喂食二氫楊梅素對高脂日糧小鼠生長代謝及發(fā)情周期的影響

謝梅英 侯連杰

摘 要 在動(dòng)物生產(chǎn)中，脂肪沉積會影響母豬繁殖性能，如降低發(fā)情率、受胎率和仔豬出生成活率等。二氫楊梅素是一種綠色安全二氫黃酮醇類黃酮植物提取物，對飼養(yǎng)動(dòng)物具有抗氧化、抗炎、降血糖及調(diào)血脂等多方面的作用，但是否能夠緩解高脂日糧導(dǎo)致的動(dòng)物發(fā)情周期紊亂尚不清楚。通過給每天給高脂飲食小鼠灌喂200 mg·kg-1體重的二氫楊梅素溶液，觀察二氫楊梅素對小鼠體重、體組成、直腸溫度、代謝產(chǎn)熱和發(fā)情周期的影響。結(jié)果表明：1）二氫楊梅素顯著抑制高脂日糧誘導(dǎo)的小鼠體增重和體脂含量增加及脂肪細(xì)胞脂質(zhì)蓄積；2）二氫楊梅素可緩解高脂日糧導(dǎo)致的小鼠發(fā)情周期紊亂，縮短肥胖小鼠發(fā)情間期、延長發(fā)情期，并升高血清中促卵泡激素和雌二醇水平；3）二氫楊梅素通過逆轉(zhuǎn)高脂日糧對小鼠棕色脂肪產(chǎn)熱基因和白色脂肪棕色化相關(guān)基因表達(dá)的抑制作用，提高肥胖小鼠代謝產(chǎn)熱。

關(guān)鍵詞 小鼠；喂食；二氫楊梅素；發(fā)情周期；肥胖；能量代謝；脂肪組織

中圖分類號：S814 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2023.13.001

在動(dòng)物生產(chǎn)中，脂肪沉積會影響母豬繁殖性能，如降低發(fā)情率、受胎率和仔豬出生成活率等[1]。此外，肥胖會引起飼養(yǎng)動(dòng)物內(nèi)分泌及代謝異常，如代謝率降低、高胰島素血癥和孕酮產(chǎn)生過剩[2]，伴隨著發(fā)情周期紊亂[3]、多囊卵巢綜合征[4]和不孕癥[5]等。因此，預(yù)防肥胖可以提高畜禽繁殖性能，降低生殖疾病發(fā)病率，改善動(dòng)物繁殖性能。

二氫楊梅素又稱蛇葡萄素、白蘞素、雙氫楊梅樹皮素、雙氫楊梅素等，是一種綠色安全二氫黃酮醇類黃酮植物提取物[6]。其廣泛存在于蛇葡萄科蛇葡萄屬植物中，在藤茶中含量可以達(dá)到30%，也存在于楊梅科、杜鵑科、藤黃科等植物中[7]。既往研究證實(shí)，二氫楊梅素通過激活A(yù)MPK、NRF2和NF-κB等通路發(fā)揮抗氧化[8]、抗炎[9]、降血糖及調(diào)血脂等多方面的作用[10-11]。然而，二氫楊梅素是否能夠緩解高脂日糧導(dǎo)致的動(dòng)物發(fā)情周期紊亂尚不清楚。本試驗(yàn)旨在探究二氫楊梅素對高脂日糧導(dǎo)致的小鼠發(fā)情周期紊亂的影響，研究結(jié)果有望揭示二氫楊梅素在改善肥胖相關(guān)生殖異常方面的調(diào)控作用，為其在改善動(dòng)物繁殖性能和人類健康中的應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)動(dòng)物和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

