大孔樹脂富集丹參中丹酚酸B的工藝過程分析研究*

畢 赟 徐正圓 薛思敏 董靜怡 宋精梅 張宇燕

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053）

丹參是唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根莖，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰等功效，是臨床和中藥新藥開發(fā)的常用中藥。丹參中丹酚酸B 含量較高，是丹參的主要有效水溶性成分［1］，活性較強(qiáng)，對(duì)心腦血管系統(tǒng)、肝臟、腎臟、肺都有保護(hù)作用，具有清除氧自由基、抗氧化、抗炎、抗纖維化等藥理作用，對(duì)調(diào)控心血管疾病有重要作用［2-3］。

大孔吸附樹脂是一種不溶于酸、堿及各種有機(jī)溶劑的高分子聚合物。在中藥現(xiàn)代化研究中，應(yīng)用大孔樹脂分離富集中藥有效成分及中藥復(fù)方有效部位已越來越受到重視［4-7］。大孔吸附樹脂既可除去一些雜質(zhì)以提高有效部位的純度，又可確保中藥制劑的穩(wěn)定性和均一性。但因中藥及復(fù)方成分多且復(fù)雜，大孔樹脂對(duì)不同成分的吸附選擇性不同，使得復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的保留率相差也較大［8］。

本實(shí)驗(yàn)采用常規(guī)制劑工藝提取采用的醇提法回流提取丹酚酸B，優(yōu)化其提取工藝，采用大孔樹脂吸附法純化丹參提取液中的丹酚酸B，考察吸附洗脫過程中多個(gè)影響因素對(duì)純化效果的影響，分析其吸附原理。優(yōu)化、分析后得到的提取純化工藝可為含有丹參的復(fù)方及丹酚酸B 的制劑的優(yōu)化開發(fā)研究提供參考，可為進(jìn)一步推進(jìn)大孔吸附樹脂優(yōu)化中藥復(fù)方及制劑工藝開發(fā)的研究，奠定較好的實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。

1 材 料

紫外可見分光光度計(jì)（UV-2800/2802/2802S，上海恒科儀器有限公司）；電子天平（XS205，梅特勒-托利多儀器有限公司）。丹參（四川省中藥飲片有限責(zé)任公司，批號(hào)：200401）；丹酚酸B 對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：BJ0405QA18）；D201、D101、AB-8 大孔樹脂（天津市海光化工有限公司）；其余均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 建立丹酚酸B的含量測定方法

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 丹酚酸B 干燥至恒重，精密稱取5.0 mg，70%乙醇溶解并定容至10 mL，作為對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取丹參5 g，加8 倍體積的70%乙醇提取，過濾，濾液定容至100 mL，作為供試品溶液。

2.1.3 丹酚酸B 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確吸取不同體積的對(duì)照品溶液，制備成梯度濃度在287 nm 測定吸光度，計(jì)算得丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=0.021 6X-0.006 9（R=0.999 6）。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 取同一濃度對(duì)照品溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法測定5 次，計(jì)算測得吸光度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.6%，表明丹酚酸B的精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一濃度對(duì)照品溶液，分別在時(shí)間點(diǎn)0、2、4、6、8 h 測定吸光度，計(jì)算RSD=1.5%，表明丹酚酸B在8 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 按照供試品溶液的制備方法同步實(shí)驗(yàn)5 次，測定吸光度，計(jì)算丹酚酸B 濃度的RSD=3.7%。

2.1.7 加樣回收試驗(yàn) 稱取5 份相同質(zhì)量的丹參，加入等量的丹酚酸B，按照供試品溶液的制備方法同步實(shí)驗(yàn)6 次，測定吸光度，計(jì)算丹酚酸B 含量的平均回收率為104.72%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=4.41%。

2.2 丹酚酸B提取工藝的優(yōu)化研究

采用L9（34）正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，分別考察影響丹酚酸B 提取得率的因素：提取次數(shù)、提取時(shí)間、乙醇濃度，按供試品溶液的制備方法，以丹酚酸B為指標(biāo)，分析以上因素對(duì)丹酚酸B 提取工藝的影響。因素水平見表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，統(tǒng)計(jì)分析見表3。結(jié)果表明3 個(gè)因素對(duì)丹酚酸B 提取的影響程度大小順序?yàn)镃＞A＞B，最佳工藝條件為A3B2C1（即70%乙醇，回流2 h，提取1 次）。按照此最佳工藝條件，按照供試品溶液的制備方法重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次，得到丹酚酸B 的平均含量為107.12 mg/5 g。

