傳統(tǒng)泡菜中高產(chǎn)酸乳酸菌的篩選與鑒定

鄭琦鍇，蔡常宇，王臨好，廖振林

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642）

泡菜是一種中國(guó)傳統(tǒng)的發(fā)酵蔬菜食品，富含維生素、礦物質(zhì)、有機(jī)酸和乳酸菌[1]，乳酸菌的作用包括抑制有害微生物的生長(zhǎng)繁殖及產(chǎn)生獨(dú)特的風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)發(fā)酵泡菜的品質(zhì)有著重要影響[2]。蔬菜發(fā)酵后風(fēng)味會(huì)得到改善，保藏期會(huì)延長(zhǎng)[3]。任亭等[4]通過從涪陵本地傳統(tǒng)泡菜中分離篩選出1株魏斯氏菌（Weissella），與植物乳植桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）結(jié)合純種發(fā)酵麻竹筍泡菜，發(fā)現(xiàn)純種發(fā)酵總酸含量明顯高于自然發(fā)酵，風(fēng)味評(píng)定發(fā)現(xiàn)純種發(fā)酵分為評(píng)分明顯高于自然發(fā)酵組，改善了酸菜的口感。

乳酸菌除了對(duì)泡菜的風(fēng)味有重要影響外，在發(fā)酵中也有著各種益生作用，產(chǎn)生多種有益物質(zhì)，如高產(chǎn)酸能力[5]、抗氧化[6]、降解亞硝酸鹽[7]、產(chǎn)γ-氨基丁酸[8]和降解生物胺[9]。許多學(xué)者從泡菜中分離出各種功能的乳酸菌。趙鑫等[10]從泡菜中分離出兩株高抗氧化性能的乳酸菌，分別為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）（Z2）、植物乳植桿菌（Z5）。劉義等[11]從泡菜中分離出一株產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌QH 18-4，對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、腸道沙門氏菌（Salmonella enterica）、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtili）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、綠膿假單胞桿菌（Pseudomonas aeruginosa）有不同程度的抑制作用。呂嘉櫪等[12]從發(fā)酵果蔬中分離了18株抑制α-葡萄糖苷酶的乳酸菌，最高抑制率為37.48%。所以，泡菜中有許多優(yōu)良功能的乳酸菌，對(duì)泡菜中乳酸菌進(jìn)行研究，有巨大前景。

以傳統(tǒng)發(fā)酵食品為研究對(duì)象，篩選出有益乳酸菌能控制食品發(fā)酵中的有益物質(zhì)成分，了解發(fā)酵過程中的動(dòng)態(tài)變化，對(duì)食品發(fā)酵工業(yè)的未來發(fā)展有重要意義[13-15]。本研究以湖南省地區(qū)家庭自制有50余年歷史的泡菜液為樣品，采用分離培養(yǎng)方法鑒定乳酸菌，再對(duì)分離得到的乳酸菌進(jìn)行溶血活性檢驗(yàn)，產(chǎn)酸性能測(cè)定，并研究高產(chǎn)酸菌株的生長(zhǎng)特性、耐酸耐膽鹽、自聚集能力、疏水性、抗氧化、降解亞硝酸鹽及生物安全性等，為挖掘傳統(tǒng)發(fā)酵食品中乳酸菌資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

取自湖南洞口兩個(gè)家庭自制泡菜液，發(fā)酵起始于1968年，用無菌瓶包裝，于4 ℃保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉5 g/L，葡萄糖20 g/L，硫酸鎂0.1 g/L，硫酸錳0.05 g/L，檸檬酸三銨2 g/L，無水乙酸鈉5 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，吐溫80 1 g/L，用三級(jí)水溶解。

MRS固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉5 g/L，葡萄糖20 g/L，硫酸鎂0.1 g/L，硫酸錳0.05 g/L，檸檬酸三銨2 g/L，無水乙酸鈉5 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，吐溫80 1 g/L，瓊脂15 g/L，用三級(jí)水溶解。

CaCO3-MRS固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉5 g/L，葡萄糖20 g/L，硫酸鎂0.1 g/L，硫酸錳0.05 g/L，檸檬酸三銨2 g/L，無水乙酸鈉5 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，吐溫80 1 g/L，CaCO310 g/L，用三級(jí)水溶解。

