水相中GOx@ZIF-7/PDA的制備及酶學(xué)性能研究

劉思媛,劉精杏,王則奮,朱小璐,李妍雪,蘭雄雕*,劉彭如,藍(lán)平*

1(廣西民族大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,廣西多糖材料與改性重點(diǎn)實驗室,廣西高?；瘜W(xué)與生物轉(zhuǎn)化過程新技術(shù)實驗室,廣西 南寧,530006)2(廣西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,廣西 南寧,530000)3(廣西產(chǎn)研院生物制造技術(shù)研究所有限公司,廣西 南寧,530000)

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOx)是一種能夠催化葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫的生物催化劑[1]。因其具有安全性、高效性、高度特異性和反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn),GOx在多種工業(yè)和商業(yè)應(yīng)用中發(fā)揮著重要作用[2]。在食品領(lǐng)域,GOx常作為乳制品、烘焙和飲料加工等工業(yè)中的天然保鮮劑、抗氧化劑、褐變抑制劑和改性劑等[3]。在生物醫(yī)藥領(lǐng)域,GOx在癌癥治療、糖尿病的檢測和治療以及傷口護(hù)理等方面均受到廣泛關(guān)注[4]。然而,GOx的本質(zhì)是蛋白質(zhì),在生產(chǎn)中常見的有機(jī)溶劑、高溫、高壓、過高/過低pH值等環(huán)境下易失活且貯存穩(wěn)定性不足限制了GOx高效催化的發(fā)揮[5-6]。同時,游離GOx難以從產(chǎn)物中分離,不利于重復(fù)使用,增加了生產(chǎn)成本[7]。研究表明,固定化GOx不僅可以實現(xiàn)酶和產(chǎn)物的分離,還能改善酶的穩(wěn)定性,提高重復(fù)使用性,降低生產(chǎn)成本,符合綠色化學(xué)和可持續(xù)發(fā)展需求[8-9]。

金屬有機(jī)骨架(metal-organic frameworks,MOFs)材料是由金屬離子(或金屬簇)和有機(jī)配體通過配位作用構(gòu)成的多孔有機(jī)-無機(jī)雜化材料[6],具有結(jié)構(gòu)多樣、穩(wěn)定性高、孔隙率高、孔道可調(diào)等優(yōu)勢,被認(rèn)為是有前景的酶固定化載體材料[10]。目前,常用的酶-MOFs復(fù)合材料的制備方法包括表面吸附法[11]、共價結(jié)合法[12]和原位包埋法[9]。前兩種方法制得的固定化酶穩(wěn)定性有所提高,但是它們屬于合成后修飾酶,存在酶浸出、不完全保護(hù)或固定過程中酶易失活的問題,并且MOFs的空間結(jié)構(gòu)沒有得到充分利用[13-14]。原位包埋法屬于從頭合成法,在MOFs形成的過程中將酶分子固定在材料中,酶被保護(hù)在MOFs空間結(jié)構(gòu)中,同時允許底物和產(chǎn)物通過。該方法制備得到的固定化酶減少了酶浸出,提高了酶的穩(wěn)定性[15-16]。目前,能成功用于酶原位包埋的MOFs很少,主要是ZIF(zeolitic imidazolate frameworks)系列的MOFs[14,16],這是因為大多數(shù)MOFs需要在有機(jī)溶劑中合成,會破壞酶的構(gòu)象,造成酶失活。此外,一些研究發(fā)現(xiàn)常用于酶固定化的ZIF-8在酸性pH值條件下和某些緩沖液(如磷酸鹽緩沖液)中是不穩(wěn)定的,會導(dǎo)致ZIF-8結(jié)構(gòu)破壞[17-18]。因此,還需合理設(shè)計出更穩(wěn)定的MOFs材料,從而推動酶-MOFs生物復(fù)合材料的應(yīng)用。

