糖基化金納米籠復(fù)合物的制備及性質(zhì)研究

張倩茹,梁梅芳,權(quán) 靜,2*

(1.東華大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院,上海納米生物材料與再生醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究中心,上海 201620;2.區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530022)

金納米籠(AuNCs)具有中空多孔狀結(jié)構(gòu),不僅可吸收近紅外波段(700～1 200 nm)的光波使其具有高光熱轉(zhuǎn)換效率,而且金納米籠空心內(nèi)壁和多孔壁結(jié)構(gòu)有利于裝載小分子、酶及藥物等,在生物醫(yī)藥領(lǐng)域備受關(guān)注[1-7]。然而,裸金納米籠容易發(fā)生聚沉現(xiàn)象,不能穩(wěn)定分散,在其表面接枝基團(tuán)得到功能化金納米籠復(fù)合物可在改善其穩(wěn)定性的同時(shí)拓展其功能性,使其在醫(yī)藥領(lǐng)域具有更廣泛的應(yīng)用前景[8]。Hu等[9]將引發(fā)劑負(fù)載于金納米籠,利用其光熱效應(yīng)引起腫瘤細(xì)胞ROS升高,從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。Shi等[10]在金納米籠表面修飾 pH 響應(yīng)的熒光探針,用于指示腫瘤位置,從而通過化療和熱療促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

將靶向基團(tuán)修飾在金納米籠表面,可為金納米籠粒子的靶向光熱治療提供可能性。糖基聚合物是指一種通過不同化學(xué)反應(yīng)將糖基組分引入到聚合物側(cè)鏈或端基的功能性高分子材料[11],不僅保持了糖分子良好的生物相容性和可降解性,而且便于利用糖-蛋白的特異性識(shí)別將納米復(fù)合材料靶向運(yùn)輸?shù)浇o藥部位實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)給藥,提高藥物運(yùn)輸效率[12-18]。

作者在課題組前期研究[19]的基礎(chǔ)上,將糖基聚合物P(DEGMA-co-OVNGlu)接枝到金納米籠表面制備糖基化金納米籠復(fù)合物AuNCs@P(DEGMA-co-OVNGlu),采用紫外可見吸收光譜(UV-Vis)和透射電鏡(TEM)等對(duì)其進(jìn)行表征[20],系統(tǒng)研究其理化性質(zhì)和光熱轉(zhuǎn)換效率,并考察糖基化金納米籠復(fù)合物與凝集素ConA的特異性識(shí)別作用,為后續(xù)金納米籠復(fù)合物的腫瘤靶向治療提供納米平臺(tái)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(DEGMA)、S-十二烷基-S′-(2-羧基異丙基)三硫酯(DDATC),美國西格碼奧德里奇公司;6-O-乙烯基己二酸-D-吡喃型葡萄糖(OVNGlu),自制;偶氮二環(huán)己基甲腈(ACCN),天津光復(fù)精細(xì)化工研究所;葡萄糖,阿拉丁生化科技有限公司;50 nm金納米籠,西安瑞禧生物科技有限公司;N,N-二甲基甲酰胺(DMF),上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;硼氫化鈉(NaBH4),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

AVANCE 400型核磁共振波譜儀,瑞士Bruker公司;JEM-2100型透射電子顯微鏡(TEM),日本JEOL公司;Lambda 35型紫外可見分光光度計(jì),日本PerkinElmer公司;Nexus-670型傅立葉變換紅外光譜儀(FTIR),美國Thermo公司;DZF-6021型真空干燥箱,上海坦?jié)蓛x器設(shè)備有限公司;DT-8891E型熱電偶溫度計(jì),華盛昌(深圳)公司;ADR-1860型激光器,熙隆光電科技有限公司;3-30KS型離心機(jī),美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 糖基化金納米籠復(fù)合物的制備

以DEGMA、OVNGlu為原料,參照文獻(xiàn)[19]采用酶促可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移(RAFT)聚合法制備糖基聚合物P(DEGMA-co-OVNGlu)。在避光條件下將2 mL 0.05 mg·mL-1金納米籠溶液和5 mL 0.1 mg·mL-1糖基聚合物溶液充分混合,每隔30 min加入0.5 mL 0.01 mol·L-1NaBH4溶液;連續(xù)5次后室溫避光,攪拌過夜;9 000 r·min-1離心10 min,重復(fù)2次,即得糖基化金納米籠復(fù)合物AuNCs@P(DEGMA-co-OVNGlu)。

