棘孢木霉對向日葵幼苗抗氧化酶活性及菌核病防效的影響

馬光恕,姜 博,廉 華,陳玉蓉,趙振涵,李 梅,李潤哲,張 渟

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)園藝園林學(xué)院,黑龍江 大慶 163319;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所,北京 100081)

向日葵(HelianthusannuusL.)是一種草本植物,屬菊科(Asteraceae)向日葵屬(Helianthus),其原產(chǎn)美國,在明代中期引入國內(nèi),是世界四大油料作物之一[1-2]。2019年,全國向日葵種植面積達(dá)85.00萬hm2,總產(chǎn)能為242.00萬t,單產(chǎn)為2 847.06 kg·hm-2[3],主要分布在中國西北、華北、東北的輕鹽堿類地區(qū)及半干旱地區(qū)[4]。

向日葵菌核病是一種世界性普遍發(fā)生的土傳病害,又稱爛盤病、白腐病,其病原菌為病原真菌核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum(Lib.)de Bary),核盤菌的寄主范圍十分廣泛,危害極嚴(yán)重[5]。隨著國內(nèi)種植向日葵面積的不斷增加,菌核病對向日葵生產(chǎn)的危害也日益加劇。在中國東北、內(nèi)蒙古等產(chǎn)區(qū),因菌核病造成向日葵地塊平均發(fā)病率達(dá)到40%～60%,最高可達(dá)到90%以上[6],嚴(yán)重影響著向日葵產(chǎn)量和品質(zhì)。

目前,對向日葵菌核病的防治主要采用農(nóng)業(yè)防治、選育抗病品種、化學(xué)防治和生物防治等措施,但是農(nóng)業(yè)防治和篩選抗病品種周期長,耗時耗力[7];化學(xué)防治雖然效果顯著,但常伴隨病菌抗藥性增強和農(nóng)藥殘留、食品安全和環(huán)境污染等問題[8]。利用生物防治是當(dāng)前非常提倡的一項措施[9],木霉(Trichodermaspp.)是目前研究和應(yīng)用最為廣泛的生防真菌類型之一。國內(nèi)已有報導(dǎo)對核盤菌有效的生防菌菌類包括盾殼霉(Coniothyriumminitans)、蠕形青霉(Penicilliumvermiculatum)、葚孢霉(Sporidesmiumsclerotivorum)、綠色木霉(Trichodermaviride)、鏈孢粘帚霉(Gliocladiumcatenulatum)、紅蛋巢菌(Nidulacandida)等類型[10]。歐洲已有兩種盾殼霉商品制劑成功應(yīng)用于生產(chǎn)實際[11]。食菌核葚孢霉(Sporidesmiumsclerotivorum)是土壤中一種專門寄生于多種核盤菌菌核上的重寄生菌,作為一種有潛力的菌核病生防菌,對各類作物菌核病的防治具有重要意義[12];紅蛋巢菌是中國農(nóng)業(yè)大學(xué)首次篩選出的對核盤菌有較強拮抗作用的生防菌,對油菜菌核病表現(xiàn)出較好的防治效果[13]。曹翠玲等[14]的研究表明,康氏木霉對向日葵菌核病具有一定的拮抗性。胡俊等[15]通過對向日葵菌核病重病地土樣中拮抗細(xì)菌的分離培養(yǎng),已初步確認(rèn)對于向日葵菌核病有較好抑制效果的拮抗菌是AO3和DE,二者均為芽孢桿菌屬。本研究擬采用前期平板對峙試驗篩選出的對向日葵菌核病防治效果達(dá)91.46%的棘孢木霉Trichodermaasperellum581菌株,系統(tǒng)研究其不同施用濃度對向日葵幼苗生長、抗氧化酶活性及對向日葵菌核病防治效果的影響,為木霉菌劑未來研發(fā)和推廣提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

(1)供試向日葵品種。豐葵雜1號,由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所廊坊試驗基地提供。

(2)供試培養(yǎng)基。馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂粉20 g,蒸餾水1 000 ml,pH值7.0～7.2,121℃高壓蒸汽滅菌30 min,冷卻后備用。

馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PD):馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,蒸餾水1 000 ml,121℃高壓蒸汽滅菌30 min,冷卻后備用。

(3)供試菌株。棘孢木霉Trichodermaasperellum581,由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所木霉菌研究組提供。

向日葵菌核病病原菌:核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum(Lib.)de Bary),由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所土傳病害生物防治研究組提供。

(4)供試土壤。將營養(yǎng)土和蛭石按照4∶1均勻混合。營養(yǎng)土壤基本理化性質(zhì)為:全氮0.84%,堿解氮137. 79 mg·kg-1,全磷130. 29 mg·kg-1,速效鉀198.63 mg·kg-1,有機質(zhì)5.63%,pH值7. 31。

1.2 木霉發(fā)酵液和病原菌孢子懸浮液的制備

(1)木霉發(fā)酵液的制備。將木霉菌在PDA培養(yǎng)基上于28℃黑暗條件培養(yǎng)3 d,從菌落邊緣取直徑5 mm的菌餅5塊,接種在含有100 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PD)的 250 mL三角瓶中,在搖床(250 rpm)上于28℃黑暗條件下振蕩培養(yǎng)7 d,制成木霉發(fā)酵液。用血球記數(shù)板測定孢子數(shù),并將木霉發(fā)酵液的孢子數(shù)調(diào)整至1.2×108個·mL-1備用。