表1 丹酚酸B提取因素水平表

表2 丹酚酸B的正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 丹酚酸B正交方差分析

2.3 大孔樹脂純化丹酚酸B的工藝研究

2.3.1 樣品溶液的制備 丹參以70%的乙醇為溶劑，溶劑量為藥材體積的8 倍，回流2 h，提取1 次，測定丹酚酸B 含量為0.21 mg/mL?；厥找掖迹盟芙舛ㄈ葜恋润w積，作為上樣液。

2.3.2 大孔樹脂型號(hào)的選擇 取經(jīng)預(yù)處理后的D201、D101、AB-8 型大孔吸附樹脂各10 mL，濕法裝柱。以1BV/h流速上樣，上樣結(jié)束后6 h靜置，用10 BV的70%的乙醇進(jìn)行洗脫，測定計(jì)算洗脫液中丹酚酸B 的含量及其轉(zhuǎn)移率，重復(fù)3 次（轉(zhuǎn)移率=洗脫液中丹酚酸B 的含量÷樣品溶液中丹酚酸B 含量）結(jié)果見表4。本實(shí)驗(yàn)選用D101型繼續(xù)開展優(yōu)化研究。

表4 不同型號(hào)大孔吸附樹脂純化后丹酚酸B的轉(zhuǎn)移率（%）

2.3.3 上樣流速的優(yōu)化研究 取預(yù)處理后的D101 型大孔吸附樹脂各5 mL，取丹參溶液各25 mL 以1、2、3、4、5 BV/h的流速上樣，上樣結(jié)束后6 h靜置。測定計(jì)算吸附后的溶液中丹酚酸B的含量及其轉(zhuǎn)移率。結(jié)果見圖1，最佳吸附流速為1 BV/h，隨流速增加，丹酚酸B的吸附效果明顯下降，5 BV/h有所回升。

圖1 上樣吸附流速對(duì)吸附的影響

2.3.4 靜態(tài)吸附時(shí)間的優(yōu)化研究 按照最佳上樣濃度上樣后，分別觀察在吸附時(shí)間1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h 后的溶液中丹酚酸B 的含量及其轉(zhuǎn)移率。結(jié)果見圖2，最佳吸附時(shí)間為6 h。

圖2 上樣吸附時(shí)間對(duì)吸附的影響

2.3.5 上樣溶液pH 值的優(yōu)化研究 將優(yōu)化后上樣液分別調(diào)pH值為3、4、5、6、7，吸附6 h后測得丹酚酸B的含量及其轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見圖3，最佳上樣樣品pH值為4。

圖3 上樣液pH值對(duì)吸附的影響

2.3.6 洗脫流速對(duì)解吸率的影響 將吸附飽和的大孔吸附樹脂各5 mL，先用蒸餾水洗滌，30%乙醇溶液100 mL除去懸浮物和雜質(zhì)等，再用70%乙醇溶液100 mL進(jìn)行洗脫，分別以1、2、3、4、5 BV/h 流速進(jìn)行洗脫，取樣測定計(jì)算洗脫溶液中丹酚酸B的含量，再計(jì)算其轉(zhuǎn)移率。結(jié)果見圖4，最佳洗脫流速為1 BV/h。

圖4 洗脫流速對(duì)解吸率的影響

2.3.7 洗脫劑濃度對(duì)解吸率的影響 將吸附飽和的大孔吸附樹脂各5 mL，用蒸餾水洗滌，再用濃度為10%、30%、50%、70%、90%的乙醇溶液每種100 mL 以1 BV/h 的流速進(jìn)行洗脫，測定計(jì)算丹酚酸B 的解吸率，結(jié)果見圖5，最佳洗脫乙醇濃度為70%。

