安腦平?jīng)_湯調(diào)控基于BDNF/TrkB信號通路對腦出血大鼠的腦神經(jīng)保護(hù)作用研究*

陳小紅 劉艷華 王 旭 周旭晴 周德生 雷詩卉 楊 益 郭 純

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

腦出血（ICH）是臨床常見的腦卒中亞型，具有發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高的特點(diǎn)。在全球范圍內(nèi)，ICH約占全部腦卒中的27.9%，我國大多數(shù)地區(qū)每年的發(fā)病率達(dá)到了48.6～57.4/10 萬人［1］，ICH 的病死率在1個月內(nèi)約為40%，1年內(nèi)約為54%，只有12%～39%的患者能夠?qū)崿F(xiàn)長期的功能獨(dú)立［2］，已經(jīng)嚴(yán)重影響了居民的健康，并造成了沉重的家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。ICH 的病理機(jī)制非常復(fù)雜，至今尚未完全闡明，由血腫及紅細(xì)胞裂解產(chǎn)物等引起的繼發(fā)性腦損傷（SBI）是ICH 后長期的病理損傷中關(guān)鍵的破壞性事件，而神經(jīng)元凋亡是SBI的主要機(jī)制之一［3］。廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)中的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）能促進(jìn)神經(jīng)元及突觸的形成、維持神經(jīng)元形態(tài)、增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞的可塑性，并能抑制ICH后SBI的進(jìn)一步發(fā)展［4］。

安腦平?jīng)_湯是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院治療ICH 的經(jīng)驗(yàn)方，臨床應(yīng)用多年，具有顯著減輕ICH 患者腦水腫和促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的作用［5-6］。本實(shí)驗(yàn)通過建立ICH 大鼠模型，觀察安腦平?jīng)_湯對ICH 模型大鼠血腫周圍腦組織中BDNF/TrkB信號通路及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，探討其在ICH 后的腦神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 10～12 周清潔級SD 雄性健康大鼠72只，體質(zhì)量250～280 g，購自湖南斯萊克達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004。動物飼養(yǎng)在湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心，使用許可證號：SYXK（湘）2020-0010。飼養(yǎng)條件：（23±2）℃，相對濕度40%～60%，自由進(jìn)食、飲水。實(shí)驗(yàn)遵循實(shí)驗(yàn)動物倫理規(guī)范，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 藥物 安腦平?jīng)_湯：生龍骨30 g（先煎），生牡蠣30 g（先煎），川牛膝15 g，白蒺藜12 g，鉤藤12 g（后下），澤瀉12 g，牡丹皮12 g，梔子12 g，黃芩12 g，白芍12 g，大黃9 g（后下），甘草6 g。飲片均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房，以10 倍水煎煮后水浴濃縮至1.5 g 生藥/mL，4 ℃冰箱備用。奧拉西坦片（石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字號H20031033；規(guī)格：0.4 g/片）用時配制為21.6 mg/mL溶液。

1.3 試劑與儀器 尼氏染色液，北京Solarbio（G1430）；Tunel凋亡檢測試劑盒，上海碧云天（C1091）；BCA蛋白濃度測定試劑盒，北京Biosharp（BL521A）；RIPA 裂解液，武漢博士德（AR0105）；超敏ECL 化學(xué)發(fā)光盒，北京Biosharp（BL523A）；重組Anti-BDNF 抗體，英國abcam（ab108319）；重組Anti-TrkB抗體，英國Abcam（ab187041）；重組Anti-Bcl-2 抗體，英國abcam（ab182858）；重組Anti-Bax抗體，英國Abcam（ab182733）；Goat Anti-Rabbit IgG，北京Biosharp（E030120）。68025 標(biāo)準(zhǔn)型單臂腦立體定位儀（瑞沃德）；AUW120D 精密電子天平（日本島津）；Z32HK 高速冷凍離心機(jī)（賀默）；Enspire 多功能酶標(biāo)儀（美國Perkinelmer）；BX43 熒光顯微鏡（奧林巴斯）；FluorChem R 多功能分子定量分析系統(tǒng)（美國Proteinsimple）；Mini Protean tetra cell 蛋白印記系統(tǒng)（伯樂）；超靈敏多色熒光成像分析系統(tǒng)（美國Protein-Simple）。