ZIF-7與ZIF-8同屬于ZIF系列金屬有機(jī)骨架材料,由鋅離子與苯并咪唑配位連接而成[19]。與ZIF-8類似,ZIF-7同樣具有高負(fù)載率、良好的生物相容性、高的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性,甚至有研究表明ZIF-7的穩(wěn)定性優(yōu)于ZIF-8[20]。但到目前為止,關(guān)于將ZIF-7作為酶固定化基質(zhì)的研究較少,可能是由于ZIF-7疏水性較強(qiáng)且通常在有機(jī)溶劑中進(jìn)行合成,如N,N-二甲基甲酰胺(dimethylformamide,DMF)[21],不適于原位包埋法制備酶-MOFs復(fù)合材料。

本研究首次在水相中采用原位包埋法制備了固定化酶GOx@ZIF-7。此外,為了改善ZIF-7材料的疏水性、防止可能發(fā)生的酶浸出并進(jìn)一步提高固定化酶GOx@ZIF-7生物復(fù)合材料的穩(wěn)定性,本研究利用多巴胺的生物相容性和自聚合特性,在固定化酶GOx@ZIF-7生物復(fù)合材料上合成了親水性的聚多巴胺(polydopamine,PDA)修飾層,得到固定化酶GOx@ZIF-7/PDA[9]。本研究優(yōu)化了固定化酶GOx@ZIF-7/PDA各種固定化條件,采用傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectrometer,FT-IR)、X-射線多晶粉末衍射(powder X-ray diffractometry,PXRD)對材料進(jìn)行了表征分析,并對其酶學(xué)性質(zhì)和穩(wěn)定性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄糖氧化酶(GOx,E.C.1.1.3.4源于黑曲霉,100 U/mg)、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP,E.C.1.11.1.7源于辣根,300 U/mg)、ABTS、Zn(NO3)2·6H2O、苯并咪唑(benzimidazole,Bim)(均為分析純),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)(超級純),上海麥克林生化有限公司;十二水合磷酸氫二鈉、D-葡萄糖(均為分析純),廣東光華科技有限公司;磷酸二氫鉀(分析純),天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

H1850R低溫高速離心機(jī),湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;HNY-200B臺式全溫振蕩器,天津歐諾儀器股份有限公司;UV-2600 紫外可見分光光度計,日本島津公司;MiniFlex600 X-射線多晶粉末衍射儀,日本理學(xué)公司;Nicolet IS10傅里葉變換紅外光譜儀, 美國Thermo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 GOx活力測定

用分光光度法測定游離GOx和固定化酶的活性,參照文獻(xiàn)[22]方法進(jìn)行,略加修改。將10 μL 5 mg/L 游離酶溶液/固定化酶溶液加入含有100 μL 100 mg/L HRP溶液、780 μL pH 7.4的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液、100 μL 1 mol/L葡萄糖溶液和10 μL 50 mmol/L ABTS溶液的反應(yīng)體系中,在室溫下反應(yīng)3 min,同時在分光光度計上連續(xù)監(jiān)測415 nm處吸光度的增加量。

GOx的酶活力單位(U)定義為在一定條件下,1 min 內(nèi)產(chǎn)生1 μmol H2O2所需的酶量。

酶固定化效率指固定的游離酶活力占初始加入的總游離酶活力的百分?jǐn)?shù),計算如公式(1)所示:

(1)

式中:A1為加入的總游離酶活力,U;A2為上清液的總游離酶活力,U。

酶活回收率指固定化酶所測定的酶活力占所固定的游離酶活力的百分?jǐn)?shù),計算如公式(2)所示:

(2)

式中:A1為加入的總游離酶活力,U;A2為上清液的總游離酶活力,U;A3為固定化酶的總酶活力,U。

酶泄露率指固定化酶在緩沖液中浸泡一段時間后泄露的總游離酶活與浸泡前固定化酶固定的總游離酶活的百分?jǐn)?shù),計算如公式(3)所示:

(3)

式中:A1為加入的總游離酶活力,U;A2為上清液的總游離酶活力,U;A4為泄露的總游離酶活力,U。

1.3.2 固定化酶GOx@ZIF-7/PDA的制備及表征

1.3.2.1 GOx@ZIF-7的制備

稱取一定量的GOx溶解于5 mL Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L,pH 6.0～8.0)中,然后分別加入25 mL 5～75 mmol/L Bim溶液和2.5 mL 39～500 mmol/L硝酸鋅溶液,在一定溫度25～45 ℃下攪拌反應(yīng)一定時間后,在10 000 r/min下離心10 min,并用去離子水洗滌3次,收集上清液和沉淀,沉淀冷凍干燥,得到GOx@ZIF-7。