(2)核盤菌菌絲懸浮液的制備。將向日葵病原菌在PDA培養(yǎng)基上于28℃黑暗條件下培養(yǎng)3 d,從菌落邊緣取直徑5 mm的菌餅5塊,接種在含有100 mL PD的250 mL三角瓶中,28℃、250 r·min-1振蕩培養(yǎng)3 d,用雙層紗布濾出菌絲團,將菌絲攪碎,用無菌水調(diào)整為1.2×107CFU·mL-1的菌絲懸浮液,備用。

1.3 木霉菌對向日葵抗氧化酶活性影響和菌核病防治試驗

1.3.1 試驗方法 2021年5—8月,在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所溫室內(nèi)開展相關(guān)試驗研究。試驗采用盆栽方式,將營養(yǎng)土和蛭石按照4∶1均勻混合,裝入塑料材質(zhì)的育苗盆(11 cm×11.5 cm×11.5 cm)中,每盆土重300 g。向日葵種子催芽后,每盆播種2粒,出苗后每盆保留1棵,置于陽光充足的地方,每隔1 d每盆澆無菌水100 mL。待植株長出4片真葉即播種后20 d,利用向日葵菌核病病原菌菌絲懸浮液灌根,每盆20 mL。木霉菌施用方式選擇前期試驗篩選出的最佳模式,即播種前5 d利用100mL·盆-1木霉菌懸浮液拌土+接種菌核病菌前2 d利用100 mL·盆-1木霉菌懸浮液灌根,兩次均按照下面設(shè)置濃度(T1～T4)處理。

試驗共設(shè)6個處理,木霉孢子懸浮液濃度按照單位體積孢子數(shù)設(shè)置為4個水平,分別為T1:1×103個·mL-1、T2:1×104個·mL-1、T3:1×105個·mL-1、T4:1×106個·mL-1;CK1:單獨利用向日葵菌核病菌灌根且不施用木霉懸浮液;CK2:單獨利用無菌水灌根且不施用向日葵菌核病菌和木霉懸浮液。每個處理設(shè)60盆,隨機區(qū)組設(shè)計,4次重復(fù)。

1.3.2 測定指標(biāo)與方法 接種后15 d即播種后35 d取其植株,每個處理選取20株(每個重復(fù)5株),用于測定向日葵幼苗形態(tài)指標(biāo)和物質(zhì)積累量指標(biāo),計算根冠比;同時期取其植株,每個處理選取40株(每個重復(fù)10株),用于測定向日葵抗氧化酶活性和抗病性指標(biāo)。

(1)形態(tài)指標(biāo)測定。株高:植株的莖基部到生長點之間的距離,用直尺測定;莖粗:植株子葉節(jié)下1 cm處粗度,用游標(biāo)卡尺測定。

(2)物質(zhì)積累量指標(biāo)測定。利用清水反復(fù)沖洗植株,再用吸水紙吸干,按照地上部與地下部分開后測其鮮質(zhì)量;然后將鮮樣在105℃殺青15 min后,在70℃烘至恒重,用電子天平(TB-4002 型,湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司)分別測定地上部與地下部干質(zhì)量。按照下面公式計算根冠比和壯苗指數(shù):

根冠比=地下部鮮質(zhì)量/地上部鮮質(zhì)量

壯苗指數(shù)=(莖粗/株高+地下部干質(zhì)量/地上部干質(zhì)量)×全株干質(zhì)量

(3)抗氧化酶活性測定。在接種后15 d即播種后35 d,以幼苗自上至下的3～5片葉為目標(biāo)源,采樣時間在9∶00左右,每個處理采取4個樣,每個樣含有3～6 片葉。樣品采好后迅速用錫箔紙包住并貼好標(biāo)簽放入液氮中速凍30 min,然后放入超低溫冰箱中-80℃保存。以后每隔5 d取樣1次,共取樣5次。

抗氧化酶活性利用酶標(biāo)分析儀(Rayto RT-6100)測定分析,采用植物過氧化物酶(POD)ELISA檢測試劑盒測定POD活性,以每分鐘每克鮮質(zhì)量樣品在470 nm下吸光度變化值表示酶活性大小;采用植物過氧化氫酶(CAT)ELISA檢測試劑盒測定CAT 活性,以每分鐘每克鮮質(zhì)量樣品在240 nm下吸光度變化值表示酶活性大小;采用植物超氧化物歧化酶(SOD)ELISA檢測試劑盒測定SOD活性,以每分鐘樣品的反應(yīng)體系對NBT(氮藍(lán)四唑)光化還原的抑制為50% 時為1個酶活性單位;采用植物苯丙氨酸解氨酶(PAL)ELISA檢測試劑盒測定PAL活性,以每分鐘每克鮮質(zhì)量樣品在290 nm下吸光度變化值表示酶活性大小;采用植物抗壞血酸過氧化物酶(APX)ELISA檢測試劑盒測定APX活性,以每分鐘每克鮮質(zhì)量樣品在290 nm下吸光度變化值表示酶活性大小;采用植物多酚氧化酶(PPO)ELISA檢測試劑盒測定PPO活性,以每分鐘每克鮮質(zhì)量樣品在420 nm下吸光度變化值表示酶活性大小。酶活性均以U·g-1·min-1表示。每個處理重復(fù)4次。

