苗生理特性的影響Table 3 Effect of TraT2A from T. atroviride on physiological characteristics of five crops

3 討 論

發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)是檢驗(yàn)種子質(zhì)量的重要指標(biāo),它們的值越大,種子的活力、發(fā)芽的速率以及生長量就更好。張樹武等[28-29]研究表明,不同稀釋倍數(shù)的深綠木霉發(fā)酵液均可促進(jìn)黑麥草和白三葉草種子發(fā)芽,其中100倍發(fā)酵液處理黑麥草和白三葉草種子后,發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)分別是94.42%和96.55%,13.42和37.41,9.52和7.83,與CK相比顯著提高。本研究中,4種不同濃度的TraT2A處理5種作物種子后,與對照相比發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均有顯著提高(P<0.05)。尤其是10 mg·mL-1TraT2A處理的5種作物的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均為最高,分別是93.66%、15.16和12.55,與對照發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)(80.00%、13.58和7.37)相比,分別提高了16.64%、11.63%和70.31%(表1),與上述研究結(jié)果一致。

根系是直接吸收土壤中水分、無機(jī)鹽的重要器官,發(fā)達(dá)的根部能夠更好地起到固定和支持作用,根系形態(tài)的變化能直接影響植物生長狀況[13]。鮮質(zhì)量和干質(zhì)量是恒量植物生長的重要指標(biāo),其值越大代表植物生長越健壯。葉綠素是高等植物進(jìn)行光合作用的一類綠色色素,植物正常生長需要高效的光合作用提供能量,葉綠素含量是光合作用強(qiáng)弱的重要指標(biāo)[30]。梁松等[13]研究表明,深綠木霉T1處理番茄幼苗后,其根長、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和SPAD值相比對照分別提高了34.91%、30.27%、15.04%和20.75%。張樹武等[28-29]研究表明,100倍稀釋液處理的黑麥草和白三葉草幼苗根系長度、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的相對增長率分別為16.95%和37.09%,40.57%和57.73%,73.68%和54.35%,葉綠素的相對增長率分別為84.09%和14.02%。本研究中,4種不同濃度的TraT2A處理5種作物幼苗后,胚根、胚軸、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均顯著高于對照(P<0.05),尤其10 mg·mL-1TraT2A促生作用最為顯著,促生率最大值分別為35.63%、26.17%、22.81%、53.14%,且10 mg·mL-1的TraT2A處理5種作物幼苗后,與對照相比明顯提高了5種作物葉綠素含量和根系活力(P<0.05),最大增長量分別是24.95%和23.14%,與前人研究結(jié)果基本一致。

丙二醛的積累會對細(xì)胞質(zhì)膜等造成傷害,所以試驗(yàn)中通常利用丙二醛的含量作為膜脂過氧化指標(biāo),木霉處理后可通過減少M(fèi)DA積累以防止膜脂的過氧化作用[31]。羅軍等[30]發(fā)現(xiàn),與核盤菌處理相比深綠木霉處理的碧玉萵筍MDA最大降幅為29.48%。梁巧蘭等[18]用TraT2A 100×液處理蘭州百合植株3 d后挑戰(zhàn)接種灰霉菌(B.cinerea),將灰霉菌和蘭州百合植株分別共同培養(yǎng)1、3、5 d時(shí),百合葉片中的丙二醛含量分別是對照的0.68、0.40、0.51倍。劉暢等[31]研究表明,施加綠色木霉后,黃瓜幼苗中MDA含量有所降低,說明綠色木霉對黃瓜幼苗的生長起到了促進(jìn)作用。本研究中,10 mg·mL-1TraT2A處理5種作物后,與對照相比明顯降低了5種作物丙二醛含量 (P<0.05),最大降幅為36.69%,試驗(yàn)結(jié)果與前人研究一致。

伍曉麗等[32]研究發(fā)現(xiàn),深綠木霉發(fā)酵液原液處理的青蒿種子和幼苗與對照相比,發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)分別下降了31.06%、54.09%和35.62%,株高減少15.27%,根粗增加了8.99%,地上部干質(zhì)量增加了11.76%,可見深綠木霉發(fā)酵液原液浸泡種子后,不僅會抑制種子發(fā)芽,還會使青蒿苗變粗變矮。本文初步明確了試驗(yàn)條件下4種不同濃度的TraT2A對5種作物發(fā)芽、幼苗生長以及生理特性的影響,其促生作用機(jī)理和田間試驗(yàn)效果還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

通過研究深綠木霉T2發(fā)酵液中的蛋白提取物TraT2A對小麥、玉米、豇豆、辣椒和黃瓜種子、幼苗生長指標(biāo)和生理特性的影響,探究了TraT2A對5種作物的促生作用。研究表明,4種不同濃度TraT2A對小麥、玉米、豇豆、辣椒和黃瓜的種子和幼苗具有顯著的促生作用,10 mg·mL-1處理促生效果最好,對辣椒發(fā)芽率、黃瓜發(fā)芽指數(shù)和黃瓜活力指數(shù)的影響最顯著,其促生率分別是17.65%、46.46%、91.86%;同時(shí),10 mg·mL-1TraT2A對黃瓜胚根、辣椒胚軸、小麥鮮質(zhì)量和黃瓜干質(zhì)量的促生效果最好,促生率分別是46.28%、70.17%、23.26%、104.69%。此外,TraT2A處理5種作物幼苗后,與對照相比葉綠素含量和根系活力明顯提高(P<0.05),其中小麥葉綠素含量的促生率最大,為24.95%;辣椒根系活力的促生率最大,為23.14%。TraT2A處理使5種作物幼苗的丙二醛含量明顯降低(P<0.05),小麥降幅最大,為36.69%。因此,4種不同濃度的TraT2A處理5種作物后,10 mg·mL-1TraT2A對黃瓜的促生效果最好,其次為辣椒和小麥。