1.2.2 分子量的測定

室溫下,保持流速為1 mL·min-1,將含糖量不同的糖基聚合物分別溶解于DMF中,得到濃度約5 mg·mL-1的待測溶液,經(jīng)0.45 μm的有機(jī)相針式過濾器過濾,濾液注射到樣品瓶中,采用凝膠滲透色譜法(GPC)測定分子量。

1.2.3 低臨界溶解溫度(LCST)的測定

在20～60 ℃范圍內(nèi)分別測定0.5 mg·mL-1糖基聚合物溶液和0.1 mg·mL-1糖基化金納米籠復(fù)合物溶液在500 nm處的吸光度;樣品池按0.5 ℃·min-1的升溫速率進(jìn)行升溫。LCST指通過變溫紫外測定溫敏聚合物達(dá)到溶液最大吸光度的50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的溫度。

1.2.4 紫外可見吸收光譜分析

配制Au濃度相同的金納米籠溶液和糖基化金納米籠復(fù)合物溶液,在400～1 000 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描,繪制吸光度變化曲線。

1.2.5 光熱性能評(píng)價(jià)

取200 μL不同Au濃度(4、8、12、16、20,μg·mL-1)的糖基化金納米籠復(fù)合物溶液,在不同強(qiáng)度(0.8、1.0、1.2、1.4、1.6,W·cm-2)的808 nm激光下照射 300 s,利用熱電偶溫度計(jì)實(shí)時(shí)記錄溶液溫度,繪制T-t的變化曲線,并按下式計(jì)算糖基化金納米籠復(fù)合物的光熱轉(zhuǎn)換效率(η):

(1)

(2)

(3)

式中:Qdis為光熱光譜分析的材料系數(shù),mW;m和C分別為水的質(zhì)量(mg)和比熱容(J·kg-1·℃-1);ΔT為溫差,℃;t為激光照射時(shí)間,s;h為傳熱系數(shù),W·m-2·℃-1;S為表面積,m2;mi和Cp,i分別為溶液中不同物質(zhì)的質(zhì)量(mg)和比熱容(J·kg-1·℃-1);τ為傳熱時(shí)間常數(shù),s;Tmax和Tamb分別為溶液最高溫度和初始溫度,℃;I為激光的功率,W·m-2;A808為材料在808 nm處的特征吸收峰強(qiáng)度值。

1.2.6 凝集素ConA的識(shí)別測定

在37.0 ℃恒溫水浴鍋中,于0.05 mg·mL-1糖基化金納米籠復(fù)合物溶液中加入等體積的0.02 mg·mL-1的凝集素ConA,利用紫外濁度法與納米粒度儀分別測定糖基化金納米籠復(fù)合物溶液在與ConA識(shí)別前后的吸光度及粒徑。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子量及LCST分析

當(dāng)OVNGlu在糖基聚合物P(DEGMA-co-OVNGlu)中的含量n(OVNGlu)∶n[P(DEGMA-co-OVNGlu)]為2.89∶1時(shí),糖基聚合物的Mn為3.49×104,Mw為4.76×104,分散性指數(shù)(PDI)為1.36,LCST可達(dá)40.3 ℃。

2.2 糖基聚合物和糖基化金納米籠復(fù)合物的溫敏性(圖1)

圖1 0.5 mg·mL-1糖基聚合物溶液(a)及0.1 mg·mL-1糖基化金納米籠復(fù)合物溶液(b)的吸光度隨溫度的變化曲線Fig.1 Change curves of absorbance of 0.5 mg·mL-1 glycosylation polymer solution(a) and 0.1 mg·mL-1 AuNCs@P(DEGMA-co-OVNGlu) solution(b) with temperature