圖5 洗脫濃度對(duì)解吸率的影響

2.3.8 大孔樹脂純化工藝的驗(yàn)證 按照以上吸附、洗脫條件的優(yōu)化結(jié)果，即上樣液pH 值為4，上樣流速為1 BV/h，吸附6 h，70%乙醇為洗脫劑，以1 BV/h 速度洗脫，洗脫液定容測定丹酚酸B的含量并計(jì)算其得率，結(jié)果得率為56.8%。

2.4 大孔樹脂吸附丹酚酸B的動(dòng)力學(xué)分析

2.4.1 吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn) 取預(yù)處理好的大孔樹脂10 mL裝入50 mL 錐形瓶中，加20 mL 樣品溶液在35 ℃的搖床振蕩器中，以100 r/min 的振速振蕩吸附，分別在2、5、10、15、20、30、40、60、90、120、180、300 min 收集溶液，測量并計(jì)算丹酚酸B 的含量，見表5。以吸附量為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制吸附曲線，見圖6。

圖6 大孔樹脂吸附丹酚酸B的動(dòng)力學(xué)過程

表5 大孔樹脂吸附丹酚酸B的動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

吸附量的計(jì)算公式：Qt=（C0-Ct）V/vM。

Qt為即時(shí)吸附量，Co為樣品溶液起始質(zhì)量濃度，V為樣品溶液體積，v 為樹脂體積，M 為對(duì)照品丹酚酸B的摩爾質(zhì)量，Ct為即時(shí)的溶液質(zhì)量濃度。

2.4.2 吸附動(dòng)力學(xué)方程擬合 運(yùn)用準(zhǔn)一級(jí)和準(zhǔn)二級(jí)速率方程來擬合大孔樹脂對(duì)丹參溶液的吸附過程，再用Weber and Morris 顆粒內(nèi)擴(kuò)散方程對(duì)擴(kuò)散機(jī)理進(jìn)行分析［8］。采用以下方程對(duì)動(dòng)力學(xué)過程的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合，分析大孔樹脂吸附丹酚酸B 的吸附過程。使用origin軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果見表6。

表6 動(dòng)力學(xué)模型擬合方程及模型參數(shù)

1）Lagergren 準(zhǔn)一級(jí)速率方程：主要適用于固體-液體吸附體系的模型。

公式：ln（Q1-Qt）=lnQ1-K1t。

F 代表t時(shí)刻的吸附分?jǐn)?shù)，Q1為一級(jí)吸附平衡時(shí)的吸附量，K1為一級(jí)速率常數(shù)。

以ln（Q1-Qt）對(duì)t 進(jìn)行線性回歸，若R2＞0.9，可表明薄膜擴(kuò)散是控制該吸附的因素。

2）準(zhǔn)二級(jí)速率動(dòng)力學(xué)方程。

公式：t/Qt=1/（K2×Q22）+tQ2。

Q2為二級(jí)吸附平衡時(shí)的吸附量，其中K2為二級(jí)速率常數(shù)。若R2＞0.9，可表明顆粒內(nèi)擴(kuò)散是控制該吸附過程的因素。

3）顆粒內(nèi)擴(kuò)散模型：Webber and Morris 等采用顆粒內(nèi)擴(kuò)散模型對(duì)吸附過程進(jìn)行描述。

其中，K3為樹脂顆粒內(nèi)擴(kuò)散速率常數(shù)，C 為任意常數(shù)。以Qt對(duì)進(jìn)行線性回歸，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，如果結(jié)果是過原點(diǎn)的一條直線，那么表明該吸附過程只受到一個(gè)過程影響，如果擬合結(jié)果為不經(jīng)過原點(diǎn)的分段式曲線，那么表明這個(gè)過程受到兩種或多種擴(kuò)散過程共同影響。

結(jié)果顯示準(zhǔn)一級(jí)速率方程擬合中R2=0.97，準(zhǔn)二級(jí)速率方程擬合中R2=0.99，表明該吸附過程采用準(zhǔn)二級(jí)速率方程能更好擬合，準(zhǔn)二級(jí)速率方程能更好描述該吸附過程。