1.3.2.2 GOx@ZIF-7/PDA的制備

取1.3.2.1節(jié)制備得到的沉淀0.78 g分散于10 mL新鮮制備的Tris-HCl緩沖液(10 mmol/L,pH 8.5)中,加入10～30 mg鹽酸多巴胺,于25 ℃恒溫?fù)u床中180 r/min振蕩10 h,10 000 r/min離心10 min,并用去離子水洗滌3次,冷凍干燥,得到GOx@ZIF-7/PDA。制備流程圖如圖1所示。

圖1 GOx@ZIF-7/PDA的制備示意圖Fig.1 Schematic preparation of GOx@ZIF-7/PDA

1.3.2.3 表征

分別用PXRD、FT-IR對ZIF-7, GOx@ZIF-7及GOx@ZIF-7/PDA進(jìn)行表征。

1.3.3 GOx@ZIF-7/PDA的酶學(xué)性質(zhì)

1.3.3.1 最適pH值

將10 μL游離GOx和GOx@ZIF-7/PDA分別加入含有100 μL 100 mg/L HRP溶液、780 μL的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 5.0～8.0)、100 μL 1 mol/L葡萄糖溶液和10 μL 50 mmol/L ABTS溶液的反應(yīng)體系中,在25 ℃下進(jìn)行酶促反應(yīng),測定酶活力。以同組酶活力的最高值為100%,計算相對活力。

1.3.3.2 最適溫度

將10 μL游離GOx和GOx@ZIF-7/PDA分別加入含有100 μL 100 mg/L HRP溶液、780 μL pH 6.0的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液、100 μL 1 mol/L葡萄糖溶液和10 μL 50 mmol/L ABTS溶液的反應(yīng)體系中,在25～75 ℃下進(jìn)行酶促反應(yīng),測定酶活力。以同組酶活力的最高值為100%,計算相對活力。

1.3.3.3 酶催化動力學(xué)參數(shù)測定

在最適pH和溫度下,通過記錄1 min內(nèi)在415 nm處吸光度的增加,測量了游離GOx和固定化酶催化濃度為2～100 mmol/L的葡萄糖的初始速率,并通過Lineweaver-Burk方程計算米氏常數(shù)(Km),如公式(4)所示:

(4)

式中:V0為初始反應(yīng)速率,μmol/(L·min),Vmax為最大反應(yīng)速率,μmol/(L·min),[S]為初始葡萄糖濃度,mmol/L,Km為Michaelis-Menten常數(shù),mmol/L。

1.3.3.4 pH穩(wěn)定性

在25 ℃下,將蛋白質(zhì)含量相同的游離GOx和GOx@ZIF-7/PDA分別在50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液(pH 4.5～9.5)的中放置30 min,然后測定酶活力。以未處理的樣品酶活力為100%,計算相對活力。

1.3.3.5 溫度穩(wěn)定性

將相同蛋白質(zhì)含量的游離GOx和GOx@ZIF-7/PDA分別分散在50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 6.0)中,在40～70 ℃的溫度下處理30 min后測定酶活力,以未處理的樣品酶活力為100%,計算相對活力。

1.3.3.6 貯存穩(wěn)定性

將具有相同蛋白質(zhì)含量的游離GOx和GOx@ZIF-7/PDA重懸50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 6.0)中,在4 ℃條件下貯存,每隔1 d各取出一部分相同體積的酶液測定酶活力。以未進(jìn)行貯存的酶活力為100%,計算相對活力。

1.3.3.7 重復(fù)操作穩(wěn)定性

取30 mg GOx@ZIF-7/PDA,在最適溫度和最適pH條件下,重復(fù)測定其活性,以第一次測定的酶活力為100%,計算相對活力,確定固定化酶的重復(fù)操作穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 GOx固定化工藝優(yōu)化