(4)抗病性指標(biāo)調(diào)查,包括植株發(fā)病率、病情指數(shù)、防治效果。接種病原菌后第6 d開始調(diào)查發(fā)病情況,以后每隔1 d調(diào)查1次,連續(xù)調(diào)查5次。

向日葵菌核病分級標(biāo)準(zhǔn)參照陳嫻等[16]方法,分為5級:0 級表示無病;1 級表示病斑面積占全葉10% 以下;2 級表示病斑面積占全葉10%～30%;3級表示病斑面積占全葉31%～50%;4 級表示病斑面積占全葉51% 以上。病情指數(shù)參照宗兆鋒和康振生[17]的計算方法。植株發(fā)病率為接種后15 d各處理發(fā)病株數(shù)占調(diào)查總株數(shù)的百分比。

病情指數(shù)= [∑(病級株數(shù)×代表級數(shù))÷(植株總數(shù)×最高代表級值)]×100

防治效果(%) = (對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))÷對照病情指數(shù)×100

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Microsoft Excel 2010軟件進行圖表制作,試驗數(shù)據(jù)取4次重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差,利用DPS 7.05(Data processing system)進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉菌對向日葵幼苗形態(tài)建成和物質(zhì)積累的影響

向日葵播種后35 d,T.asperellum581不同施用濃度對幼苗形態(tài)和物質(zhì)積累指標(biāo)影響如表1所示:T3即木霉菌懸浮液施用濃度為1×105個·mL-1的株高和莖粗最高,分別為19.60 cm和0.91 cm;T3株高顯著高于CK1(單獨利用向日葵菌核病菌灌根且不施用木霉懸浮液)、CK2(單獨利用無菌水灌根且不施用向日葵菌核病菌和木霉懸浮液)、T1(木霉菌懸浮液施用濃度為1×103個·mL-1)、T2(木霉菌懸浮液施用濃度為1×104個·mL-1)、T4(木霉菌懸浮液施用濃度為1×106個·mL-1),分別高64.71%、42.03%、18.79%、7.10%、13.95%;T2株高顯著高于CK1、CK2、T1、T4,分別高53.78%、32.61%、10.91%、6.40%;T4與T1株高之間的差異不顯著但二者均顯著高于CK1和CK2,分別高44.54%、24.64%和38.66%、19.57%;CK2株高顯著高于CK1(15.97%)。T3與T2、T2與T4之間莖粗差異均不顯著,T2、T3、T4均顯著高于T1,分別高31.25%、42.19%、17.19%;T1顯著高于CK1和CK2,分別高106.45%和39.13%;CK2莖粗顯著高于CK1(48.39%);CK1的莖粗最低,為0.31 cm。

表1 T. asperellum 581對向日葵幼苗形態(tài)和物質(zhì)積累指標(biāo)的影響Table 1 Effects of T. asperellum 581 on morphological formation and matter accumulation indexes of sunflower seedlings

同時,T3全株鮮質(zhì)量和全株干質(zhì)量均最高,分別為7.01 g和1.47 g;T3與T2、T4與T1之間的全株鮮質(zhì)量差異均不顯著,但T1、T2、T3、T4的全株鮮質(zhì)量均顯著高于CK1和CK2,分別高69.03%、91.76%、99.15%、82.10%和41.67%、60.71%、66.90%、52.62%;CK2全株鮮質(zhì)量顯著高于CK1(19.32%)。T3全株干質(zhì)量顯著高于CK1、CK2、T1、T2與T4,分別高188.24%、162.50%、68.97%、19.51%、32.43%;T2與T4、T4與T1、CK2與CK1之間差異均不顯著;CK1全株干質(zhì)量最低,為0.51 g。

同時,T3根冠比和壯苗指數(shù)均最高,分別為0.18和0.31;T3與T2、T4與T1之間的根冠比差異均不顯著,但T1、T2、T3、T4的根冠比均顯著高于CK1和CK2,分別高16.67%、41.67%、50.00%、16.67%和7.69%、30.77%、38.46%、7.69%;CK2與CK1之間差異不顯著。T3壯苗指數(shù)顯著高于CK1、CK2、T1、T2與T4,分別高416.67%、181.82%、93.75%、29.17%和55.00%;T2與T4、T4與T1之間差異均不顯著;CK2顯著高于CK1(83.33%);CK1壯苗指數(shù)最低,為0.06。

以上結(jié)果說明木霉不同施用濃度對向日葵幼苗株高、莖粗、全株鮮質(zhì)量、全株干質(zhì)量、根冠比和壯苗指數(shù)的作用效果有差異性表現(xiàn),T3處理對向日葵幼苗形態(tài)建成和物質(zhì)積累促進效果最強,為提高向日葵幼苗抗逆性提供了基礎(chǔ)保證。