本實(shí)驗(yàn)中Webber and Morris 方程擬合得到的直線未過原點(diǎn)，說明吸附過程受到薄膜擴(kuò)散和內(nèi)擴(kuò)散的共同影響，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的擬合曲線分成了2 段，第1 階段為薄膜擴(kuò)散，第2 階段為內(nèi)擴(kuò)散，兩階段中的速率常數(shù)K3對(duì)比，第1階段的速率常數(shù)大得多，表明薄膜擴(kuò)散為主要速率控制步驟。

3 討 論

丹參中丹酚酸B 具有組織修復(fù)及腦神經(jīng)保護(hù)、促進(jìn)記憶等作用［9-16］。傳統(tǒng)的中藥配伍提取常用溶劑為大量的水，丹酚酸B為水溶性成分，具有較重要的藥理活性，常作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)之一［17-19］。中藥中分離純化技術(shù)，對(duì)中醫(yī)藥現(xiàn)代化進(jìn)程的研究，包括制劑開發(fā)和中醫(yī)藥理論的現(xiàn)代闡述，具有重要的意義。中藥研究需要分離純化化學(xué)成分，也需要分離分析中藥產(chǎn)生藥效的科學(xué)理論依據(jù)，因此對(duì)丹參等中藥材開展分離分析的動(dòng)力學(xué)原理研究非常有必要。

大孔吸附樹脂不僅理化性質(zhì)穩(wěn)定、選擇性好、吸附能力強(qiáng)，而且易洗脫、可循環(huán)使用，再生處理經(jīng)濟(jì)環(huán)保，處理后能減小服用劑量和降低制劑的吸潮性、方便制劑成型，提高制劑穩(wěn)定性等，已廣泛應(yīng)用于中藥及其復(fù)方中活性成分的精制分離、去除有害雜質(zhì)，得到了工業(yè)化推廣應(yīng)用。由于中藥成分復(fù)雜多樣，各成分間的理化性質(zhì)差別大，提取分離純化過程中也存在相互影響，導(dǎo)致動(dòng)力學(xué)過程千變?nèi)f化，不同型號(hào)的大孔樹脂對(duì)同一成分的吸附性能不同，同一型號(hào)對(duì)不同成分吸附也不同，而且很難用一種樹脂對(duì)所有的中藥活性成分進(jìn)行分離純化。大量研究表明，樹脂的型號(hào)、質(zhì)量、安全性、穩(wěn)定性及再生性方面還存在一些具體的技術(shù)問題，樹脂的吸附及洗脫工藝受多種因素影響，在工業(yè)化實(shí)際應(yīng)用中需通過對(duì)每個(gè)成分或有效部位的優(yōu)化研究確定最佳條件，才能符合工業(yè)化生成需要，同時(shí)不影響臨床療效。

本實(shí)驗(yàn)通過正交設(shè)計(jì)優(yōu)化丹參中丹酚酸B 的提取工藝，分析乙醇濃度、回流時(shí)間、回流次數(shù)等因素對(duì)丹酚酸B 提取過程的影響，得到最佳工藝條件：70%乙醇提取2 h，提取1 次。在此基礎(chǔ)上，通過吸附效果評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)移率，篩選出D101型大孔吸附樹脂開展純化工藝研究，單因素考察上樣流速、靜態(tài)吸附時(shí)間、上樣溶液pH值、洗脫劑濃度、洗脫流速等因素的影響，優(yōu)化最佳純化工藝條件為：上樣液pH 值為4，上樣流速為1 BV/h，吸附6 h，70%乙醇為洗脫劑，以1 BV/h 速度洗脫。大孔樹脂吸附丹酚酸B 動(dòng)力學(xué)研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，準(zhǔn)二級(jí)速率方程能更好描述D101 型大孔吸附樹脂對(duì)丹酚酸B 的吸附過程，并且此過程受到薄膜擴(kuò)散和內(nèi)擴(kuò)散的共同影響，且主要速率影響因素為薄膜擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到的丹酚酸B 提取純化工藝條件，可為含有丹參的復(fù)方及丹酚酸B的制劑的優(yōu)化開發(fā)研究提供依據(jù)，對(duì)吸附過程的動(dòng)力學(xué)分析也有助于為中藥材的工業(yè)化、臨床配伍及中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究提供參考。