1.4 模型制備 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3～4 d，術(shù)前6 h 內(nèi)禁食。術(shù)時以25%烏拉坦腹腔注射麻醉，心臟采血100 μL。大鼠俯臥位固定在腦立體定位儀上，前囟與后囟保持在統(tǒng)一水平上，頭頂備皮消毒，正中切開1 cm，暴露顱骨，于冠狀縫前1 mm，中線左旁開3 mm 處鉆開約1 mm 小孔，垂直向下進(jìn)針。參考周中和等［7］提供的二次注血退針法，微量注射器針頭與鉆孔的方向垂直進(jìn)針6 mm 到達(dá)尾狀核處，先勻速注血50 μL，停止注血5 min，然后再次勻速注血50 μL，針留10 min后退針約2 mm，再次停針4 min 后將針拔出，縫合頭皮、消毒。將大鼠保溫至蘇醒后分籠喂養(yǎng)。

1.5 分組及給藥 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和造模組，造模組大鼠采用自體血注射法進(jìn)行造模，造模成功后隨機(jī)分成模型組、安腦平?jīng)_湯組、奧拉西坦組，每組分1、3、7 d 3 個時間點(diǎn)，每個時間點(diǎn)6 只。根據(jù)體表面積-劑量換算法，各組于蘇醒后均以0.5 mL/100 g 給藥1 次，之后每隔12 h 給藥1 次，每日2 次。假手術(shù)組、模型組予蒸餾水灌胃，治療組分別予安腦平?jīng)_湯（1.5 g生藥/mL）和奧拉西坦水溶液（21.6 mg/mL）。根據(jù)各組相應(yīng)時間點(diǎn)對應(yīng)的天數(shù)給藥，給藥期間各組動物均自由活動、進(jìn)食。

1.6 神經(jīng)功能評分 采用改良神經(jīng)功能缺損評分法（mNSS）進(jìn)行大鼠神經(jīng)功能評判，其中提尾試驗(yàn)（0～3分）、行走試驗(yàn)（0～3 分）、感覺試驗(yàn)（0～2 分）、平衡木試驗(yàn)（0～6 分）、反射喪失和不正常運(yùn)動（0～4 分），最高18分。0 分為神經(jīng)功能未受損傷，1～6 分為輕度損傷，7～12分為中度損傷，13～18分為重度損傷。

1.7 標(biāo)本采集與檢測 1）腦組織尼氏染色及Tunel染色。各組每個時間點(diǎn)隨機(jī)選3只大鼠，末次灌胃后2 h，麻醉后用4%多聚甲醛經(jīng)左心室灌注固定，取全腦，于4%多聚甲醛中固定1 d 以上，常規(guī)脫水、石蠟包埋，切片厚5 μm，脫蠟，嚴(yán)格按照尼氏染色和Tunel染色試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，染色后于顯微鏡下觀察，Tunel染色切片于血腫周圍隨機(jī)選取3 個不重疊視野，計(jì)算細(xì)胞凋亡率（凋亡細(xì)胞數(shù)÷總細(xì)胞數(shù)×100%）。2）Western blotting 檢測BDNF、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子受體（TrkB）、兔抗人單克隆抗體（Bax）、Bcl-2 蛋白。各組每個時間點(diǎn)余下3 只大鼠，末次灌胃后2 h，麻醉后取全腦，分離出血周圍腦組織于-80 ℃冰箱保存。檢測時，提取各組大鼠腦組織總蛋白，BCA 蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行蛋白定量，電泳分離總蛋白，轉(zhuǎn)膜封閉后，依次滴加一抗：BDNF（1∶5 000）、TrkB（1∶5 000）、Bax（1∶9 000）、Bcl-2（1∶5 000）、β-actin（1∶6 000）和二抗（1∶8 000）孵育，滴加ECL顯影，超靈敏多色熒光成像分析系統(tǒng)下曝光分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，檢驗(yàn)方法采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，組間多重比較采用LSD 法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 見表1。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠各時間點(diǎn)（1、3、7 d）神經(jīng)功能缺損評分明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，安腦平?jīng)_湯組、奧拉西坦組3、7 d神經(jīng)功能缺損評分均有所降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各組大鼠各時間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評分比較（±s）

表1 各組大鼠各時間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評分比較（±s）

注：與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與假手術(shù)組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。下同。

組 別假手術(shù)組模型組安腦平?jīng)_湯組奧拉西坦組n6 6 6 6 1 d 0.00±0.00 13.00±2.10△△11.67±2.07 11.83±1.72 3 d 0.00±0.00 12.50±1.64△△9.83±1.72*10.00±2.10*7 d 0.00±0.00 12.17±2.14△△9.00±1.67**9.17±2.14**

2.2 各組大鼠血腫周圍腦組織尼氏染色情況 假手術(shù)組各時間點(diǎn)大鼠腦組織細(xì)胞排列整齊，尼氏小體包裹在細(xì)胞核周邊，形態(tài)清晰可辨，數(shù)量豐富；模型組神經(jīng)細(xì)胞損傷明顯，胞核出現(xiàn)固縮、破碎或溶解，尼氏小體固縮減少。給予安腦平?jīng)_湯治療后，胞核固縮、破碎減少，尼氏小體固縮減少得到明顯改善，效果優(yōu)于奧拉西坦，且隨著用藥時間的延長，改善效果越好。見圖1。

