N-乙酰-D-半乳糖胺修飾頭孢克洛-殼聚糖納米乳的制備及釋藥性能研究

李華榕,鄭品勁,孔松芝,鄭心宜,郝鈺婷,梁麗娟,廖銘能

(廣東海洋大學(xué),廣東 湛江 524000)

頭孢克洛為β-內(nèi)酰胺類抗生素,屬于第二代頭孢菌素類藥物,其抗菌作用機(jī)制與其它頭孢菌素類藥物相似,主要通過與細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)結(jié)合,抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的生物合成而起到殺菌作用。作為市面上較為常用的抗生素藥物,頭孢克洛劑型有很多,如片劑、顆粒劑、膠囊劑、干混旋劑等。由于頭孢克洛微溶于水,頭孢克洛制劑普遍存在穩(wěn)定性較差、易產(chǎn)生耐藥性等問題[1]。將頭孢克洛設(shè)計(jì)為適宜的載藥納米乳等緩釋制劑,可以有效降低藥物使用劑量,延長藥物在病灶部位的滯留時(shí)間,提高藥物生物利用度[2-3]。

殼聚糖具有生物降解性、細(xì)胞親和性和生物效應(yīng)等獨(dú)特性質(zhì),尤其是含有游離氨基的殼聚糖,是天然多糖中唯一的堿性多糖[4]。殼聚糖微球表面富有多糖鏈,能被特異性細(xì)胞或組織識(shí)別,可靶向投遞藥物至病灶部位貯存、釋放;殼聚糖微球表面可連接功能基團(tuán),通過吸附或包裹方式負(fù)載不同藥物。殼聚糖作為藥物載體,可以穩(wěn)定藥物成分,延緩或控制藥物的溶解速度,促進(jìn)藥物吸收,幫助藥物到達(dá)靶器官,且具有抗酸、抗?jié)児π?可防止藥物對(duì)胃的刺激。殼聚糖載藥納米乳的藥物釋放與殼聚糖分子量有關(guān),一般藥物的釋放速率隨殼聚糖分子量的增大而減慢,且殼聚糖濃度越高,藥物從殼聚糖中擴(kuò)散進(jìn)入生物介質(zhì)的速率越慢[5]。

在此,作者采用低能乳化法制備N-乙酰-D-半乳糖胺修飾頭孢克洛-殼聚糖納米乳[6],測(cè)定納米乳的粒徑和Zeta電位[7-8],通過比較納米乳和頭孢克洛混懸液的累積釋藥率、考察釋放介質(zhì)和乳化劑用量對(duì)納米乳累積釋藥率的影響初步研究其釋藥性能。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

頭孢克洛(純度≥99%)、N-乙酰-D-半乳糖胺(純度≥98%)、殼聚糖(脫乙酰度 90%)、聚氧乙烯氫化蓖麻油(S25692)、磷酸二氫鉀(分析純),上海源葉生物科技有限公司;醋酸(分析純)、吐溫-80(化學(xué)純)、十二水合磷酸氫二鈉(分析純),廣東光華科技股份有限公司;實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

FR124CN型電子天平,奧豪斯儀器(常州)有限公司;DL-5-B型低速大容量離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì),上海生析超聲儀器有限公司; 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,上海羌強(qiáng)儀器設(shè)備有限公司;DK-98-Ⅱ型電子萬用爐(電壓220 V,AC功率1 000 W),天津泰斯特儀器有限公司;普通透析袋(分子量8 000～14 000),上海源葉生物科技有限公司。

1.2 N-乙酰-D-半乳糖胺修飾頭孢克洛-殼聚糖納米乳的制備方法

1.2.1 溶液的制備

殼聚糖醋酸溶液:精密量取1 mL醋酸于50 mL容量瓶中,用蒸餾水定容至刻度,得到2%醋酸溶液;精密稱取0.5 g 殼聚糖于燒杯中,加入2%醋酸溶液,磁力攪拌30～60 min,直至殼聚糖完全溶解,得到殼聚糖醋酸溶液,靜置,待攪拌時(shí)產(chǎn)生的氣泡除凈后即可使用。

PBS緩沖溶液:精密稱取磷酸二氫鉀0.011 5 g、十二水合磷酸氫二鈉0.248 6 g于50 mL容量瓶中,用蒸餾水定容至刻度,搖勻并超聲溶解5 min,得到PBS緩沖溶液,其pH值在7.3～7.5范圍內(nèi)。

N-乙酰-D-半乳糖胺的PBS溶液:將適量N-乙酰-D-半乳糖胺加入到含PBS緩沖溶液的燒杯中,攪拌均勻,得到N-乙酰-D-半乳糖胺的PBS溶液。

1.2.2N-乙酰-D-半乳糖胺修飾頭孢克洛-殼聚糖納米乳的制備[9-12]