36只6周齡C57B/L6雌性小鼠（廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），在22～28 ℃、60%～80%濕度的條件下，12 h的光/暗循環(huán)，適應(yīng)1周后，將小鼠隨機(jī)分為3組（n=12）：正常日糧組、高脂日糧飲食組和“高脂日糧飲食+二氫楊梅素”組。正常日糧飼喂標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動(dòng)物飼料（AIN-93G），高脂日糧飲食組飼喂高脂日糧（脂肪提供60%能量），高脂日糧飲食+二氫楊梅素組飼喂高脂日糧（脂肪提供60%能量）并灌喂200 mg·kg-1體重的二氫楊梅素溶液，正常日糧和高脂日糧飲食組每天灌喂等體積的PBS。試驗(yàn)期18周，在不同飼養(yǎng)階段，對小鼠體組成、直腸（體核）溫度和發(fā)情周期等進(jìn)行檢查。試驗(yàn)結(jié)束后，用CO2麻醉小鼠，眼球取血分離血清，用ELISA試劑盒檢測雌二醇（estradiol，E2），促卵泡生成素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）水平。

1.2? 材料和試劑

二氫楊梅素購買自MCE公司（HY-N0112）。FSH和E2檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3? 體組成檢測

從12周齡開始每周一上午9：00用動(dòng)物體成分和核磁共振成像系統(tǒng)分析儀（Body Composition Analyzer MiniQMR23-060H-I， Niumag Corporation， Shanghai， China）測定小鼠的體脂含量和脂肪分布。

1.4? 整體代謝

按照綜合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測系統(tǒng)（Promethion metabolic screening systems，美國Systems International公司）操作指南，測定20周齡小鼠的產(chǎn)熱和耗氧量等代謝參數(shù)。

1.5? 組織RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測基因表達(dá)

按照廣州美基生物科技公司RNA快速提取試劑盒操作說明提取腹股溝白色脂肪和肩胛間褐色脂肪RNA。按照TaKaRa公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明將組織總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA用于后續(xù)定量PCR實(shí)驗(yàn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)操作在本團(tuán)隊(duì)前期發(fā)表研究中均有報(bào)道，相關(guān)基因引物序列見表1。

1.6? Western Blot檢測基因的蛋白含量

使用RIPA裂解液裂解脂肪組織，12 000 r·s-1離心10 min獲得組織蛋白溶液，使用BCA法測定蛋白濃度。蛋白變性后利用Western Blot檢測基因的蛋白含量，Western Blot實(shí)驗(yàn)方法參照本團(tuán)隊(duì)前期發(fā)表研究。

1.7? 直腸溫度測定

從8周齡開始每天用小鼠用直腸探頭連接數(shù)字溫度計(jì)測量小鼠的直腸溫度。

1.8? 發(fā)情周期鑒定

對20周齡雌性小鼠連續(xù)8天進(jìn)行陰道涂片的細(xì)胞學(xué)檢查，每天觀察1次陰道涂片細(xì)胞類型，確定發(fā)情周期所處階段。固定小鼠，用移液槍吸取20 μL PBS至小鼠陰道，反復(fù)抽吸5次，將液體均勻涂至整個(gè)載玻片，涂片風(fēng)干后，甲醇固定3 min，瑞氏染液染色6 min，PBS輕柔沖洗，吉姆薩染液染色8 min，最后用自來水漂洗，自然干燥后封皮檢測。各階段的分辨方法如下：發(fā)情間期黃體退化，可見大量白細(xì)胞及少量黏膜和上皮細(xì)胞；發(fā)情期卵泡成熟排卵，為無核角化細(xì)胞包含少量上皮細(xì)胞；發(fā)情前期卵泡快速生長，可見大量有核上皮細(xì)胞和少量角化細(xì)胞；發(fā)情后期黃體生成，為一半上皮細(xì)胞和一半白細(xì)胞。

1.9? 蘇木精&伊紅（H&E）染色

分離內(nèi)臟脂肪，用4%多聚甲醇固定48 h，脫水后用石蠟包埋切片，用蘇木精和伊紅染色并拍照。

1.10? 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析對各組均值進(jìn)行差異分析，p＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 二氫楊梅素對高脂日糧誘導(dǎo)的小鼠脂肪沉積的影響

與正常日糧相比，18周的高脂日糧飼喂顯著增加小鼠體增重和小鼠脂肪含量，喂食二氫楊梅素可顯著逆轉(zhuǎn)高脂日糧誘導(dǎo)的體增重和脂肪含量的增加（見圖1A、1B）。與此同時(shí)，內(nèi)臟脂肪的H&E染色結(jié)果表明：與正常日糧相比，高脂日糧飼喂顯著增加小鼠的內(nèi)臟脂肪細(xì)胞脂質(zhì)蓄積，二氫楊梅素顯著逆轉(zhuǎn)了高脂日糧誘導(dǎo)的內(nèi)臟脂肪細(xì)胞脂質(zhì)累積（見圖1C）。