2.1.1 固定化時間對固定化效果的影響

固定化時間對固定化效果的影響如圖2-a所示。隨著固定化時間的增加,酶活回收率先增加后減少,在固定時間為40 min時,固定化酶的酶活回收率達(dá)到最高,為(17.08±2.27)%;而固定化時間為10～40 min時,酶固定化效率明顯增加,在40 min后,酶固定化效率緩慢增加。這可能是由于隨著固定時間的延長,固定的酶量增多,但固定時間超過40 min后,GOx周圍堆積的ZIF-7過多,底物難以接近接近酶活性中心,從而使固定化酶活力降低。因此,固定化時間選擇為40 min。

2.1.2 加酶量對固定化效果的影響

加酶量對固定化效果的影響如圖2-b所示。隨著加酶量的增加,酶固定化效率無明顯變化。在加酶量為5 g/L時,酶活回收率最高,為(17.88±1.89)%,隨著加酶量的進(jìn)一步增加,酶活回收率逐漸下降,這一現(xiàn)象可能是由于固定化酶空間過于擁擠而阻礙了底物的傳質(zhì)[23]。因此,加酶量選擇為5 g/L。

2.1.3 Bim的濃度對固定化效果的影響

Bim的濃度對固定化效果的影響如圖2-c所示。當(dāng)Bim濃度低于50 mmol/L時,酶活回收率和酶固定化效率隨著濃度增大而升高,50 mmol/L時達(dá)到最高值[(17.88±1.92)%]。繼續(xù)增大Bim的濃度,酶固定化效率無明顯變化,而酶活回收率明顯降低。這是因為有機(jī)配體Bim的濃度過低時,難以形成ZIF-7,不能將GOx充分包埋,Bim的濃度過高,GOx周圍堆積的ZIF-7過多,導(dǎo)致固定化酶的酶活力降低。因此,Bim濃度選擇為50 mmol/L。

2.1.4 Zn2+與Bim的摩爾比對固定化效果的影響

分別按不同比例加入25 mL 50 mmol/L Bim水溶液和2.5 mL 39～500 mmol/L Zn(NO3)2·6H2O水溶液,使Zn2+與Bim的摩爾比依次為1：13, 1：11, 1：9, 1：7, 1：5, 1：3和1：1。Zn2+與Bim的摩爾比對固定化效果的影響如圖2-d所示。改變Zn2+與Bim的摩爾比對酶固定化效率的影響不明顯,但對酶活回收率有影響,當(dāng)Zn2+與Bim的摩爾比為1：9時,酶活回收率達(dá)到最高值,為(22.31±1.92)%,這可能是由于調(diào)節(jié)Zn2+和有機(jī)配體物質(zhì)的量濃度可以控制MOFs的形狀,在該摩爾比下,ZIF-7形狀更規(guī)則,分散更均勻,底物更容易接近酶的催化中心,從而提高了固定化酶活力[10,24]。因此,Zn2+與Bim的摩爾比選擇為1：9。

2.1.5 固定化溫度對固定化效果的影響

固定化溫度對固定化效果的影響如圖2-e所示。隨著固定化溫度的升高,酶固定化效率變化范圍較小,而固定化酶的酶活回收率變化明顯。當(dāng)固定化溫度為35 ℃時,酶活回收率達(dá)到最高,為(32.49±1.99)%。當(dāng)固定化溫度超過35 ℃時,酶活回收率快速下降。這是由于溫度的變化會引起酶的構(gòu)象發(fā)生變化,酶在過高的溫度下會變性,導(dǎo)致酶活力降低甚至失活。因此,固定化溫度選擇為35 ℃。

2.1.6 酶液pH值對固定化效果的影響

酶液pH值對固定化效果的影響如圖2-f所示。當(dāng)酶液pH值為7.0時,固定化酶的酶活回收率最高,為(32.91±2.17)%,pH值低于7.0,酶活回收率逐漸升高;pH值高于7.0,酶活回收率逐漸下降。酶液pH 6.0～7.0,酶固定化效率呈增加趨勢;pH 7.0～8.0,酶固定化效率趨于平穩(wěn)。這表明,酶液pH 6.0～7.0,Zn2+與Bim的配位作用逐漸增強(qiáng),越來越多的GOx被包封在ZIF-7中;此外,pH值也會對酶的空間構(gòu)像產(chǎn)生影響,當(dāng)酶液pH值超過7.0時,GOx部分失活,造成固定化酶活力下降。因此,固定化pH值選擇為7.0。