圖1 各組大鼠各時間點(diǎn)血腫周圍腦組織（尼氏染色，200倍）

2.3 各組大鼠血腫周圍腦組織細(xì)胞凋亡率比較 見圖2、表2。顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況，棕褐色細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。假手術(shù)組腦切片顯示無棕褐色凋亡細(xì)胞；與假手術(shù)組相比，模型組和各藥物組大鼠各時間點(diǎn)的細(xì)胞凋亡率明顯增大（P＜0.01）；與模型組相比，安腦平?jīng)_湯組、奧拉西坦組各個時間點(diǎn)的細(xì)胞凋亡率均降低（P＜0.05或P＜0.01）。

圖2 各組大鼠各時間點(diǎn)血腫周圍腦組織（Tunel染色，200倍）

表2 各組大鼠各時間點(diǎn)血腫周圍腦組織細(xì)胞凋亡率比較（%，±s）

表2 各組大鼠各時間點(diǎn)血腫周圍腦組織細(xì)胞凋亡率比較（%，±s）

組 別假手術(shù)組模型組安腦平?jīng)_湯組奧拉西坦組n3 3 3 3 1 d 0.00±0.00 98.50±2.60△△31.57±7.73**52.77±9.41*3 d 0.00±0.00 91.10±5.02△△31.77±8.38**60.67±3.87*7 d 0.00±0.00 83.77±2.63△△28.17±8.55**46.30±7.44**

2.4 各組大鼠血腫周圍腦組織BDNF、TrkB、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)比較 見表3、表4、圖3。與假手術(shù)組比較，模型組各時間點(diǎn)BDNF、TrkB、Bax 的表達(dá)及Bax/Bcl-2值均升高（P＜0.05或P＜0.01），而Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，安腦平?jīng)_湯組各時間點(diǎn)BDNF、TrkB、Bcl-2表達(dá)升高（P＜0.05或P＜0.01），Bax 的表達(dá)及Bax/Bcl-2 值降低（P＜0.05）；奧拉西坦組3 d的TrkB、BDNF、Bcl-2表達(dá)升高（P＜0.05或P＜0.01），所有時間點(diǎn)Bax的表達(dá)均降低（P＜0.05或P＜0.01）。

圖3 各組大鼠各時間點(diǎn)血腫周圍組織BDNF、TrkB、Bax、Bcl-2蛋白電泳條帶

表3 各組大鼠各時間點(diǎn)血腫周圍腦組織BDNF、TrkB、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)比較（±s）

表3 各組大鼠各時間點(diǎn)血腫周圍腦組織BDNF、TrkB、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)比較（±s）

組 別假手術(shù)組（n=3）模型組（n=3）安腦平?jīng)_湯組（n=3）奧拉西坦組（n=3）時間1 d 3 d 7 d 1 d 3 d 7 d 1 d 3 d 7 d 1 d 3 d 7 d BDNF 0.29±0.07 0.47±0.00 0.43±0.17 0.76±0.17△0.71±0.10△1.00±0.09△1.29±0.27*1.38±0.19**1.43±0.13*1.14±0.28 0.95±0.11*1.25±0.36 TrkB 0.56±0.13 0.56±0.02 0.61±0.12 0.78±0.23△0.78±0.11△1.01±0.11△1.22±0.25*1.22±0.19**1.31±0.10*1.17±0.18 1.17±0.08**1.14±0.25 Bax 0.68±0.05 0.58±0.08 0.47±0.04 1.24±0.22△△1.12±0.25△△1.05±0.02△△0.87±0.22*0.70±0.21*0.68±0.11**0.89±0.09*0.72±0.27*0.70±0.13**Bcl-2 1.31±0.13 1.25±0.18 1.33±0.24 0.63±0.09△△0.57±0.10△△0.47±0.14△△1.15±0.20**1.12±0.01**0.84±0.03*0.84±0.09 0.94±0.13**0.66±0.06

表4 各組大鼠各時間點(diǎn)血腫周圍腦組織Bax/Bcl-2值比較（±s）

表4 各組大鼠各時間點(diǎn)血腫周圍腦組織Bax/Bcl-2值比較（±s）

組 別假手術(shù)組模型組安腦平?jīng)_湯組奧拉西坦組n3 3 3 3 1 d 0.52±0.04**2.04±0.57 0.77±0.23**1.08±0.20**3 d 0.47±0.03**1.96±0.18 0.62±0.19**0.75±0.20**7 d 0.36±0.10**2.35±0.70 0.81±0.11**1.07±0.16**