1.1.3 主要試劑

NaOH、DPPH、鹽酸萘乙二胺、硼砂、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、對(duì)氨苯磺酸、亞硝酸鈉、NaCl、HCl、DPPH：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.4 儀器與設(shè)備

XMTD-204數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋，歐諾儀器儀表有限公司；電子天平ME204E，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Centrifuge 5810R高速離心機(jī)：Eppendorf AG；SPX-250BⅢ生化培養(yǎng)箱，廣州市叁科儀器有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；Sartorius普及型pH計(jì)（PB-10），賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌分離與鑒定

（1）菌株分離：取4種泡菜發(fā)酵液樣品各1 mL，用無菌生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋，取各梯度100 μL稀釋液均勻涂布于CaCO3-MRS固體培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度做三個(gè)平行，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h。選取有溶鈣圈的單菌落，觀察菌落形態(tài)并從平板上挑選形態(tài)、大小、顏色不同的菌落，在MRS固體平板上純化直至單菌落。把篩選得到的單一菌株用20%甘油保存，存放于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

（2）形態(tài)觀察：觀察分離菌株的菌落形態(tài)，并按照革蘭氏染色法進(jìn)行染色，然后調(diào)節(jié)雙目顯微鏡于100倍的油鏡下觀察其形態(tài)。

（3）分子鑒定：純化得到的單菌落進(jìn)行16S rDNA鑒定，使用SDS法提取菌株DNA。吸取1 mL培養(yǎng)12 h的菌液，10 000 r/min離心5 min，倒掉上清液，加入1 mL無菌水吹打均勻，繼續(xù)用10 000 r/min離心5 min，去掉上清液；往菌體中加入10 μL的1%（m/V）SDS，震蕩8 min，加入490 μL無菌水，手動(dòng)搖勻，作為PCR擴(kuò)增模板備用，之后用引物27F（5’-AGAGT TTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGGY TACCTTGTTAYGACTT-3’）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)PCR產(chǎn)物。對(duì)在1 400 bp附近有明亮條帶的擴(kuò)增DNA樣品送至廣州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果提交至NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，選取同源性較高的模式菌株16S rDNA序列，采用MEGA 10.0軟件中的鄰接法（Neighbor Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 乳酸菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將乳酸菌活化三代，按2%（V/V）的接種量接種到裝有MRS培養(yǎng)基的生長(zhǎng)曲線儀微孔板中，放在生長(zhǎng)曲線儀中37 ℃培養(yǎng)24 h，每隔30 min測(cè)一次吸光度，每株菌三個(gè)平行。

1.2.3 無溶血活性乳酸菌的篩選

取初篩得到的保存于甘油管中的乳酸菌，進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)三代以上，吸取培養(yǎng)的菌液10 μL在血平板上點(diǎn)樣，每株菌點(diǎn)樣3次，觀察有無溶血圈。

1.2.4 乳酸菌產(chǎn)酸能力

取篩選得到的無溶血活性的乳酸菌進(jìn)行產(chǎn)酸性能試驗(yàn)。取保藏于甘油管中的乳酸菌按2%（V/V）的接種量接種到MRS液體中，37 ℃培養(yǎng)24 h，總共活化三代。取活化三次的乳酸菌液體按2%接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，取培養(yǎng)48 h的菌液離心，用上清液通過酸堿滴定法測(cè)乳酸菌產(chǎn)酸量并測(cè)定pH值，每株菌做3個(gè)平行。通過酸堿滴定結(jié)果和pH值選出產(chǎn)酸多的菌株。

酸度值測(cè)定：取1 mL發(fā)酵好的上清液稀釋6倍，加入1～2滴（10 g/L）酚酞指示液，用0.1 mol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，滴定至為紅色，且30 s不褪色，即為滴定終點(diǎn)，記錄下消耗的氫氧化鈉體積，以消耗的氫氧化鈉體積來計(jì)算酸度值（酸度值以乳酸計(jì)），以未接種的MRS液態(tài)培養(yǎng)基為空白，總酸的含量按下式計(jì)算：