精密稱取2.4 g聚氧乙烯氫化蓖麻油于小研缽中,加入0.1 g頭孢克洛,在加熱條件下不停攪拌,使頭孢克洛全部溶解于蓖麻油中;隨后將其加入到含4.5 g乳化劑吐溫-80的燒杯中,磁力攪拌30 min,得到油相;依次將6.5 mLN-乙酰-D-半乳糖胺的PBS溶液、5.5 mL殼聚糖醋酸溶液加入到另一空燒杯中,攪拌均勻,得到水相;將油相緩慢加入到水相中, 磁力攪拌30 min后,超聲15 min,得到N-乙酰-D-半乳糖胺修飾頭孢克洛-殼聚糖納米乳(以下簡(jiǎn)稱納米乳)。

1.3 頭孢克洛標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取頭孢克洛10 mg于50 mL容量瓶中,加入適量蒸餾水超聲溶解并定容至刻度,搖勻,得到濃度為0.2 mg·mL-1的頭孢克洛標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密量取0.05 mL、0.25 mL、0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、2.5 mL頭孢克洛標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中,用蒸餾水定容至刻度,搖勻,靜置10 min,采用紫外分光光度法測(cè)定263 nm處吸光度。以濃度(c,μg·mL-1)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,擬合得線性回歸方程為A=0.02154c+0.0112,R2=0.9999。頭孢克洛濃度在1.0～50.0 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

1.4 頭孢克洛混懸液的制備

精確稱取與納米乳所含藥物等量的頭孢克洛,加入5 mL蒸餾水,混勻,得到頭孢克洛混懸液。

1.5 包封率和載藥量的測(cè)定

精密量取4 mL納米乳于透析袋中,用透析袋夾夾緊兩端,置于裝有200 mL蒸餾水的燒杯中;在30 ℃下磁力攪拌(100 r·min-1)3 h后,取一定量透析介質(zhì),采用紫外分光光度法測(cè)定263 nm處吸光度(A)。分別按式(2)、式(3)計(jì)算包封率和載藥量:

(1)

(2)

(3)

式中:m0為頭孢克洛的加入質(zhì)量,mg;m1為透析介質(zhì)中頭孢克洛的質(zhì)量,mg;m為4 mL納米乳的質(zhì)量,mg。

1.6 體外累積釋藥率的測(cè)定[13-14]

采用透析法測(cè)定納米乳的體外累積釋藥率。精密量取5 mL納米乳于透析袋中,用透析袋夾夾緊兩端,置于裝有350 mL釋放介質(zhì)的溶出杯中, 將溶出杯置于恒溫磁力攪拌器上,在30 ℃、100 r·min-1條件下進(jìn)行釋藥;分別在0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h吸取5 mL釋放介質(zhì),同時(shí)補(bǔ)充5 mL等溫新鮮釋放介質(zhì)。 將取出的釋放介質(zhì)經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后,采用紫外分光光度法測(cè)定 263 nm處吸光度,并按式(4)計(jì)算納米乳的累積釋藥率(Q):

(4)

式中:cn為第n次取出釋放介質(zhì)中頭孢克洛濃度,mg·mL-1;ci為第i次取出釋放介質(zhì)中頭孢克洛濃度,i=n-1,mg·mL-1;V0為釋放介質(zhì)總體積,即350 mL;Vi為取出的釋放介質(zhì)體積,即5 mL;m為納米乳所含頭孢克洛總質(zhì)量,mg。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米乳的表征

2.1.1 粒徑分析(圖1)

圖1 納米乳的粒徑分布Fig.1 Particle size distribution of nanoemulsion

由圖1可知,納米乳的粒徑在60～250 nm范圍內(nèi)。

2.1.2 Zeta 電位分析(圖2)

圖2 納米乳的Zeta電位分布Fig.2 Zeta potential distribution of nanoemulsion

由圖2可知,納米乳的Zeta電位為(3.63±0.32) mV。

2.2 納米乳的包封率和載藥量(表1)

表1 納米乳的包封率和載藥量Tab.1 Encapsulation rate and drug loading rate of nanoemulsion

根據(jù)表1數(shù)據(jù),3#、7#、8#樣品的包封率和載藥量較高且更接近,后續(xù)選用3#、7#、8#樣品進(jìn)行體外釋藥性能研究。

2.3 納米乳的體外釋藥性能

2.3.1 納米乳與頭孢克洛混懸液的累積釋藥率比較

以蒸餾水為釋放介質(zhì),按1.6方法測(cè)定24 h內(nèi)納米乳和頭孢克洛混懸液的累積釋藥率,結(jié)果見圖3。

圖3 納米乳和頭孢克洛混懸液的累積釋藥率-時(shí)間曲線Fig.3 Cumulative drug release rate-time curves of nanoemulsion and Cefaclor suspension

