基于熵權法結合重復正交試驗優(yōu)選祛疤止癢洗劑提取工藝研究 *

牛江進 熊 丹 袁 淼 蔡小霞 藺 濤 蔣翠平 陶葉琴 謝宗明

（瀏陽市中醫(yī)醫(yī)院制劑科，湖南 瀏陽 410300）

增生性瘢痕［1］是指皮膚受創(chuàng)后纖維結締組織過度增生所導致的一種病理性瘢痕，易引起瘙癢疼痛。若處于關節(jié)部位會導致運動障礙，甚至其對外貌的損害極易導致嚴重的心理問題。因此，對瘢痕的治療具有生理和心理雙重意義［2］。西醫(yī)認為傷口邊緣張力是造成瘢痕增生的主要因素，目前臨床上常應用A 型肉毒毒素抑制瘢痕增生［3-5］。而中醫(yī)認為其病機為皮膚受創(chuàng)，正氣虛弱，邪毒外入，壅滯氣血，邪毒與體內(nèi)濁氣、瘀血、痰濕搏結于創(chuàng)傷愈合之處而成。因此中醫(yī)在治療增生性瘢痕時，多從活血化瘀、通絡止痛、化瘀散結等治則入手，內(nèi)服外治相結合應用［6］。

祛疤止癢洗劑（QBL）為瀏陽市中醫(yī)醫(yī)院燒傷整形美容科醫(yī)生10 多年的臨床經(jīng)驗總結，由野菊花、苦參、三棱等11味中藥組成，具有祛風止癢、清熱解毒、化痕消瘢的功效，可用于增生性瘢痕及瘢痕瘙癢。中藥提取工藝研究中，多指標的綜合評價是提取工藝參數(shù)優(yōu)選的關鍵步驟［7-11］。本試驗中選擇水提工藝，并以干膏得率及蒙花苷［12］含量為考查指標，并采用熵權法［13-17］對正交試驗結果進行綜合評價，確定QBL 的最佳提取工藝參數(shù)，旨在為QBL的備案申請?zhí)峁┱鎸嵖煽康臄?shù)據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器電子天平（上海浦春計量儀器有限公司，JY-202）；電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司，HWS-26）；SXKW數(shù)顯控溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；RE5205旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司，DHG-9240A）；電子天平（德國賽多利斯，BSA224S-CW）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，KQ2200）；低速離心機（長沙鑫奧儀器儀表有限公司，GENIUS 4K）；高效液相色譜儀（日本島津，LC-10AT）；隔膜真空泵（天津市津騰實驗設備有限公司，GM-0.33A）。

1.2 試藥野菊花、苦參、龍膽、地膚子、土茯苓、生地黃、麩炒蒼術、五倍子、三棱、莪術、荊芥11味藥材均購自湖南省淳芝寶藥業(yè)有限責任公司，經(jīng)瀏陽市中醫(yī)醫(yī)院主任藥師謝宗明鑒定，均為《中華人民共和國藥典》2020年版（一部）［12］收載品種；蒙花苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111528-201212），QBL溶液（自制），色譜甲醇（德國默克股份有限公司，型號：1.06007.4008）。

2 方法與結果

2.1 蒙花苷含量測定

2.1.1 對照品溶液配制精密稱取蒙花苷對照品（含量98.0%）0.0081 g，加色譜甲醇超聲溶解，定容至100 mL，制成質(zhì)量濃度為81 μg·mL-1的對照品母液。分別精密量取對照品母液1、2、4、6、8 mL 置于10 mL 容量瓶中，加色譜甲醇定容至10 mL。得蒙花苷質(zhì)量濃度分別為8.1、16.2、32.4、48.6、64.8 μg·mL-1的系列對照品溶液。

2.1.2 QBL供試品溶液制備按QBL處方稱取飲片，按正交試驗各水平組合條件進行提取，合并各次提取液，減壓濃縮（65 ℃，-0.09 MPa），定容至250 mL，量取提取液10 mL，4000 r/min，離心半徑為123 mm，離心10 min，上清液過0.22 μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液制備按QBL 處方稱取除野菊花外各味飲片，按正交試驗1 號水平組合提取，制備方法參考2.1.2項。

2.1.4 色譜條件Inertsil ODS-3C 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水-冰醋酸（26∶23∶1）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：334 nm；柱溫30 ℃；進樣量20 μL，理論塔板數(shù)按蒙花苷峰計算應不低于3000［12］。

2.1.5 方法專屬性考察分別精密吸取蒙花苷對照品溶液、QBL 供試品溶液、陰性樣品溶液，按2.1.4項下色譜條件進樣檢測分析。見圖1。

圖1 蒙花苷專屬性考察高效液相色譜圖

2.1.6 對照品溶液線性關系考察分別精確吸取系列濃度的對照品溶液各20 μL，按2.1.4 項下色譜條件進樣檢測分析。以對照品濃度（x，μg·mL-1）作為橫坐標，蒙花苷峰面積（y）作為縱坐標繪制標準曲線，計算其線性回歸方程y=37325x+101009，r=0.9995。結果表明蒙花苷濃度在8.1～81 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關系良好。

2.1.7 精密度試驗精密量取質(zhì)量濃度為48.6 μg·mL-1的對照品溶液20 μL，按2.1.4 項下色譜條件連續(xù)進樣檢測6 次，記錄蒙花苷峰面積，其RSD 為1.27%，表明儀器和方法的精密度良好。

2.1.8 重復性試驗按正交試驗1號水平組合條件提取，按2.1.2方法制備6份QBL供試品溶液，按2.1.4項下色譜條件進樣檢測，記錄蒙花苷的峰面積，計算蒙花苷含量，其RSD為2.94%。表明該方法具有良好的重復性。