2.2 木霉菌對向日葵幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

2.2.1 木霉菌對向日葵幼苗葉片過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性的影響T.asperellum581不同施用濃度對向日葵幼苗葉片過氧化物酶(POD)活性的影響如圖1A所示:在接種后15～35 d,不同處理的向日葵幼苗葉片中的POD活性變化有明顯規(guī)律性,即隨時間的推移POD活性先上升后下降,且在接種后25 d達(dá)到最大值。在接種后15 d,T3的POD活性最高,為11 238.12 U·g-1·min-1;T3與T2、T4與T1之間POD活性差異不顯著;T1、T2、T3、T4均顯著高于CK1、CK2,分別高25.72%、40.24%、47.66%、29.88%和10.85%、23.65%、30.20%、14.52%;CK2顯著高于CK1(13.41%);CK1的POD活性最低,為7 610.85 U·g-1·min-1。在接種后20 d,T3顯著高于CK1、CK2、T1、T2和T4,分別高43.21%、27.70%、18.30%、11.70%和13.54%;T2與T4之間差異不顯著,但二者均顯著高于CK1、CK2、T1,分別高28.21%、14.33%、5.91%和26.13%、12.47%、4.19%;T1顯著高于CK1和CK2,分別高21.06%和7.95%;CK2顯著高于CK1(12.14%);CK1的POD活性最低,為8 795.72 U·g-1·min-1。在接種后25 d,各處理POD活性均達(dá)到最大值,其中T3的POD活性最高,為14 254.98 U·g-1·min-1;T3與T2、T4與T1之間POD活性差異不顯著;T1、T2、T3、T4均顯著高于CK1、CK2,分別高22.19%、37.87%、41.88%、25.16%和7.95%、14.33%、27.70%、12.47%;CK2顯著高于CK1(12.14%),CK1的POD活性最低,為10 047.19 U·g-1·min-1。在接種后30 d,T3顯著高于CK1、CK2、T1、T2和T4,分別高69.14%、39.22%、22.78%、7.07%、10.70%;T2與T4之間差異不顯著但二者均顯著高于CK1、CK2、T1,分別高57.97%、30.03%、14.67%和52.80%、25.77%、10.91%;T1顯著高于CK1和CK2,分別高37.76%和13.39%;CK2顯著高于CK1(21.49%);CK1的POD活性最低,為7 871.89 U·g-1·min-1。在接種后35 d,T3的POD活性最高,為11 738.10 U·g-1·min-1;T3與T2、T4與T1之間POD活性差異不顯著;T1、T2、T3、T4均顯著高于CK1、CK2,分別高52.12%、60.73%、64.35%、54.41%和19.33%、26.09%、28.93%、21.13%;CK2顯著高于CK1(27.48%);CK1的POD活性最低,為7 142.02 U·g-1·min-1。

注:圖中正負(fù)誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差大小。不同小寫字母表示在同一處理時間下各處理之間差異顯著(P<0.05)。下同。Note:Values in the chart are standard error. Different lowercase letters in the same treatment time indicate that the differences reach a significant level (P<0.05)among different treatments. The same below．圖1 T. asperellum 581對向日葵幼苗葉片過氧化物酶和過氧化氫酶活性的影響Fig.1 Effects of T. asperellum 581 on peroxidase activity and catalase activity of sunflower seedlings leaves

T.asperellum581不同施用濃度對向日葵幼苗葉片過氧化氫酶(CAT)活性的影響如圖1B所示:在接種后15～35 d,不同處理的向日葵幼苗,其葉片中的過氧化氫酶活性變化有明顯的規(guī)律性,即隨時間的推移CAT活性先上升后下降,且在接種后25 d達(dá)到最大值。在接種后15 d,T3的CAT活性最高,為339.05 U·g-1·min-1;T3與T2、T4與T1之間CAT活性差異不顯著;T1、T2、T3、T4均顯著高于CK1、CK2,分別高7.52%、13.08%、15.15%、9.25%和3.94%、9.32%、11.32%、5.62%;CK2顯著高于CK1(3.44%);CK1的CAT活性最低,為294.43 U·g-1·min-1。在接種后20 d,T3的CAT活性最高,為424.40 U·g-1·min-1;T3顯著高于CK1、CK2、T1、T2和T4,分別高31.13%、22.37%、15.15%、7.01%、10.14%;T2與T4之間差異不顯著但二者均顯著高于CK1、CK2、T1,分別高22.54%、14.36%、7.61%和19.06%、11.11%、4.55%;T1顯著高于CK1和CK2,分別高13.88%和6.27%;CK2顯著高于CK1(7.15%);CK1的CAT活性最低,為323.66 U·g-1·min-1。在接種后25 d,各處理的CAT活性均達(dá)到最高值,其中T3的CAT活性最高,為620.64 U·g-1·min-1;T3顯著高于CK1、CK2、T1、T2和T4,分別高46.74%、36.28%、25.40%、8.96%、12.06%;T2與T4之間差異不顯著但二者均顯著高于CK1、CK2、T1,分別高34.67%、25.08%、15.09%和30.94%、21.62%、11.90%;T1顯著高于CK1和CK2,分別高17.02%和8.68%;CK2顯著高于CK1(7.67%);CK1的CAT活性最低,為422.96 U·g-1·min-1。在接種后30 d,T3的CAT活性最高,為446.11 U·g-1·min-1;T3與T2之間差異不顯著但二者均顯著高于CK1、CK2、T1和T4,分別高43.57%、29.02%、14.94%、7.21%和40.71%、26.45%、12.65%、5.08%;T4顯著高于CK1、CK2和T1,高33.91%、20.33%和7.20%;T1顯著高于CK1、CK2,分別高24.91%和12.25%;CK2顯著高于CK1(11.28%);CK1的CAT活性最低,為310.73 U·g-1·min-1。在接種后35 d,T3的CAT活性最高,為395.53 U·g-1·min-1;T3與T2之間差異不顯著但二者均顯著高于CK1、CK2、T1和T4,分別高35.62%、24.51%、15.14%、7.38%和32.92%、22.04%、12.86%、5.25%;T4顯著高于CK1、CK2和T1,分別高26.30%、15.95%和7.23%;T1顯著高于CK1、CK2,高17.78%和8.14%;CK2顯著高于CK1(8.92%);CK1的CAT活性最低,為291.65 U·g-1·min-1。