式中：

X——總酸的含量，g/kg或g/L；

c——?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，mol/L；

V1——滴定試液時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL；

V2——空白試驗(yàn)時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL；

K——酸的換算系數(shù)：乳酸，0.09；

F——試液的稀釋倍數(shù)；

m——試樣的質(zhì)量，g；或吸取試樣的體積，mL。

1.2.5 乳酸菌耐酸耐膽鹽性能

（1）耐酸：綜合參考張會(huì)生等[16]和Abolfazl等[17]的方法。將乳酸菌接種于5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)12 h，活化三代。將該培養(yǎng)液在4 ℃、4 000 r/min條件下離心5 min，棄上清，用無菌生理鹽水洗滌2到3次，取對(duì)應(yīng)pH濃度（pH值2.5和3.0）的5 mL液體培養(yǎng)基重新懸浮，震蕩均勻，放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別在0、4 h取培養(yǎng)液稀涂布樣于MRS固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)菌落生長(zhǎng)情況，每株菌做3個(gè)平行，檢測(cè)菌株耐酸情況，耐酸率按下式計(jì)算。

式中：

X——酸耐受性能；

B——4 h的菌落數(shù)，CFU/mL；

A——0 h的菌落數(shù)，CFU/mL。

（2）耐膽鹽：綜合參考張會(huì)生等[16]和Abolfazl等[17]的方法，略作修改。乳酸菌接種于5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)12 h，活化三代。將該培養(yǎng)液在4 ℃、4 000 r/min條件下離心5 min，棄上清，用生理鹽水洗滌2到3次，取對(duì)應(yīng)膽鹽濃度（0.30%和0.10%）的5 mL液體培養(yǎng)基重新懸浮，震蕩均勻，放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別在0、4 h取培養(yǎng)液稀釋涂布于MRS固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)菌落生長(zhǎng)情況，每株菌做3個(gè)平行，檢測(cè)菌株耐膽鹽情況，耐膽鹽率按下式計(jì)算。

式中：

X——膽鹽耐受性能；

B——4 h的菌落數(shù)，CFU/mL；

A——0 h的菌落數(shù)，CFU/m。

1.2.6 乳酸菌自聚集能力測(cè)定

取培養(yǎng)三代的乳酸菌發(fā)酵液分裝于離心管中，在4 000 r/min條件下離心8 min，棄去上清液，收集菌體沉淀，再加入等量無菌PBS緩沖溶液洗滌，反復(fù)洗滌兩次，棄去上清液，加入無菌PBS緩沖溶液調(diào)整OD600nm至0.60。置于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，并在第0、2、4、6、12、24小時(shí)吸取培養(yǎng)液，于OD600nm下測(cè)定吸光值，自聚集率按下式計(jì)算:

式中：

X——自聚集率；

B——2 h、4 h、6 h、12 h、24 h的吸光度；

A——0 h時(shí)的吸光度。

1.2.7 疏水性測(cè)定

取培養(yǎng)三代的乳酸菌發(fā)酵液分裝于離心管中，在4 000 r/min條件下離心8 min，棄去上清液，收集菌體沉淀，再加入等量無菌PBS緩沖溶液洗滌，反復(fù)洗滌兩次，棄去上清液，加入無菌PBS緩沖溶液調(diào)整OD600nm至0.60。吸取3 mL菌懸浮液至離心管中，然后取1 mL的二甲苯加入離心管與菌液混合，混勻后室溫培養(yǎng)10 min，漩禍震蕩3 min后，放置通風(fēng)處保持靜止30 min使之分層。分層后小心吸取下層水相，以無菌PBS緩沖溶液為空白對(duì)照測(cè)定。

1.2.8 生物胺檢測(cè)

配制含氨基酸（酪氨酸、組氨酸和賴氨酸，10.00 g/L）的營(yíng)養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基，加入溴甲酚紫（0.06 g/L），調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值為5.80。取培養(yǎng)三代的乳酸菌在含氨基酸的營(yíng)養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，37 ℃下培養(yǎng)48 h，每種做3次平行，同時(shí)做陽性對(duì)照。溴甲酚紫在堿性環(huán)境中顯紫色，在酸性環(huán)境中顯黃色。由于生物胺是堿性物質(zhì)，因此，黃色為陰性，紅或紫色為陽性。

