超聲輔助低共熔溶劑法提取新疆大果沙棗多酚類化合物及其抗氧化活性研究

古麗菲熱·伊力哈木,馬夢亞,艾斯卡爾·吐爾遜,劉麗燕,肖移聰,倪曉瑩,李慕春,嚴(yán)歡,艾合買提江·艾海提*,劉軍*

1(新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆 烏魯木齊,830046)2(新疆林科院造林治沙研究所,新疆 烏魯木齊,830092)3(新疆維吾爾自治區(qū)分析測試研究院,新疆天然產(chǎn)物綠色加工工程技術(shù)研究中心,新疆 烏魯木齊,830011)

沙棗是西北地區(qū)具有開發(fā)利用前景的重要資源,大果沙棗(ElaeagnusmoorcroftiiWall.exSchlecht.)是新疆南疆地區(qū)重要的防風(fēng)固沙樹種,其花、果、葉等均有經(jīng)濟(jì)價值,也是一種重要的經(jīng)濟(jì)樹種[1]。大果沙棗可食部位營養(yǎng)豐富,具有多種功效價值,但其活性和藥理學(xué)研究目前仍然處在初步階段,主要以粗提物形式進(jìn)行,并且主要集中于一個沙棗品種(ElaeagnusangustifoliaL.)[2]。研究表明,沙棗中含有豐富的多酚類化合物,這些物質(zhì)具有很好的營養(yǎng)價值和抗氧化、抗炎活性,對體內(nèi)自由基的清除有著極大效果,可抑制脂質(zhì)氧化、延緩衰老、預(yù)防腫瘤、防止多種疾病的發(fā)生,是一種天然綠色的抗氧化劑[3];因此繼續(xù)開展對沙棗活性成分的研究并予以利用尤為重要。

多酚類化合物的經(jīng)典提取方式主要為有機(jī)溶劑提取,為了減少有機(jī)揮發(fā)性溶劑對環(huán)境和人類帶來的不利影響,近年來環(huán)境友好的綠色溶劑和創(chuàng)新技術(shù)備受關(guān)注,與傳統(tǒng)有機(jī)溶劑提取相比,新型溶劑[例如水、超臨界流體、生物基溶劑、離子液體和低共熔溶劑(deep eutectic solvents,DESs)]和微波、超聲、加壓等技術(shù)聯(lián)用,可獲得更安全、更高品質(zhì)的植物提取物[4]。

DESs是環(huán)境友好型綠色溶劑中最為有效的一種溶劑,相對于有機(jī)溶劑毒性大、易揮發(fā)、易燃易爆的問題,DESs具有安全性高、成本低、綠色環(huán)保等優(yōu)勢[5]。除此之外,DESs和同為綠色溶劑的離子液體相比,不僅具有離子液體的提取效率高、易降解等優(yōu)點,還能彌補(bǔ)離子液體具有一定毒性且易殘留、成本高的缺點[6]。DESs作為有機(jī)溶劑的替代溶劑常用于多酚類化合物的提取研究。羅蓉等[7]利用DESs和乙醇超聲輔助法提取山楂總黃酮,發(fā)現(xiàn)氯化膽堿-丙三醇作為DESs提取,其提取液中黃酮得率和抗氧化活性均優(yōu)于傳統(tǒng)的醇提法。王曉藝等[8]用同樣方法比較DESs和有機(jī)溶劑提取玫瑰多酚的效率,發(fā)現(xiàn)用氯化膽堿-乳酸為DESs提取的多酚含量比醇提法提高了24%。這些研究表明,DESs應(yīng)用于天然產(chǎn)物中多酚類化合物的提取比有機(jī)溶劑提取更具有顯著的實際意義。

多酚類化合物通常以自由、共軛可溶和不可溶的形式被包裹在植物細(xì)胞中。DESs通過氫鍵作用力能更好地滲透進(jìn)植物細(xì)胞,不僅可以高效地將多酚類化合物提取出來,而且更有助于保證酚類產(chǎn)品的安全。此外,通過超聲波等加工技術(shù)輔助,還可提高DESs大規(guī)模提取酚類化合物的效率。因此,DESs提取方法作為從自然資源中提取酚類化合物的一種環(huán)境友好方法值得進(jìn)一步探索開發(fā)。