2.2.2 木霉菌對向日葵幼苗葉片超氧化物歧化酶(SOD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影響T.asperellum581不同施用濃度對向日葵幼苗葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響如圖2A所示:在接種后15～35 d,不同處理的向日葵幼苗葉片中SOD活性變化有明顯規(guī)律性,即隨時間的推移呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢,且在接種后25 d均達(dá)到最大值。在接種后15 d,T3的SOD活性最高,為1 613.51 U·g-1·min-1;T3與T2之間差異不顯著且二者均顯著高于CK1、CK2、T1和T4,分別高48.46%、39.26%、25.21%、10.11%和43.49%、34.59%、21.01%、6.42%;T4顯著高于CK1、CK2和T1,分別高34.83%、26.47%和13.71%;T1顯著高于CK1和CK2,分別高18.57%和11.22%;CK2顯著高于CK1(6.61%);CK1的SOD活性最低,為1 086.81 U·g-1·min-1。在接種后20 d,T3的SOD活性最高,為1 888.29 U·g-1·min-1;T3與T2之間差異不顯著且二者均顯著高于CK1、CK2、T1和T4,分別高62.90%、53.44%、39.43%、19.01%和52.17%、43.34%、30.24%、11.18%;T4顯著高于CK1、CK2和T1,分別高36.88%、28.93%、17.15%;T1顯著高于CK1和CK2,分別高16.84%和10.05%;CK2顯著高于CK1(6.61%);CK1的SOD活性最低,為1 159.16 U·g-1·min-1。在接種后25 d,T3的SOD活性最高,為2 189.21 U·g-1·min-1;T3顯著高于CK1、CK2、T1、T2和T4,分別高62.79%、51.88%、41.79%、13.08%、34.43%;T2顯著高于CK1、CK2、T1和T4,分別高43.96%、34.32%、25.40%、18.88%;T4與T1之間差異不顯著但二者均顯著高于CK1、CK2,分別高21.10%、12.98%和14.81%、7.11%;CK2顯著高于CK1(7.18%)。在接種后30 d,T3的SOD活性最高,為1 847.55 U·g-1·min-1;T3與T2、T4與T1之間差異均不顯著,T1、T2、T3、T4均顯著高于CK1和CK2,分別高24.63%、52.82%、63.41%、29.97%和13.10%、38.69%、48.29%、17.95%;CK2顯著高于CK1(10.19%);CK1的SOD活性最低,為1130.63 U·g-1·min-1。在接種后35 d,T3的SOD活性最高,為1 680.68 U·g-1·min-1;T3與T2、T4與T1之間差異均不顯著,T1、T2、T3、T4均顯著高于CK1和CK2,分別高25.78%、47.93%、59.14%、31.30%和9.86%、29.22%、39.00%、14.69%;CK2顯著高于CK1(14.49%);CK1的SOD活性最低,為1056.10 U·g-1·min-1。

圖2 T. asperellum 581對向日葵幼苗葉片超氧化物歧化酶和苯丙氨酸解氨酶活性的影響Fig.2 Effects of T. asperellum 581 on superoxide dismutase and phenylalnine ammonialyase activity of sunflower seedlings leaves

T.asperellum581不同施用濃度對向日葵幼苗葉片苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影響如圖2B所示:在接種后15～35 d,不同處理的向日葵幼苗葉片中PAL活性變化有明顯規(guī)律性,即隨時間的推移呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢,且在接種后30 d均達(dá)到最大值。在接種后15 d,T3的PAL活性最高,為200.62 U·g-1·min-1;T3與T2、T4與T1之間差異均不顯著,T1、T2、T3、T4均顯著高于CK1和CK2,分別高30.61%、58.95%、70.51%、44.20%和13.75%、38.44%、48.51%、25.60%;CK2顯著高于CK1(14.81%);CK1的PAL活性最低,為117.66 U·g-1·min-1。在接種后20 d,T3的PAL活性最高,為256.48 U·g-1·min-1;T3與T2、T4與T1之間差異均不顯著,T1、T2、T3、T4均顯著高于CK1和CK2,分別高19.15%、30.17%、39.33%、23.50%和11.81%、22.14%、30.74%、15.89%;CK2顯著高于CK1(6.57%);CK1的PAL活性最低,為184.08 U·g-1·min-1。在接種后25 d,T3的PAL活性最高,為282.89 U·g-1·min-1;T3與T2、T4與T1之間差異均不顯著,T1、T2、T3、T4均顯著高于CK1和CK2,分別高16.70%、29.41%、37.60%、22.54%和6.79%、18.42%、25.91%、12.13%;CK2顯著高于CK1(9.28%);CK1的PAL活性最低,為205.59 U·g-1·min-1。在接種后30 d,T3的PAL活性最高,為335.82 U·g-1·min-1;T3顯著高于CK1、CK2、T1、T2和T4,分別高52.57%、35.50%、23.88%、9.56%、17.79%;T2顯著高于CK1、CK2、T1和T4,分別高39.26%、23.68%、13.07%、7.52%;T4與T1之間差異不顯著但二者均顯著高于CK1、CK2,分別高29.52%、15.03%和23.16%、9.38%;CK2顯著高于CK1(12.60%);CK1的PAL活性最低,為220.11 U·g-1·min-1。在接種后35 d,T3的PAL活性最高,為304.65 U·g-1·min-1;T3與T2、T4與T1之間差異均不顯著,T1、T2、T3、T4均顯著高于CK1和CK2,分別高22.79%、37.71%、50.02%、31.65%和12.01%、25.62%、36.85%、20.09%;CK2顯著高于CK1(9.62%);CK1的PAL活性最低,為203.07 U·g-1·min-1。