1.2.9 抗氧化活性測(cè)定

（1）菌株懸浮液制備：吸取培養(yǎng)12 h的乳酸菌液體，用無菌PBS沖洗兩遍，制作成OD600nm=0.6的懸浮液。

（2）DPPH清除能力的測(cè)定：參考Chen等[18]方法。取0.5 mL菌懸浮液，加入濃度為0.2 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液0.5 mL，混勻后避光反應(yīng)30 min后，8 000 r/min離心10 min，在517 nm下測(cè)定上清液的吸光度。以上每組做三次平行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)以下公式計(jì)算DPPH清除率。

式中：

X——DPPH清除率，%；

Ai——為樣品組吸光度；

Aj——對(duì)照組（乙醇+樣品）吸光度；

A0——對(duì)照組（乙醇+DPPH）吸光度。

1.2.10α-葡萄糖苷酶抑制率菌株篩選

參考Chen等[19]的方法，將活化三代的乳酸菌用無菌PBS緩沖液沖洗兩遍，制作成OD600nm=1.00的懸浮液。將100 μL乳酸菌懸浮液與100 μL的α-葡萄糖苷酶溶液（1 U/mL）混合，在37 ℃下培養(yǎng)10 min，再進(jìn)一步加入100 μL濃度為5 mmol/L的對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷，再在37 ℃培養(yǎng)30 min。加入濃度為1 mL碳酸鈉終止反應(yīng)，在405 nm處測(cè)定吸光度，作為樣品組A。把不含乳酸菌菌液的等體積溶液作為對(duì)照組B；不含α-葡萄糖苷酶溶液的等體積溶液作為空白組C；不含菌液和不含α-葡萄糖苷酶溶液的等體積溶液作為空白組D。以上每組做三個(gè)平行試驗(yàn)。α-葡萄糖苷酶抑制率計(jì)算如下：

1.2.11 降解亞硝酸鹽菌株篩選

將活化三代的乳酸菌用無菌PBS緩沖液沖洗兩遍，制作成OD600nm=1.00的懸浮液。按2%接種量，接種到NaNO2質(zhì)量濃度為125 mg/L的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，計(jì)算亞硝酸鹽含量。NaNO2含量的測(cè)定采用GB/T 5009.33-2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》中鹽酸萘乙二胺分光光度法。

式中：

X——亞硝酸鹽降解率；

A——初始NaNO2含量；

B——發(fā)酵后NaNO2含量。

1.2.12 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析顯著性差異；采用OriginPro 2018、GraphPad Prism 8.3.0軟件統(tǒng)計(jì)分析與制作圖表。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定

菌株形態(tài)為乳白色光滑不透明菌落，菌株表面光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊，9株菌的菌落形態(tài)類似，有典型的乳酸菌特征。9株菌均呈現(xiàn)革蘭氏陽性反應(yīng)。經(jīng)16S rDNA鑒定，在NCBI上進(jìn)行同源性比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。如圖1，為菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)9株乳酸菌均為植物乳植桿菌。

圖1 基于16S rDNA基因序列的篩選菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of screening strains based on 16S rDNA gene sequences

2.2 菌株生長(zhǎng)曲線

9株菌株乳酸菌的生長(zhǎng)曲線如圖2，從圖2可以看出9株乳酸菌的生長(zhǎng)曲線是典型“S”形，有著明顯的三個(gè)時(shí)期，0～2 h為延滯期，菌落變化不明顯，2～14 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，乳酸菌生長(zhǎng)迅速，呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)；14～24 h為穩(wěn)定期，總細(xì)菌數(shù)達(dá)到最高水平。

圖2 菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of the strain

2.3 無溶血活性乳酸菌

溶血是指細(xì)菌分泌的溶血素使細(xì)胞溶解的現(xiàn)象，溶血素作為細(xì)菌致病的重要毒力因子，在動(dòng)物細(xì)菌性疾病的發(fā)病過程中起著不容輕視的作用[20]，也是評(píng)價(jià)乳酸菌安全性的重要指標(biāo)之一[21]。溶血現(xiàn)象可分為：完全溶血、不完全溶血和不溶血。完全溶血也稱為β-溶血，使平板中菌落周圍出現(xiàn)透明色圈，有致病性；不完全溶血也稱為α-溶血，使平板中菌落周圍出現(xiàn)草綠色圈，為條件致病菌；不溶血，平板中菌落周圍不會(huì)有任何變化，無致病性[22]。