由圖1a可知,糖基聚合物的LCST為40.3 ℃。當(dāng)溫度較低時(shí),DEGMA的醚鍵結(jié)構(gòu)與水分子間的氫鍵作用力相持平,糖基聚合物呈水溶性狀態(tài),溶液表現(xiàn)為澄清透明;當(dāng)溫度逐漸升高時(shí),DEGMA中的醚鍵結(jié)構(gòu)與水分子間的氫鍵作用逐漸被破壞,糖基聚合物由親水狀態(tài)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷疇顟B(tài),溶液逐漸變?yōu)椴煌该魅榘咨?當(dāng)溫度降低時(shí),溶液又能變回澄清透明,表明糖基聚合物的相轉(zhuǎn)變過程是可逆的,具有良好的溫敏性。

由圖1b可知,糖基化金納米籠復(fù)合物的LCST為42.6 ℃。當(dāng)溫度較低時(shí),糖基化金納米籠復(fù)合物溶液呈澄清透明的淺藍(lán)色;當(dāng)溫度逐漸升高時(shí),糖基化金納米籠復(fù)合物由親水狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷疇顟B(tài),使其溶解度降低,溶液逐漸變成渾濁半透明狀態(tài),故糖基化金納米籠復(fù)合物表現(xiàn)出與糖基聚合物相似的溫敏性。

2.3 紫外可見吸收光譜分析(圖2)

圖2 Au濃度相同的金納米籠溶液和糖基化金納米籠復(fù)合物溶液的紫外可見吸收光譜Fig.2 UV-Vis absorption spectra of AuNCs solution and AuNCs@P(DEGMA-co-OVNGlu) solution with same Au concentration

由圖2可知,金納米籠和糖基化金納米籠復(fù)合物在波長700 nm左右有較明顯的LSPR吸收峰,兩者的吸收峰型相似,表明在金納米籠表面接枝聚合物沒有改變本身的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。相較于金納米籠,糖基化金納米籠復(fù)合物的吸收峰強(qiáng)度變?nèi)?這是由于,糖基聚合物包裹在金納米籠表面,使材料的光敏感度和光響應(yīng)度降低,從而使吸光度下降,證明糖基聚合物成功接枝到金納米籠表面。

2.4 TEM分析(圖3)

圖3 金納米籠(a)和糖基化金納米籠復(fù)合物(b～d)的TEM照片F(xiàn)ig.3 TEM images of AuNCs(a) and AuNCs@P(DEGMA-co-OVNGlu)(b-d)

由圖3可知,金納米籠的粒徑為50 nm;經(jīng)糖基聚合物修飾后金納米籠的分散性較好,糖基化金納米籠復(fù)合物的粒徑在60 nm左右,且仍具有中空多孔的形態(tài)。金納米籠表面有一層淡淡的暈,進(jìn)一步證明糖基聚合物成功接枝到金納米籠表面。

2.5 糖基化金納米籠復(fù)合物的光熱轉(zhuǎn)換作用(圖4)

圖4 Au濃度為20 μg·mL-1的糖基化金納米籠復(fù)合物溶液在不同強(qiáng)度的808 nm激光照射300 s的體系(a)、不同Au濃度的糖基化金納米籠復(fù)合物溶液在808 nm激光(強(qiáng)度1.0 W·cm-2)照射300 s的體系(b)、Au濃度為20 μg·mL-1的糖基化金納米籠復(fù)合物溶液在808 nm激光(強(qiáng)度1.0 W·cm-2)照射300 s后自然冷卻至室溫的體系(c)的溫度變化曲線及Au濃度為20 μg·mL-1的糖基化金納米籠復(fù)合物溶液在冷卻過程中-lnθ-t的關(guān)系曲線(d)Fig.4 Temperature change curves of AuNCs@P(DEGMA-co-OVNGlu) solution with Au concentration of 20 μg·mL-1 irradiated for 300 s by 808 nm laser with different intensities(a),AuNCs@P(DEGMA-co-OVNGlu) solution with different Au concentrations irradiated for 300 s by 808 nm laser(intensity of 1.0 W·cm-2)(b),AuNCs@P(DEGMA-co-OVNGlu) solution with Au concentration of 20 μg·mL-1 naturally cooling to room temperature after 300 s irradiation by 808 nm laser(intensity of 1.0 W·cm-2)(c),and -lnθ-t relationship curve of AuNCs@P(DEGMA-co-OVNGlu) solution with Au concentration of 20 μg·mL-1 during cooling process