2.2.3 木霉菌對向日葵幼苗葉片抗壞血酸過氧化物酶(APX)和多酚氧化酶(PPO)活性的影響T.asperellum581不同施用濃度對向日葵幼苗葉片抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性的影響如圖3A所示:在接種后15～35 d,不同處理的向日葵幼苗葉片中的APX活性變化有明顯規(guī)律性,即隨時間的推移呈現(xiàn)緩慢上升的變化趨勢。在接種后15 d,T3的APX活性最高,為1 519.04 U·g-1·min-1;T3與T2之間差異不顯著且二者均顯著高于CK1、CK2、T1和T4,分別高69.56%、39.84%、24.35%、13.64%和66.28%、37.14%、21.94%、11.44%;T4顯著高于CK1、CK2和T1,分別高49.20%、23.05%和9.42%;T1顯著高于CK1和CK2,分別高36.36%和12.46%;CK2顯著高于CK1(21.25%);CK1的APX活性最低,為895.89 U·g-1·min-1。在接種后20 d,T3的APX活性最高,為1 652.38 U·g-1·min-1;T3與T2、T4與T1之間差異均不顯著,T1、T2、T3、T4均顯著高于CK1和CK2,分別高26.42%、42.99%、49.54%、28.00%和13.99%、28.93%、34.84%、15.41%;CK2顯著高于CK1(10.91%);CK1的APX活性最低,為1 104.96 U·g-1·min-1。在接種后25 d,T3的APX活性最高,為1 706.94 U·g-1·min-1;T3與T2之間差異不顯著且二者均顯著高于CK1、CK2、T1和T4,分別高35.32%、27.80%、19.50%、9.56%和33.87%、26.43%、18.22%、8.39%;T4顯著高于CK1、CK2和T1,分別高23.51%、16.65%、9.07%;T1顯著高于CK1和CK2,分別高13.23%和6.95%;CK2顯著高于CK1(5.88%);CK1的APX活性最低,為1261.43 U·g-1·min-1。在接種后30 d,T3的APX活性最高,為2 084.93 U·g-1·min-1;T3與T2之間差異不顯著且二者均顯著高于CK1、CK2、T1和T4,分別高55.62%、33.55%、23.18%、13.99%和47.91%、26.93%、17.07%、8.34%;T4顯著高于CK1、CK2和T1,分別高36.52%、17.16%和8.06%;T1顯著高于CK1和CK2,分別高26.34%和8.42%;CK2顯著高于CK1(16.52%);CK1的APX活性最低,為1 339.75 U·g-1·min-1。在接種后35 d,T3的APX活性最高,為2 233.73 U·g-1·min-1;T3與T2之間差異不顯著且二者均顯著高于CK1、CK2、T1和T4,分別高43.39%、36.27%、29.22%、18.29%和34.19%、27.52%、20.93%、10.70%;T4顯著高于CK1、CK2和T1,分別高21.22%、15.20%和9.24%;T1顯著高于CK1和CK2,分別高10.97%和5.46%;CK2顯著高于CK1(5.23%);CK1的APX活性最低,為1 557.78 U·g-1·min-1。

圖3 T. asperellum 581對向日葵幼苗葉片抗壞血酸過氧化物酶和多酚氧化酶活性的影響Fig.3 Effects of T. asperellum 581 on ascorbate peroxidase and polyphenol oxidase activity of sunflower seedlings leaves