2.1.7 多巴胺濃度對固定化效果的影響

多巴胺濃度對固定化效果的影響如圖2-g所示。固定化酶的酶泄露率隨著多巴胺濃度增加而降低,當(dāng)多巴胺質(zhì)量濃度達(dá)到2.0 g/L時,酶泄露率降低至(0.11±1.00)%;而酶活回收率隨著多巴胺濃度增加先升高后降低,最大值為(43.34±2.00)%。這是由于多巴胺中的鄰苯二酚基團(tuán)能與ZIF-7表面的鋅離子產(chǎn)生絡(luò)合作用,并在固定化酶表面形成了厚度可控的親水性PDA涂層,能防止固定化酶塌陷和溶解[22,25]。隨著多巴胺濃度增加,親水性涂層逐漸增厚,固定化酶親水性提高,酶活力逐漸提高,但當(dāng)多巴胺質(zhì)量濃度超過2.0 g/L時,PDA層過厚,阻礙了底物接近酶的催化中心,固定化酶活力逐漸降低。因此,多巴胺質(zhì)量濃度選擇為2.0 g/L時,GOx固定化效果最佳。

2.2 固定化酶的表征

2.2.1 PXRD分析

對ZIF-7、GOx@ZIF-7和GOx@ZIF-7/PDA進(jìn)行PXRD分析,結(jié)果如圖3所示。圖中ZIF-7出現(xiàn)的衍射峰與報道的ZIF-7特征峰基本吻合,表明ZIF-7的成功合成[26-27]。GOx@ZIF-7、GOx@ZIF-7/PDA 與ZIF-7材料的特征衍射峰位置一致,進(jìn)一步證明GOx和PDA的引入不會對ZIF-7材料的晶體結(jié)構(gòu)造成顯著影響。此外,所有樣品在2θ為15.5°～25.9°均存在2個寬峰,這是由長程無序結(jié)構(gòu)造成的,表明樣品中存在部分無定形結(jié)構(gòu)和配位缺陷。

圖3 ZIF-7、GOx@ZIF-7及GOx@ZIF-7/PDA的PXRD分析Fig.3 PXRD analysis of ZIF-7, GOx@ZIF-7 and GOx@ZIF-7/PDA

2.2.2 FT-IR分析

圖4 GOx、ZIF-7、GOx@ZIF-7及GOx@ZIF-7/PDA的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.4 FT-IR spectra of GOx, ZIF-7, GOx@ZIF-7 and GOx@ZIF-7/PDA

2.3 固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 最適pH值

由圖5-a可知,固定化酶GOx@ZIF-7/PDA的最適催化pH值為6.0,與游離GOx相同,說明酶在被固定化后最適pH并不受影響。游離酶和固定化酶的相對活力都是隨著pH的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,但游離酶的變化趨勢更加劇烈。這是因為ZIF-7剛性結(jié)構(gòu)的存在能更好地保證GOx的空間結(jié)構(gòu),受pH值影響較小。

2.3.2 最適溫度

由圖5-b可知,游離GOx的最適溫度是40 ℃,固定化酶GOx@ZIF-7/PDA的最適溫度是55 ℃,GOx被固定化后最適反應(yīng)溫度有較大幅度的上升。與游離GOx相比,固定化酶曲線走向較為陡峭,可能是由于固定化酶GOx@ZIF-7/PDA在催化底物反應(yīng)過程中較游離酶有更大的傳質(zhì)阻力。

2.3.3 動力學(xué)參數(shù)

由圖5-c可知,固定化酶GOx@ZIF-7/PDA的Km值為(25.55±1.84)mmol/L,略大于游離酶Km值[(19.55±1.28) mmol/L],表明固定化酶對底物的親和力略小于游離酶,這是因為固定化酶GOx@ZIF-7/PDA在催化底物反應(yīng)過程中存在更大的傳質(zhì)限制,從而造成固定化酶GOx@ZIF-7/PDA較游離酶反應(yīng)速率降低[7,31]。