2.1.9 穩(wěn)定性試驗按正交試驗3號水平組合條件提取，按2.1.2 方法制備QBL 供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12 h 時按2.1.4 項下色譜條件進樣檢測，記錄蒙花苷峰面積，計算蒙花苷含量，其RSD 為2.27%。表明供試品12 h內(nèi)較穩(wěn)定，能夠滿足檢測需求。

2.1.10 加樣回收率試驗 精密量取已知含量的供試品溶液2 mL（n=6），分別精確加入2 mL 蒙花苷對照品溶液并定容至10 mL，按照色譜條件測定，計算蒙花苷回收率和RSD。結果蒙花苷平均回收率為100.27%，RSD 為1.57%。表明該測定方法準確可靠，可用于樣品蒙花苷含量測定［13］。

2.1.11 樣品含量測定 取2.1.3 項下27 批水提液，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.4項下色譜條件測定，采用外標一點法進行計算，得各次試驗提取液中蒙花苷含量。

2.2 干膏得率測定測定方法［12］：精密量取已定容的提取液25 mL，置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥6 h，置干燥器中冷卻0.5 h，迅速精密稱定，至2 次重量差異不超過0.3 mg 為止，記錄各樣品液的干膏重量，按公式1 計算干膏得率。試驗結果見表1。

表1 正交試驗水平組合及試驗結果

注：W 為干浸膏重（g）；W1為藥材取樣量（g）；V為定容體積（mL）。

2.3 提取工藝研究

2.3.1 正交試驗設計按處方配比稱取苦參、野菊花、三棱、莪術、荊芥、麩炒蒼術、土茯苓、地膚子、龍膽、生地黃、五倍子11 味飲片共102 g。以提取次數(shù)（A）、提取時間（B）、液料比（C）、浸泡時間（D）為考察因素，設計3 個不同水平，按照L9（34）正交表進行正交組合，每個水平組合重復3次試驗［18］。因素及水平見表2，正交試驗水平組合及試驗結果見表1。

表2 正交試驗因素水平表

2.3.2 正交試驗結果按2.1.11項下方法進行樣品測定，得提取液中蒙花苷含量，按2.2 項下測定，得各樣品液干膏得率。見表1。

2.3.3 熵權法客觀賦權熵權法是根據(jù)各項指標值的變異程度來確定指標權重的客觀賦權法，其指標的變異程度越小，其對應的權值越低。計算的具體步驟按王繼龍等［16］所用方法。見表3。

表3 各指標熵值及權重

2.3.4 綜合評價考察指標綜合評分計算公式：

按公式2計算綜合評分，采用Excel對綜合評分結果進行直觀分析和方差分析［19］，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。結果見表4、表5。

表4 綜合評分計算結果及直觀分析表

表5 方差分析表

結果表明A、B、D 因素差異均極顯著（F＞F（0.01）），C 因素差異顯著（F（0.05）＜F＜F（0.01）），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。極差A＞B＞D＞C（R=9.4241＞7.1307＞2.2140＞1.4689），即提取次數(shù)對綜合評分的影響最大，影響最小的是料液比。A3＞A2＞A1、B3＞B2＞B1、C3＞C2＞C1、D1＞D3＞D2，綜合生產(chǎn)實際情況，選擇最佳提取工藝為A3B3C3D1，即加水回流提取3次，第1 次加12 倍量水，浸泡0.5 h，加熱回流2 h；第2次加10 倍量水，加熱回流1.5 h；第3 次加8 倍量水，加熱回流1 h。

2.4 工藝參數(shù)驗證為考察祛疤止癢洗劑優(yōu)選提取工藝的可靠性和穩(wěn)定性，按照優(yōu)選方案提取并重復3次試驗。結果表明出膏率的RSD 值為3.01%，蒙花苷含量的RSD值為3.78%，工藝穩(wěn)定可行，符合預期設計。

3 討論

中藥復方成分復雜，以單一成分為指標無法體現(xiàn)中藥多組分、多靶點的特點，因此，多指標評價體系已成為現(xiàn)行中藥提取工藝研究的主流方法，本研究前期擬選擇君藥苦參、野菊花特征成分及干膏得率為評價指標，但在預實驗過程中發(fā)現(xiàn)苦參特征成分苦參堿、氧化苦參堿含量測定時陰性對照存在干擾，方法專屬性較差，故只選擇蒙花苷及干膏得率為評價指標。

在多指標綜合評價過程中，指標的權重分配對評價結果影響較大。常用權重計算方法有層次分析法（AHP）和熵權法、標準離差法、CRITIC 法等。本研究采用了精度較高，客觀性較強的熵權法來計算指標權重，避免了主觀確定權重的隨意性，具有直觀性好、靈活方便等特點，且數(shù)學模型計算相對簡單，使用Excel 即可完成熵權計算，簡便易操作。

正交試驗是提取工藝優(yōu)化時常用的設計方法，可以最少的試驗次數(shù)達到與大量全面試驗等效的結果，是一種高效、快速而經(jīng)濟的多因素試驗設計方法。但中藥復方提取過程中偶然因素較多，單次試驗結果不確定性較高，而本研究通過重復試驗，有效減小了誤差，優(yōu)選的提取工藝參數(shù)可靠性更高。對優(yōu)選的參數(shù)進行3次驗證，結果表明優(yōu)選的工藝簡便可行，質(zhì)量穩(wěn)定，為QBL 的大批量生產(chǎn)提供了有效的數(shù)據(jù)支撐。