由圖4a可知,當(dāng)Au濃度為20 μg·mL-1的糖基化金納米籠復(fù)合物溶液在強(qiáng)度分別為0.8 W·cm-2、1.0 W·cm-2、1.2 W·cm-2、1.4 W·cm-2和1.6 W·cm-2的808 nm激光照射300 s后,溶液溫度分別為28.0 ℃、34.6 ℃、36.0 ℃、40.2 ℃和44.2 ℃,即激光強(qiáng)度越強(qiáng),溶液升溫越快。表明金納米籠接枝糖基聚合物后仍具有較好的光熱性能。由圖4b可知,當(dāng)Au濃度分別為4 μg·mL-1、8 μg·mL-1、12 μg·mL-1、16 μg·mL-1和20 μg·mL-1的糖基化金納米籠復(fù)合物溶液在808 nm激光(強(qiáng)度1.0 W·cm-2)照射300 s后,溶液溫度分別為26.0 ℃、27.7 ℃、30.2 ℃、33.1 ℃和34.6 ℃,即Au濃度越大,溶液升溫越快。表明糖基化金納米籠復(fù)合物的光熱轉(zhuǎn)換效率取決于激光強(qiáng)度及Au濃度,溶液的最終溫度與激光強(qiáng)度及Au濃度呈正相關(guān)。

超純水對(duì)照組的溫差ΔT=0.4 ℃,由于水的比熱容C為4.2×103J·kg-1·℃-1,計(jì)算得到Qdis=0.112 mW;由擬合曲線計(jì)算得到τ為69.24 s(圖4d)。

由于糖基化金納米籠復(fù)合物溶解在0.2 mL水中,根據(jù)式(2)計(jì)算得到hS=12.13 mW·℃-1。由式(3)計(jì)算得到Au濃度為20 μg·L-1的糖基化金納米籠復(fù)合物在808 nm激光(強(qiáng)度1.0 W·cm-2)照射下(A808=0.137)的光熱轉(zhuǎn)換效率為43.01%。

2.6 糖基化金納米籠復(fù)合物的光熱穩(wěn)定性(圖5)

圖5 Au濃度為20 μg·mL-1的糖基化金納米籠復(fù)合物溶液在808 nm激光(強(qiáng)度1.0 W·cm-2)照射下的光熱穩(wěn)定性Fig.5 Photothermal stability of AuNCs@P(DEGMA-co-OVNGlu) solution with Au concentration of 20 μg·mL-1 after irradiation by 808 nm laser(intensity of 1.0 W·cm-2)

由圖5可知,當(dāng)循環(huán)次數(shù)增加時(shí),體系最高溫度逐漸升高,在4次循環(huán)中,體系最高溫度分別達(dá)到34.6 ℃、34.9 ℃、35.1 ℃和35.3 ℃。這是因?yàn)?升溫會(huì)導(dǎo)致溶液水分揮發(fā),增加Au濃度,而激光強(qiáng)度不變,則體系最高溫度升高。說明糖基化金納米籠復(fù)合物仍具有良好的光熱穩(wěn)定性。

2.7 糖基化金納米籠復(fù)合物與凝集素ConA的特異性識(shí)別作用

利用紫外濁度法分析糖基化金納米籠復(fù)合物識(shí)別ConA后溶液的吸光度變化,發(fā)現(xiàn)加入ConA后約20 min,溶液的吸光度趨于穩(wěn)定,最終透光率達(dá)到57%。說明糖基聚合物接枝到金納米籠表面并沒有改變糖基聚合物對(duì)凝集素ConA的特異性識(shí)別能力。另外,糖基化金納米籠復(fù)合物與凝集素ConA識(shí)別后粒徑由62.8 nm增大到80.2 nm,表明糖基化金納米籠復(fù)合物與ConA發(fā)生了識(shí)別。

3 結(jié)論

通過酶促可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合-原位還原法制備了溫敏性糖基化金納米籠復(fù)合物。紫外可見吸收光譜表明,糖基化金納米籠復(fù)合物具有良好的溫敏性,其LCST為42.6 ℃;經(jīng)激光照射后,糖基化金納米籠復(fù)合物溶液升溫快,光熱轉(zhuǎn)換效率高,達(dá)到43.01%;糖基化金納米籠復(fù)合物保留了對(duì)凝集素ConA的特異性識(shí)別作用,表明糖基化金納米籠載藥體系對(duì)腫瘤靶向治療具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。