2.2? 二氫楊梅素對高脂日糧導(dǎo)致的雌性小鼠發(fā)情周期紊亂的影響

與正常日糧相比，高脂日糧誘導(dǎo)肥胖小鼠發(fā)情周期顯著增長（見圖2A、2B），而且降低發(fā)情期的時(shí)間比例，增加發(fā)情間期的時(shí)間比例（見圖2D）；而喂食二氫楊梅素將小鼠發(fā)情周期恢復(fù)到正常天數(shù)（見圖2B、2C），并且逆轉(zhuǎn)高脂日糧導(dǎo)致的發(fā)情期縮短和發(fā)情間期延長（見圖2D）。雌二醇和促卵泡激素的ELISA檢測結(jié)果表明：肥胖小鼠體內(nèi)雌二醇和促卵泡激素水平顯著降低，二氫楊梅素能夠改善高脂日糧對血清雌二醇和促卵泡激素水平的抑制作用（見圖2E、2F）。上述結(jié)果表明，二氫楊梅素可以改善高脂日糧導(dǎo)致的雌性小鼠發(fā)情周期紊亂。

2.3? 二氫楊梅素對肥胖雌性小鼠能量代謝的影響

為探究二氫楊梅素緩解高脂日糧導(dǎo)致的發(fā)情周期紊亂是否與提高機(jī)體基礎(chǔ)能力代謝有關(guān)，本研究測定了喂食二氫楊梅素對肥胖小鼠的基礎(chǔ)代謝的影響。結(jié)果顯示，高脂日糧降低小鼠的耗氧量和產(chǎn)熱量，而二氫楊梅素逆轉(zhuǎn)了高脂日糧引起的耗氧量和產(chǎn)熱量的降低（見圖3A、3B）。同時(shí)，二氫楊梅素使小鼠的直腸溫度顯著升高，與能量代謝增加的表型一致，表明二氫楊梅素提升肥胖雌性小鼠的能量代謝。

2.4? 二氫楊梅素對肥胖小鼠的棕色脂肪激活和白色脂肪棕色化相關(guān)基因表達(dá)的影響

由于棕色脂肪激活和白色脂肪棕色化與增加小鼠產(chǎn)熱密切相關(guān)，因此本試驗(yàn)探究了二氫楊梅素對棕色脂肪激活和白色脂肪棕色化的影響。定量PCR結(jié)果（見圖4）表明：高脂日糧抑制棕色脂肪激活相關(guān)基因UCP1、PGC-1α、Cidea和PRDM16的表達(dá)，二氫楊梅素逆轉(zhuǎn)高脂日糧對棕色脂肪激活相關(guān)基因的抑制作用；WB結(jié)果與qPCR結(jié)果一致。此外，定量PCR結(jié)果表明：高脂日糧抑制腹股溝白色脂肪棕色化轉(zhuǎn)變相關(guān)基因UCP1和PGC-1α mRNA水平，二氫楊梅素顯著逆轉(zhuǎn)高脂日糧對腹股溝白色脂肪棕色化轉(zhuǎn)變相關(guān)基因的抑制作用，且WB結(jié)果與定量PCR結(jié)果一致。上述結(jié)果表明，二氫楊梅素促進(jìn)肥胖小鼠的棕色脂肪激活和白色脂肪棕色化相關(guān)基因表達(dá)。

3? 討論與結(jié)論

3.1? 討論

已有研究表明，肥胖或高脂日糧會損害包括發(fā)情周期紊亂在內(nèi)的雌性動(dòng)物繁殖性能[12]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)高脂日糧導(dǎo)致雌性小鼠發(fā)情周期紊亂。本研究結(jié)果顯示：小鼠灌服二氫楊梅素可以緩解高脂日糧導(dǎo)致的肥胖小鼠發(fā)情周期紊亂。