由圖3可知, 隨著時(shí)間延長,納米乳和頭孢克洛混懸液的累積釋藥率均先迅速升高。對(duì)于頭孢克洛混懸液,前2 h釋藥較快,且其累積釋藥率比納米乳的高,可能是由于,部分頭孢克洛溶于水后濃度較大, 析出較快;2 h后,其累積釋藥率升幅趨緩后趨于穩(wěn)定,24 h累積釋藥率僅50.53%,這是因?yàn)?頭孢克洛微溶于水,透析袋中可能還存在未溶解的頭孢克洛,且透析袋內(nèi)外的濃度達(dá)到一致時(shí),頭孢克洛不再透膜析出,故而對(duì)其累積釋藥率有較大影響。對(duì)于納米乳,2 h時(shí),其累積釋藥率達(dá)到49.61%; 2 h后,其累積釋藥率仍逐漸升高,24 h累積釋藥率達(dá)到72.43%,可見納米乳的累積釋藥率上升趨勢(shì)相對(duì)明顯,釋藥性能更優(yōu),可能是由于,納米乳可提高藥物溶解度,從而提高藥物的生物利用度。

2.3.2 釋放介質(zhì)對(duì)納米乳累積釋藥率的影響

分別以蒸餾水和pH值7.3的PBS緩沖溶液為釋放介質(zhì),按1.6方法測(cè)定24 h內(nèi)納米乳的累積釋藥率,結(jié)果見圖4。

圖4 不同釋放介質(zhì)中納米乳的累積釋藥率-時(shí)間曲線Fig.4 Cumulative drug release rate-time curves of nanoemulsion in different release media

由圖4可知,以PBS緩沖溶液為釋放介質(zhì)時(shí),納米乳的24 h累積釋藥率僅31.87%;以蒸餾水為釋放介質(zhì)時(shí),納米乳的累積釋藥率較高,24 h累積釋藥率為72.43%,釋藥性能更優(yōu)。可能是由于,頭孢克洛為弱酸性藥物,而PBS緩沖溶液的pH值為7.3, 偏堿性,弱酸性藥物在堿性環(huán)境下易解離,透析膜內(nèi)非離子型多,不易轉(zhuǎn)運(yùn),對(duì)藥物穿過透析膜有一定影響,因此納米乳在PBS緩沖溶液中的累積釋藥率較低。

2.3.3 乳化劑用量對(duì)納米乳累積釋藥率的影響

乳化劑用量分別為3 g、5 g、8 g,其它條件不變,按1.2.2方法制備納米乳,按1.6方法測(cè)定24 h內(nèi)納米乳的累積釋藥率,結(jié)果見圖5。

圖5 不同乳化劑用量下納米乳的累積釋藥率-時(shí)間曲線Fig.5 Cumulative drug release rate-time curves of nanoemulsions with different emulsifier dosages

由圖5可知,隨著乳化劑用量的增加,納米乳的累積釋藥率逐漸升高;當(dāng)乳化劑用量為8 g時(shí), 24 h累積釋藥率最高達(dá)到72.43%。

2.4 釋藥模型擬合

對(duì)納米乳在0.5～24 h的累積釋藥率-時(shí)間曲線進(jìn)行擬合,得到釋藥模型方程:零級(jí)方程:Q=1.84882t+40.18943,R2=0.5829;一級(jí)方程:ln(1-Q)=0.63021t+66.03777,R2=0.9534;Higuchi方程:Q=11.99124t1/2+24.84411,R2=0.7942。零級(jí)方程的R2為0.582 9,說明納米乳的釋藥行為與零級(jí)釋藥模型擬合度較差,納米乳并不是恒速釋放藥物;一級(jí)方程的R2為0.953 4,說明納米乳的釋藥行為符合一級(jí)釋藥模型;Higuchi方程的R2為0.794 2,說明納米乳的釋藥行為與Higuchi釋藥模型擬合度也不高,不符合Higuchi釋藥模型。

3 結(jié)論

制備的納米乳的粒徑在60～250 nm范圍內(nèi),Zeta電位為(3.63±0.32) mV;相較于頭孢克洛混懸液,納米乳的釋藥性能更優(yōu),但納米乳不適合在偏堿性環(huán)境(pH≥7.3)中釋藥;在3～8 g范圍內(nèi),隨著乳化劑用量的增加,納米乳的累積釋藥率逐漸升高,當(dāng)乳化劑用量為8 g時(shí),24 h累積釋藥率最高達(dá)到72.43%;納米乳的釋藥行為符合一級(jí)釋藥模型。納米乳是一種釋放性能較好的藥物劑型,在藥物傳遞過程中可達(dá)到緩釋效果,但該研究未優(yōu)化制備納米乳的藥物配方,其包封率和載藥量偏低,因此納米乳的制備工藝有待進(jìn)一步深入研究。