T.asperellum581不同施用濃度對向日葵幼苗葉片多酚氧化酶(PPO)活性的影響如圖3B所示:在接種后15～35 d,不同處理的向日葵幼苗葉片中的PPO活性變化有明顯的規(guī)律性,即隨時間的推移呈現(xiàn)緩慢上升的變化趨勢。在接種后15 d,T3的PPO活性最高,為10 031.62 U·g-1·min-1;T3顯著高于CK1、CK2、T1、T2和T4,分別高35.06%、18.05%、11.89%、5.34%、5.83%;T2與T4之間差異不顯著但二者均顯著高于CK1、CK2和T1,分別高28.21%、12.07%、6.22%和27.61%、11.54%、5.72%;T1顯著高于CK1和CK2,分別高20.70%和5.50%;CK2顯著高于CK1(14.41%);CK1的PPO活性最低,為7 427.72 U·g-1·min-1。在接種后20 d,T3的PPO活性最高,為11 096.54 U·g-1·min-1;T3與T2、T4與T1之間差異均不顯著,T1、T2、T3、T4均顯著高于CK1和CK2,分別高23.42%、37.50%、40.27%、27.85%和9.32%、21.78%、24.24%、13.24%;CK2顯著高于CK1(12.90%);CK1的PPO活性最低,為7 910.85 U·g-1·min-1。在接種后25 d,T3的PPO活性最高,為11 254.98 U·g-1·min-1;T3與T2、T4與T1之間差異均不顯著,T1、T2、T3、T4均顯著高于CK1和CK2,分別高18.16%、31.21%、34.84%、26.25%和6.32%、18.06%、21.32%、13.59%;CK2顯著高于CK1(11.14%);CK1的PPO活性最低,為8 347.19 U·g-1·min-1。在接種后30 d,T3的PPO活性最高,為12 114.72 U·g-1·min-1;T3與T2、T4與T1之間差異均不顯著,T1、T2、T3、T4均顯著高于CK1和CK2,分別高22.11%、28.08%、30.66%、25.62%和4.40%、9.51%、11.71%、7.40%;CK2顯著高于CK1(16.96%);CK1的PPO活性最低,為9 271.89 U·g-1·min-1。在接種后35 d,T3的PPO活性最高,為13 738.13 U·g-1·min-1;T3顯著高于CK1、CK2、T1、T2和T4,分別高41.16%、37.32%、19.67%、10.08%和13.18%;T2與T4之間差異不顯著但二者均顯著高于CK1、CK2和T1,分別高28.23%、24.74%、8.71%和24.73%、21.33%、5.74%;T1顯著高于CK1和CK2,分別高17.96%和14.75%;CK2顯著高于CK1(2.80%);CK1的PPO活性最低,為9 732.02 U·g-1·min-1。

說明T.asperellum581不同施用濃度對向日葵幼苗葉片POD、CAT、SOD、PAL、APX和PPO活性的影響有明顯差別,其中T3處理通過提高向日葵幼苗葉片中POD、CAT、SOD、PAL、APX和PPO酶活性,增強了向日葵植株的抗逆系統(tǒng)的功能和生理活性,提高了向日葵幼苗對菌核病的防治效果。

2.3 木霉菌對向日葵菌核病盆栽防治效果的影響

在向日葵播種后35 d,調(diào)查各處理菌核病的發(fā)病率,發(fā)病率以CK1最高,為97.58%;以T3處理發(fā)病率最低,為1.89%;T1、T2、T3、T4和CK2發(fā)病率分別為10.21%、8.76%、8.34%和26.12%。根據(jù)公式計算病情指數(shù)和防治效果,結(jié)果如圖4所示。病情指數(shù)與發(fā)病率的規(guī)律一致,均以CK1最高,為57.50;T3病情指數(shù)最低,為0.71。木霉菌對菌核病的防治效果以T3最高,為98.77%;T3顯著高于T1、T2、T3和CK2,分別高5.50%、2.97%、3.90%和41.98%;T2、T4之間差異不顯著但二者均顯著高于T1和CK2,分別高2.45%、37.86%和1.54%、36.65%;CK1的防治效果最低,為0。說明木霉不同施用濃度對向日葵菌核病的防治效果有一定影響,生產(chǎn)上選擇木霉適宜濃度施用對提高菌核病防效具有一定的積極作用。

圖4 T. asperellum 581對向日葵菌核病防效的影響Fig.4 Effects of T. asperellum 581 against Sclerotinia sclerotiorun of sunflower

3 討 論

木霉(Trichodemaspp.)是一種廣譜拮抗菌,能抑制許多種病原菌,具有很強的生防特性,目前在許多植物病害生物防治中被應(yīng)用。王子晴等[18]通過揮發(fā)性與非揮發(fā)性物質(zhì)抑菌的方法對分離自健康北細(xì)辛植株根際土壤的木霉菌株進行篩選,結(jié)果發(fā)現(xiàn),篩選得到的木霉,其非揮發(fā)性物質(zhì)對北細(xì)辛菌核病菌的抑制率均達(dá)到75%以上。康彥平等[19]通過圓盤濾膜法測定了擬康寧木霉(Trichodermakoningiopsis)非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對核盤菌的抑制作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn),核盤菌培養(yǎng)3 d后,對照組中的菌絲已擴展到整個培養(yǎng)皿;培養(yǎng)5 d后,菌核已經(jīng)形成,但未見菌絲生長,且抑制率達(dá)到100%;培養(yǎng)后12 d,菌絲生長非常緩慢,菌落致密,不能在培養(yǎng)基上擴展,甚至不產(chǎn)菌核,說明木霉及其代謝物均對核盤菌有較好的抑制效果。袁輝[20]研究發(fā)現(xiàn),木霉對小麥紋枯病具有顯著的生防效果,防治效果達(dá)89%。本試驗中T.asperellum581在平板對峙試驗中向日葵菌核病防治效果達(dá)91.46%,4種施用濃度的盆栽防效均達(dá)到93%以上。這是由于木霉菌可以通過競爭營養(yǎng)和空間、溶菌、產(chǎn)生抗生和次生代謝物來抑制病原菌[21],還可以促進植物的生長[22]、誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性提高,促進植物防御系統(tǒng)的建立,提高植物的抗逆性。我們在前期研究中做過檢測,即在木霉菌施入土壤后,檢測土壤中該木霉菌含量,用菌落形成單位表示,在施入菌劑后連續(xù)測定1 a,明確木霉菌可以在土壤中定殖。通過萌發(fā)率測定發(fā)現(xiàn),有超過95%的孢子萌發(fā)受到抑制,在4—6個月時,土壤中木霉菌檢出量與初始含量相當(dāng),在12個月時仍有該木霉菌檢出,說明該木霉菌在土壤中已經(jīng)定殖。