將分離得出的70株乳酸菌點(diǎn)樣于哥倫比亞血平板上，共得出42株不溶血乳酸菌，即無溶血活性的乳酸菌。對(duì)分離出來的無溶血活性乳酸菌進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。溶血現(xiàn)象如圖3所示，1為典型的β-溶血，周邊有透明圈；2為α-溶血，周邊是草綠色；3、4、5、6為部分不溶血菌株在血平板上的表現(xiàn)。

圖3 溶血現(xiàn)象Fig.3 Hemolysis phenomenon

2.4 高產(chǎn)酸乳酸菌

不溶血分離菌株的產(chǎn)酸能力如表1所示。對(duì)篩選得到的無溶血活性的42株乳酸菌進(jìn)行產(chǎn)酸能力的測(cè)定，不同菌株之間的產(chǎn)酸能力差異較明顯，其中乳酸菌JT3-23、JT1-25、JT1-12、JTI-34、JT1-16、JT1-6、JT3-10、JT1-21、JT1-31的產(chǎn)酸能力較其他菌株更強(qiáng)，測(cè)定的pH值都小于4.0，產(chǎn)酸總量在80 g/L以上。其中產(chǎn)酸能力最高的是菌株JT1-21，產(chǎn)酸總量高達(dá)23.22 g/L；其次是菌株JT1-31，產(chǎn)酸總量高達(dá)23.07 g/L。王子靖海等[23]從7種豆腐酸漿老湯中分離出篩選出7株高產(chǎn)酸乳酸菌，產(chǎn)酸量最高為25.69 g/L。本實(shí)驗(yàn)分離的乳酸菌產(chǎn)酸量與之接近。

表1 不同乳酸菌菌株發(fā)酵后的pH值和產(chǎn)酸量Table 1 pH value and acid production after fermentation by different lactic acid bacteria strains

2.5 乳酸菌耐酸性能

乳酸菌必須進(jìn)入到人體的胃腸道中才能起到益生效果，而人體的胃內(nèi)含有強(qiáng)酸，處于一個(gè)低pH的環(huán)境，空腹的pH值約為2.5，當(dāng)進(jìn)食后，胃中pH值可上升至3.0以上[24]。所以，就要求乳酸菌株擁有較為強(qiáng)勁的耐酸性能，對(duì)酸的耐受是評(píng)價(jià)益生菌株的一個(gè)重要指標(biāo)。根據(jù)食品在人體胃腸道中停留的時(shí)間，確定最長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間為4 h，乳酸菌耐酸性能如圖4所示。在pH值2.5條件下，耐酸性強(qiáng)弱順序?yàn)椋篔T1-31＞JT1-6＞JT1-16＞JT1-12＞JT1-21＞JT1-25＞JT3-10＞JT1-34＞JT3-23，存活率最低的是JT1-23，存活率小于1%，存活率最高的是JT1-31，達(dá)到98.18%，除JT13-23、JT1-34外，存活率都在50%左右或以上，耐酸性較好。在pH值3.0的環(huán)境中，耐酸性強(qiáng)弱順序?yàn)椋篔T1-12＞JT1-31＞JT3-10＞JT1-25＞JT1-21＞JT3-23＞JT1-16＞JT1-34＞JT1-6，存活率最低的是JT1-6，為82.12%，存活率最高的是JT1-12，為156.85%?？傮w來看所有菌株耐酸能力都較為強(qiáng)勁，最好的菌株為JT1-12。

圖4 菌株在不同pH中的存活率（%）Fig.4 Survival of strains in different pH (%)

2.6 乳酸菌耐膽鹽性能

胃腸道除了是酸性環(huán)境外，十二指腸后段還含有一定濃度的膽汁酸鹽。對(duì)膽鹽的耐受是評(píng)價(jià)益生菌株的一個(gè)重要指標(biāo)。哺乳動(dòng)物腸道膽鹽濃度約在0.03%～0.30%[25]。從圖5可看出，9株菌株在0.1%和0.3%的膽鹽濃度中都能夠存活，不同的菌株表現(xiàn)的存活率不相同。隨著膽鹽濃度升高，菌株的存活率也下降。膽鹽濃度為0.3%時(shí)，存活率最高的是JT3-10，存活率為76.04%，其次是JT1-25，存活率為66.85%，存活率最低的是菌株JT1-23，存活率為36.10%；膽鹽濃度為0.1%時(shí)，存活率最高的是JT3-10，存活率為145.04%，其次是JT1-12，存活率為117.15%，存活率最低的是菌株JT1-23，存活率為65.20%?？傮w可以看出，9株菌對(duì)膽鹽都有較好的耐受性，其中耐受性最優(yōu)良的菌株是JT3-10。