雌性動(dòng)物發(fā)情周期是其繁殖過程的重要組成部分，受生殖激素的嚴(yán)密調(diào)控，不規(guī)律的發(fā)情周期往往伴隨著促卵泡激素和雌二醇等生殖激素水平的紊亂[13]。有研究報(bào)道，肥胖女性血清促卵泡激素和雌激素濃度較低；在嚙齒類動(dòng)物中，卵巢切除術(shù)導(dǎo)致肥胖發(fā)生，而補(bǔ)充雌激素可抑制肥胖的發(fā)生[2]。有趣的是，雌激素可抑制動(dòng)物的采食行為，而較低雌激素水平將誘導(dǎo)動(dòng)物采食，進(jìn)一步誘導(dǎo)肥胖[14]。有研究表明，雌性的發(fā)情行為與體脂含量密切相關(guān)；機(jī)體能量平衡和發(fā)情周期受到下丘腦神經(jīng)元的嚴(yán)格調(diào)控，高脂日糧可以穩(wěn)定地提高哺乳動(dòng)物雌二醇水平，雌二醇抑制促性腺激素促黃體生成激素分泌，導(dǎo)致動(dòng)物發(fā)情表現(xiàn)差[15]。另有研究表明，當(dāng)高脂日糧引起大鼠肥胖時(shí)（體重增加27%），可導(dǎo)致98%的大鼠發(fā)情中斷[16]。本研究中發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素處理后，可顯著升高小鼠雌激素水平，并恢復(fù)小鼠正常的發(fā)情周期。在本研究中發(fā)現(xiàn)高脂日糧誘導(dǎo)肥胖的小鼠體內(nèi)促卵泡激素和雌激素水平顯著降低，二氫楊梅素改善肥胖對促卵泡激素和雌激素分泌的抑制作用，提示二氫楊梅素可預(yù)防高脂日糧導(dǎo)致的肥胖雌性小鼠生殖激素水平的改變。

本研究還進(jìn)一步解析了二氫楊梅素緩解肥胖引起的發(fā)情周期紊亂的機(jī)制。鑒于肥胖往往伴隨著能量平衡的變化，本研究通過檢測小鼠機(jī)體代謝產(chǎn)熱結(jié)果發(fā)現(xiàn)：二氫楊梅素增加了高脂日糧誘導(dǎo)肥胖小鼠的基礎(chǔ)耗氧量和產(chǎn)熱量。由于哺乳動(dòng)物的基礎(chǔ)產(chǎn)熱量的增加主要通過棕色脂肪和棕色化的白色脂肪中解偶聯(lián)呼吸作用實(shí)現(xiàn)[17]，因此，本研究檢測了小鼠棕色脂肪和白色脂肪中解偶聯(lián)蛋白UCP1的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高脂日糧抑制UCP1在棕色脂肪和白色脂肪中的表達(dá)，但二氫楊梅素顯著增加UCP1的表達(dá)。本研究團(tuán)隊(duì)前期證明二氫楊梅素能夠激活PGC-1α信號通路抑制肥胖小鼠脂肪組織炎癥反應(yīng)，改善小鼠胰島素敏感性[18]；而PGC-1α是棕色脂肪激活和白色脂肪棕色化過程中重要轉(zhuǎn)錄因子，可促進(jìn)UCP1的表達(dá)[19]。本研究也表明：二氫楊梅素可顯著增加棕色脂肪和白色脂肪組織PGC-1α的表達(dá)，提示二氫楊梅素通過激活PGC-1α/UCP1信號通路，促進(jìn)脂肪組織的解偶聯(lián)呼吸作用，增加小鼠代謝產(chǎn)熱，從而改善肥胖引起的發(fā)情周期紊亂。

3.2? 結(jié)論

喂食二氫楊梅素可緩解高脂日糧誘導(dǎo)肥胖所導(dǎo)致的小鼠發(fā)情周期紊亂和代謝產(chǎn)熱降低，其可能與棕色脂肪激活和白色脂肪棕色化產(chǎn)熱相關(guān)。本研究揭示了二氫楊梅素在改善動(dòng)物肥胖相關(guān)的生殖異常方面的潛在應(yīng)用，可為其在人類生殖疾病治療和動(dòng)物繁殖性能改善中的應(yīng)用提供一定的試驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]? HAUSMAN G J， BARB C R. Adipose tissue and the reproductive axis： biological aspects[J]. Endocr Dev， 2010， 19：31-44.