木霉菌可從土壤中獲取眾多養(yǎng)分,通過增加不溶性化合物的溶解性和微量營養(yǎng)素的可利用性,有效促進植物生長、干物質(zhì)積累及產(chǎn)量[23]。株高、莖粗均可作為農(nóng)作物生長水平的重要指標(biāo),通過影響株型、抗倒伏性能等,影響作物產(chǎn)量[24]。Zhao等[25]研究發(fā)現(xiàn),TrichodermaafroharzianumTM2-4培養(yǎng)濾液經(jīng)100倍稀釋處理后,番茄下胚軸長度、根長和活力指數(shù)分別提高了28.7%、19.4%、62.1%,具有產(chǎn)生生物活性物質(zhì)和促進番茄種子萌發(fā)的作用;Yani等[26]研究發(fā)現(xiàn),利用木霉(Trichodermaspp.)處理的大蒜株高、根長和塊莖質(zhì)量分別增加0.8%、9%～23%、21%～51%,通過生物治劑可以提高大蒜產(chǎn)量。本試驗中T.asperellum581的4種不同處理濃度下,向日葵幼苗株高、莖粗、全株鮮質(zhì)量、全株干質(zhì)量、根冠比和壯苗指數(shù)均顯著高于CK1,提高幅度分別為38.66%～64.71%、106.45%～193.55%、69.03%～99.15%、70.59%～188.24%、16.67%～50.00%、166.67%～416.67%,與文獻報道結(jié)果相似。因為木霉菌可以產(chǎn)生植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì),提高植物對土壤中礦物質(zhì)的吸收,直接促進植物生長發(fā)育,同時木霉提高了植物對土壤養(yǎng)分的利用率,間接促進植物生長發(fā)育[27]。

生防菌株對病原菌的生長有一定的拮抗作用,主要是通過干擾菌絲的正常生理代謝途徑來抑制多種重要酶的活性,從而抑制病原菌的生長。許多生防菌株均能誘導(dǎo)寄主增強防御保護酶的活性或抑制病原菌保護酶的活性。植物抗性主要通過防卸酶系統(tǒng)的應(yīng)答體現(xiàn)出來,防卸酶系統(tǒng)包括過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)等,它們是生物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的組成部分,能有效地防止組織細(xì)胞受到氧化損傷,并能抑制組織細(xì)胞發(fā)生膜脂過氧化[28]。在本研究中,POD、CAT、SOD、PAL、APX、PPO等6種抗氧化酶對木霉菌作用均比較敏感,并呈現(xiàn)上升的趨勢。與CK1相比,T.asperellum581在4種施用濃度下均顯著增加了POD、CAT、SOD、PAL、APX、PPO等6種保護酶的活性,其中以T3處理增幅最大,分別增加了64.35%、35.62%、59.14%、50.02%、43.39%、41.16%。宿暢等[29]研究發(fā)現(xiàn),擬康氏木霉T.pseudokoningii886處理黃瓜幼苗葉片后,對比只接種黃瓜枯萎病病原菌的處理,SOD、POD、CAT、PPO活性分別增加了46.82%、34.93%、18.75%、11.63%;梁艷瓊等[30]利用生防菌TB2處理甘蔗葉片后發(fā)現(xiàn),先噴施生防菌后接種病原菌、先接種赤腐病菌后噴施生防菌、先噴施生防菌后接種病原菌、病原菌處理、生防菌處理等處理后,與植物防御抗病相關(guān)的PPO、POD、SOD、PAL、CAT防御酶活性均比對照組高,表明TB2和赤腐病菌均能誘導(dǎo)甘蔗葉片中的防御酶活性增強。本試驗的研究結(jié)果與文獻報道結(jié)果基本一致。這是因為當(dāng)植物受病原菌侵染后,木霉等生防微生物能夠誘導(dǎo)植物抗病相關(guān)防御酶發(fā)生變化,提高植物體的抗病防御功能,而不同的保護酶活性與防御反應(yīng)之間存在著密切的聯(lián)系[31]。

4 結(jié) 論

棘孢木霉T.asperellum581不同施用濃度通過提高向日葵幼苗抗氧化酶活性促進了幼苗形態(tài)建成和物質(zhì)積累,增強了向日葵對菌核病的抗性。以T3即木霉菌懸浮液施用濃度為1×105個·mL-1處理應(yīng)用效果最好,在向日葵播種后35 d,向日葵葉片中的POD、CAT、SOD、PAL、APX和PPO活性分別比CK1提高64.35%、35.62%、59.14%、50.02%、43.39%、41.16%,向日葵幼苗株高、莖粗、全株鮮質(zhì)量、全株干質(zhì)量、根冠比和壯苗指數(shù)分別比CK1提高64.71%、193.55%、99.15%、188.24%、50.00%、416.67%,對向日葵菌核病的防效達(dá)到98.77%。