圖5 菌株在不同膽鹽濃度中的存活率（%）Fig.5 Survival of strains in different bile salt concentrations (%)

2.7 乳酸菌自聚集能力

乳酸菌生物膜通過保護(hù)腸道內(nèi)的菌種、生產(chǎn)抗菌化合物和刺激免疫反應(yīng)而進(jìn)行腸道定植，而自聚集是生物膜形成的一個(gè)重要特性，具有較高自聚集能力的乳酸菌傾向于形成生物膜[26]。如圖6所示，共測(cè)定了9株菌在37 ℃條件下，0、4、6、12和24 h的自聚集率。發(fā)現(xiàn)，菌株的自聚集率隨時(shí)間的增長(zhǎng)而上升，在24 h達(dá)到最大值。開始的第4小時(shí)，9株菌的自聚集率在13%～22%之間；在第24小時(shí)，自聚集率在50%～67%。不同菌株之間的自聚集差異較大，對(duì)比9株菌發(fā)現(xiàn)，菌株JT1-16在24 h時(shí)最高，達(dá)到66.13%，其次是菌株JT1-21，自聚集率達(dá)到了65.96%，自聚集率最低的菌株是JT1-34，為47.03%。其中JT1-16除了在24 h是的自聚集率最高外，在4 h自聚集率為21.78%，對(duì)比其他菌株自聚集率也是最高的。綜合考慮，自聚集最好的菌株為JT1-16。

圖6 菌株自聚集測(cè)定結(jié)果Fig.6 Results of self-aggregation assay of strains

2.8 乳酸菌疏水性

細(xì)菌表面疏水性是決定乳酸菌非特異性粘附的重要?jiǎng)恿27]。菌株的疏水性如圖7所示，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了菌株對(duì)二甲苯的疏水率。9株菌對(duì)二甲苯的疏水性范圍在20%～45%。對(duì)二甲苯疏水性最高的菌株為JT1-16，疏水率為44.19%；其次為JT1-31，疏水率為37.04%。

圖7 菌株疏水性能力Fig.7 Hydrophobic ability of the strain

2.9 生物胺檢測(cè)

生物胺是一類具有生物活性的低分子堿性含氮化合物，過量的生物胺會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害，過量的組胺會(huì)導(dǎo)致頭疼、血壓異常和引起神經(jīng)性毒性，酪胺會(huì)引起頭痛和高血壓，尸胺能夠增加組胺和酪胺的含量[28]。本研究檢測(cè)了9株菌的產(chǎn)組胺、酪胺和尸氨的情況，以大腸桿菌為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8。大腸桿菌為圖8a～8c，平板變?yōu)樽仙?，證明產(chǎn)生了堿性生物胺，9株菌在添加了酪氨酸、組氨酸和賴氨酸的培養(yǎng)基48 h后，平板上呈現(xiàn)黃色，證明其不產(chǎn)生生物胺，表明9株菌無生物胺產(chǎn)生能力。

圖8 乳酸菌生物胺產(chǎn)生能力Fig.8 Biogenic amine production capacity of lactic acid bacteria

2.10 DPPH自由基清除能力

9株菌株清除DPPH的能力如圖9所示，從圖中可以看出，9株菌的菌株懸浮液對(duì)DPPH都有一定的清除能力，清除率在34.83%～51.93%之間，但不同菌株間的DPPH清除率差別較大。其中清除率最高的菌株是JT1-21，清除率為51.93%；其次是菌株JT1-34，清除率為51.10%；清除率最低的菌株是JT1-12，清除率為34.83%。與其它相比而言，許強(qiáng)等[29]篩選出15株有抗氧化性能的乳酸菌，清除DPPH的能力最高為39.11%。黃煜等[30]從皖北地區(qū)的腌制菜中篩選出20株具有抗氧化能力的乳酸菌，其中清除DPPH能力最高達(dá)到56.98%。本研究菌株具有一定抗氧化能力。