2.3.4 pH穩(wěn)定性

GOx是一種蛋白質(zhì),其催化性能易受環(huán)境pH值影響,過高或過低的pH值會破壞酶的三維結(jié)構(gòu)或者阻礙底物與酶結(jié)合,從而導(dǎo)致酶分子活性降低甚至失活。圖6-a為在不同pH值下處理30 min后游離酶和固定化酶GOx@ZIF-7/PDA的穩(wěn)定性。與游離酶相比,GOx@ZIF-7/PDA在較寬的pH值范圍內(nèi)表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性。一方面是因為ZIF-7/PDA致密的結(jié)構(gòu)對酶的保護(hù)作用,另一方面GOx@ZIF-7/PDA表面的不同電荷對酶催化反應(yīng)微環(huán)境存在一定的緩沖作用,使GOx@ZIF-7/PDA受pH值影響更小。

a-pH穩(wěn)定性;b-溫度穩(wěn)定性;c-貯存穩(wěn)定性;d-重復(fù)操作穩(wěn)定性圖6 GOx@ZIF-7/PDA的pH穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性和重復(fù)操作穩(wěn)定性Fig.6 pH stability, thermal stability, storage stability and reusability of GOx@ZIF-7/PDA

2.3.5 溫度穩(wěn)定性

圖6-b對游離酶GOx和固定化酶GOx@ZIF-7/PDA的溫度穩(wěn)定性進(jìn)行了評價。高于30 ℃后固定化酶GOx@ZIF-7/PDA的相對活力降低趨勢相對于游離酶更小,在70 ℃時,游離酶GOx的相對活力僅有(17.69±3.76)%,而GOx@ZIF-7/PDA仍具(65.29±3.84)%的相對活力。表明固定化酶GOx@ZIF-7/PDA的熱穩(wěn)定性明顯高于游離酶。這是由于高溫環(huán)境會破壞GOx的空間結(jié)構(gòu),導(dǎo)致不可逆失活,而GOx@ZIF-7/PDA為GOx提供了剛性的保護(hù)層,提高了熱穩(wěn)定性。

2.3.6 貯存穩(wěn)定性

圖6-c為游離酶GOx和固定化酶GOx@ZIF-7/PDA在4 ℃條件下的貯存穩(wěn)定性曲線。在4 ℃冷藏保存10 d后,游離酶GOx僅能保持(62.21±3.26)%的相對活力,而GOx@ZIF-7/PDA仍能保持接近100%的相對活力。結(jié)果表明,固定化酶GOx@ZIF-7/PDA酶反應(yīng)器的貯存穩(wěn)定性較游離酶顯著提高。這是由于固定化后的GOx@ZIF-7/PDA跟游離酶相比酶活性中心附近的微環(huán)境發(fā)生了變化,結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定,減少了外界環(huán)境對酶活性的影響[32]。

2.3.7 重復(fù)操作穩(wěn)定性

固定化酶能通過固液分離實現(xiàn)酶的重復(fù)使用,克服了游離酶難以從產(chǎn)物中分離出來的缺陷,有利于實現(xiàn)酶的大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用。由圖6-d可知,GOx@ZIF-7/PDA經(jīng)10次循環(huán)使用后,仍保持(96.53±2.26)%的相對活力。

3 結(jié)論

本研究在水相中通過原位包埋法成功合成了GOx@ZIF-7生物復(fù)合材料,再利用多巴胺的自聚合特性制備得到固定化酶GOx@ZIF-7/PDA,通過單因素試驗確定了固定化酶的最佳工藝條件。通過PXRD和FT-IR分析表明GOx成功固定在GOx@ZIF-7/PDA上。制備得到的GOx@ZIF-7/PDA的pH和溫度耐受性有所提高。在4 ℃貯藏10 d,酶活力基本保持不變,表現(xiàn)出良好的貯存穩(wěn)定性。此外,GOx@ZIF-7/PDA重復(fù)使用10次后,還能保持(96.53±2.26)%的活性,表現(xiàn)出良好的操作穩(wěn)定性。綜上,此方法得到的酶-MOF生物復(fù)合材料操作簡單,能提高酶的穩(wěn)定性,具有廣泛的發(fā)展前景。后續(xù)可在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高GOx@ZIF-7/PDA生物復(fù)合材料的酶活回收率,有望能在酶催化、分子識別、生物分析等領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)高效率、低成本的實際應(yīng)用。