[2]? LEENERS B， GEARY N， TOBLER P N， et al. Ovarian hormones and obesity[J]. Hum Reprod Update， 2017， 23（3）：300-321.

[3]? ITRIYEVA K. The effects of obesity on the menstrual cycle[J]. Curr Probl Pediatr Adolesc Health Care， 2022：101241.

[4]? LORD J M， NORMAN R. Obesity， polycystic ovary syndrome， infertility treatment： lifestyle modification is paramount[J]. BMJ， 2006， 332（7541）：609.

[5] CARSON S A， KALLEN A N. Diagnosis and Management of Infertility： A Review[J]. JAMA， 2021， 326（1）：65-76.

[6]? DU Q Z， CAI WJ， XIA M， et al. Purification of（+）-dihydromyricetin from leaves extract of?Ampelopsis grossedentata using high-speed?countercurrent chromatograph with scale-up triple?columns[J].J Chromatogr A， 2002， 973（1/2）：217-220.

[7]? LEE K H， KIM J H. Development and optimization of fractional precipitation for the pre-purification of （+）-dihydromyricetin[J]. Biotechnol Bioproc E， 2008， 13（3）：274-278.

[8]? LIU T T， ZENG Y， TANG K， et al. Dihydromyricetin ameliorates atherosclerosis in LDL receptor deficient mice[J]. Atherosclerosis， 2017， 262：39-50.

[9]? WU J， ZHAO F T， FAN K J， et al. Dihydromyricetin Inhibits Inflammation of Fibroblast-Like Synoviocytes through Regulation of Nuclear Factor-kappaB Signaling in Rats with Collagen-Induced Arthritis[J]. J Pharmacol Exp Ther， 2019， 368（2）：218-228.

[10]? ZHANG J， CHEN Y， LUO H， et al. Recent Update on the Pharmacological Effects and Mechanisms of Dihydromyricetin[J]. Front Pharmacol， 2018， 9：1204.

[11] LI H， LI Q， LIU Z， et al. The Versatile Effects of Dihydromyricetin in Health[J]. Evidence-based complementary and alternative medicine ： eCAM 2017， 2017：1053617.

[12] MINTZIORI G， NIGDELIS M P， MATHEW H， et al. The effect of excess body fat on female and male reproduction[J]. Metabolism， 2020， 107：154193.

[13] MICEVYCH P E， WONG A M， MITTELMAN-SMITH M A. Estradiol Membrane-Initiated Signaling and Female Reproduction[J]. Compr Physiol， 2015， 5（3）：1211-1222.

[14] SINCHAK K， WAGNER E J. Estradiol signaling in the regulation of reproduction and energy balance[J]. Front Neuroendocrinol， 2012， 33（4）：342-363.

[15] NEGRON A L， RADOVICK S. High-Fat Diet Alters LH Secretion and Pulse Frequency in Female Mice in an Estrous Cycle-Dependent Manner[J]. Endocrinology， 2020， 161（10）： bqaa146.

[16] NGADJUI E， NKENG-EFOUET P A， NGUELEFACK T B， et al. High fat diet-induced estrus cycle disruption： effects of Ficus asperifolia[J]. Journal of complementary & integrative medicine， 2015， 12（3）：205-215.

[17] COHEN P， KAJIMURA S. The cellular and functional complexity of thermogenic fat[J]. Nat Rev Mol Cell Biol， 2021， 22（6）：393-409.

[18] HOU L， JIANG F， HUANG B， et al. Dihydromyricetin ameliorates inflammation-induced insulin resistance via phospholipase C-CaMKK-AMPK signal pathway[J]. Oxidative?Medicine and Cellular Longevity， 2021， 2021： 1-18.

[19] ZHANG Z， ZHANG H， LI B， et al. Berberine activates thermogenesis in white and brown adipose tissue[J]. Nat Commun， 2014， 5（1）： 5493.