3 討 論

ICH是非外傷性的腦實(shí)質(zhì)內(nèi)血管破裂引起的出血，出血后腦實(shí)質(zhì)中的血液誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡、細(xì)胞毒性、神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激、腦水腫等導(dǎo)致SBI［8］。SBI會在血腫周圍擴(kuò)散并對神經(jīng)元造成持續(xù)性的損傷，導(dǎo)致神經(jīng)元的大量死亡和機(jī)體的神經(jīng)功能受損，致使神經(jīng)功能難以恢復(fù)［9］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，安腦平?jīng)_湯能夠降低ICH大鼠的神經(jīng)功能缺損評分，減少神經(jīng)元死亡和變性，對神經(jīng)元起到保護(hù)作用，并促進(jìn)其神經(jīng)功能恢復(fù)。

BDNF 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)多種功能的重要調(diào)節(jié)因子。在ICH后SBI中，BNDF可識別TrkB受體為損傷的神經(jīng)元提供必要的營養(yǎng)，發(fā)揮神經(jīng)元存活、分化、神經(jīng)發(fā)生和突觸發(fā)生等作用，促進(jìn)損傷后的運(yùn)動和感覺功能恢復(fù)［10］。有研究發(fā)現(xiàn)，激活BDNF/TrkB 通路可有效調(diào)節(jié)大腦氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥反應(yīng)［11］；ICH 后，上調(diào)BDNF、TrkB 的表達(dá)能誘導(dǎo)M2 小膠質(zhì)細(xì)胞極化，促進(jìn)神經(jīng)元和神經(jīng)功能的恢復(fù)［12］。神經(jīng)元凋亡被認(rèn)為是SBI的主要機(jī)制之一［13］，正常情況下，Bax和Bcl-2蛋白在腦組織中表達(dá)水平處于一個相對平衡穩(wěn)定的狀態(tài)以調(diào)控神經(jīng)元凋亡［14］。ICH 后，受各種損傷因素影響，Bax 表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2 表達(dá)受到抑制，穩(wěn)態(tài)失序，故不能有效抑制細(xì)胞凋亡［15］，Bax/Bcl-2 比值是判定細(xì)胞凋亡或存活狀態(tài)的有效指標(biāo)，Bcl-2家族更被認(rèn)為是未來治療繼發(fā)性腦損傷的強(qiáng)大干預(yù)目標(biāo)［16］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ICH 模型大鼠血腫周圍腦組織Bax/Bcl-2值和細(xì)胞凋亡率均顯著提高，而安腦平?jīng)_湯可通過上調(diào)BDNF、TrkB，調(diào)節(jié)Bax 和Bcl-2 的表達(dá)，降低細(xì)胞凋亡率并發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

ICH 在中醫(yī)學(xué)屬“出血性中風(fēng)”范疇，其病機(jī)主要為陰陽失調(diào)，氣血逆亂?，F(xiàn)代醫(yī)家提出沖氣上逆為出血性中風(fēng)的關(guān)鍵病機(jī)，并根據(jù)潛攝沖脈、通調(diào)氣血的治則創(chuàng)制安腦平?jīng)_湯［5］。方中以生龍骨、生牡蠣平肝潛陽，白芍?jǐn)扛侮幰跃徏?；以黃芩、梔子清降肺氣；大黃通腑以降胃氣，澤瀉利水化濁，二竅通則邪氣去、腦竅清；鉤藤清肝息風(fēng)，白蒺藜平肝解郁、祛風(fēng)活血，二者質(zhì)輕兼具風(fēng)性，易引藥上行通達(dá)腦絡(luò)而息風(fēng)活血開郁；川牛膝、牡丹皮涼血活血、化瘀通絡(luò)；甘草調(diào)和諸藥。全方含“平?jīng)_、降沖、斂沖”之意，沖氣平則氣血平，郁滯去則腦絡(luò)通，腦神清寧。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，安腦平?jīng)_湯能夠有效抑制大鼠ICH 后SBI 的發(fā)生發(fā)展，促進(jìn)神經(jīng)元和神經(jīng)功能的恢復(fù)［17］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，安腦平?jīng)_湯中所含有的中藥成分白蒺藜皂苷能夠提高BDNF、p-TrkB mRNA 表達(dá)，通過BDNF/TrkB 信號通路能有效改善糖尿病視網(wǎng)膜病變［18］。本研究表明，安腦平?jīng)_湯可通過激活BDNF/TrkB 信號通路抑制ICH 后神經(jīng)細(xì)胞凋亡，對ICH大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用。