圖9 菌株DPPH清除能力Fig.9 DPPH scavenging ability of the strain

2.11 α-葡萄糖苷酶抑制率

α-葡萄糖苷酶能夠水解二糖為單糖，從而促進(jìn)人體對(duì)碳水化合物的吸收。當(dāng)α-葡萄糖苷酶被抑制時(shí)，能夠降低人體碳水化合物的吸收，從而達(dá)到降低空腹血糖的目的，防止人體血糖過高。9株菌對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率如圖10，抑制率在1.25%～20.36%之間。以阿卡波糖為陽性對(duì)照，阿卡波糖的抑制率達(dá)到99.91%。9株菌對(duì)α-葡萄糖苷酶都有一定的抑制率，其中抑制率最高的菌株是JT1-25，抑制率為20.36%，其次是JT1-34，抑制率達(dá)是10.95%，抑制率最低的是菌株JT3-23，抑制率是1.25%。與之相比，有研究[12]從發(fā)酵果蔬中分離的乳酸菌，最高抑制率為37.48%。JT1-25對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率能達(dá)到20.36%，其在降低血糖方面有著一定潛能。

圖10 菌株對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.10 Inhibition rate of α-glucosidase by the strain

2.12 降解亞硝酸鹽

亞硝酸鹽是泡菜食品中常見的物質(zhì)，也是影響食品安全的有害物質(zhì)，研究降解亞硝酸鹽的乳酸菌菌株對(duì)泡菜生產(chǎn)有著重要的意義。本實(shí)驗(yàn)對(duì)9株乳酸菌的亞硝酸鹽降解率進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，亞硝酸鹽降解率如圖11，通過24 h的發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)9株菌對(duì)亞硝酸鹽的降解率都很高，在90%以上，其中最高的是菌株JT1-12，降解率達(dá)到94.98%，最低的是菌株JT1-31，降解率為90.02%，所有菌株之間降解率無顯著差異。郭志華等[31]從紅茶飲料中分離出來的乳酸菌通過24 h的發(fā)酵，其亞硝酸鹽降解率均在90%以上。本實(shí)驗(yàn)分離的菌株降解率略高，在亞硝酸鹽降解方面有著潛在的能力。

圖11 菌株對(duì)亞硝酸鹽的降解率Fig.11 Degradation rate of nitrite by the strain

3 結(jié)論

乳酸菌作為泡菜中的主要菌種，也是目前益生菌研究和應(yīng)用的重點(diǎn)對(duì)象之一。泡菜品質(zhì)的好壞離不開乳酸菌的作用，而且隨著生活水平的提高，人們對(duì)泡菜的要求不僅僅是口感上的需求，對(duì)其健康、安全的需求已日益被人所重視。為改善發(fā)酵食品的風(fēng)味、提高安全性、增強(qiáng)泡菜的功能，近年來有很多研究者從酸菜中進(jìn)行篩選，篩選出了大量益生性能的乳酸菌，用于各種發(fā)酵產(chǎn)品中。

本研究以湖南洞口家庭自制的泡菜液為對(duì)象。先從得到的70株產(chǎn)酸菌株中篩選出42株無溶血活性的菌株。再從這42株菌株中篩選出9株高產(chǎn)酸的菌株，產(chǎn)酸量均在16 g/L以上，經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定，確定這9株菌為植物乳植桿菌，分別命名為JT1-21、JT1-6、JT1-16、JT1-31、JT1-34、JT1-25、JT3-23、JT3-10、JT1-12。通過耐受性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)9株菌都具有較好的耐受性能，其中，菌株JT1-12耐酸性最好，pH值3.0時(shí)存活率為156.85%，菌株JT3-10耐膽鹽能力最好，0.3%膽鹽濃度存活率為145.04%。菌株JT1-16、JT1-21、JT1-31有良好的自聚集和疏水性。9株乳酸菌中，JT1-21和JT1-34有良好的清除DPPH的能力，分別為51.93%和51.10%。菌株JT1-25和JT1-34有良好的抑制α-葡萄糖苷酶的能力，JT1-25的抑制率為20.36%。所有菌株菌能有效降解亞硝酸鹽，降解率均超過90%。分離出來的9株產(chǎn)酸菌都有著不同的益生效果，具有很大的作為益生菌的潛能。