本課題著眼于新疆南疆地區(qū)大果沙棗資源開發(fā),通過超聲輔助DESs提取新疆大果沙棗多酚類化合物的工藝,評價其體外抗氧化活性,對新的功能食品或藥物的研發(fā)具有科學(xué)意義,為沙棗的開發(fā)利用可提供有效的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新疆大果沙棗,品種:金莎,產(chǎn)自新疆喀什地區(qū)莎車縣阿瓦提鎮(zhèn),為新培育品種;氯化膽堿(>99.0%)、1,2-丙二醇(>99.0%)、乙二醇(>98.0%)、DPPH(純度> 99.5%)、ABTS(純度> 98.0%)、福林酚試劑,上海源葉生物科技有限公司;蘋果酸,常茂生物化學(xué)工程股份有限公司;檸檬酸,天津永晟精細(xì)化工有限公司;乳酸,天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心;乙二醇,熬稞新材料科技有限公司;丙三醇,天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司;無水葡萄糖,成都市科龍化工試劑廠;木糖醇,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;果糖,北京酷來搏科技有限公司;尿素,天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司;Trolox,美國Sigma公司;總抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)測定試劑盒,南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

Molecular Devices SpectraMax i3多功能酶標(biāo)儀,美谷分子儀器(上海)有限公司;3K15離心機(jī),美國Sigma公司;BSA124S-CW電子天平,賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;C-MAG HS7 digital加熱磁力攪拌器,德國艾卡儀器設(shè)備有限公司;電熱恒溫水浴鍋,上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;超聲清洗機(jī),上海喬躍電子科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 大果沙棗抗氧化成分的提取

新疆大果沙棗,去核留可食部分,60 ℃干燥24 h,粉碎過60目篩,即為大果沙棗粉,密封貯存?zhèn)溆?。?.5 g大果沙棗粉和5.0 mL的不同溶劑[水、60%(體積分?jǐn)?shù))乙醇、80%(體積分?jǐn)?shù))甲醇和12種不同DESs]充分混合,混合物用超聲波處理器處理,超聲時間30 min,超聲溫度50 ℃。將提取液定容,8 000 r/min離心5 min,取上清液過濾,收集濾液4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 DESs制備

DESs由氯化膽堿為氫鍵受體(hydrogen-bond acidity, HBA)與不同氫鍵供體(hydrogen-bond donor, HBD)按照一定摩爾比加熱攪拌生成。分別稱取適量的反應(yīng)物質(zhì)置于100 mL燒杯中,于80 ℃用磁力攪拌器進(jìn)行攪拌,直至得到無色透明液體,之后冷卻至室溫,即可制得DESs。為了降低所得液體的黏度,加入20%(體積分?jǐn)?shù))的水。室溫下溶劑貯存在玻璃瓶中。DESs組成見表1。

表1 DESs的組成Table 1 Composition of the DESs

1.3.3 大果沙棗多酚含量(total phenolic content, TPC)的測定

總酚含量測定采用福林酚法,具體參考DEWANTO等[9]并作適當(dāng)修改,取50 μL樣品溶液,加入0.5 mL雙純水和125 μL福林酚試劑,混合均勻,室溫下靜置6 min,然后加入1.25 mL 70 g/L的Na2CO3溶液,用雙純水補(bǔ)足至3 mL,振蕩均勻后在40 ℃水浴避光反應(yīng)90 min,最后用酶標(biāo)儀在760 nm的波長下測得其吸光值。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品,測得質(zhì)量濃度為1～12 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值,然后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,Y1=0.050 7X1+0.003 81(R2=0.999),其中X1為沒食子酸質(zhì)量濃度(μg/mL),Y1為吸光值。

總酚含量結(jié)果以每克大果沙棗中所含的沒食子酸當(dāng)量表示,單位為mg/g,計算如公式(1)所示:

(1)

式中:C為沒食子酸當(dāng)量質(zhì)量濃度,μg/mL;V為定容體積,mL;N為稀釋倍數(shù);m為樣品質(zhì)量,g。

1.3.4 大果沙棗黃酮含量(total flavonoid content, TFC)的測定

黃酮含量的測定方法采用AlCl3法,具體參考LIU等[10]方法并做適當(dāng)修改。取0.5 mL稀釋后的樣液,加入1.5 mL雙純水和90 μL 50 g/L的NaNO2溶液,振蕩均勻后室溫下反應(yīng)6 min,然后加入180 μL 100 g/L的AlCl3·6H2O溶液,靜置5 min后加入0.6 mL 1 mol/L的NaOH溶液,最后用雙純水補(bǔ)足到3 mL,用酶標(biāo)儀于510 nm下測得其吸光值。同時以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,測得質(zhì)量濃度為1～20 μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,Y2=0.006 2X2+0.000 8(R2=0.999 1),其中X2為蘆丁質(zhì)量濃度(μg/mL),Y2為吸光值。

總黃酮含量結(jié)果以每克大果沙棗中所含的蘆丁當(dāng)量(mg/g)表示,計算如公式(2)所示:

(2)

式中:C為蘆丁當(dāng)量質(zhì)量濃度,μg/mL;V為定容體積,mL;N為稀釋倍數(shù);m為樣品質(zhì)量,g。

1.3.5 DPPH自由基清除能力測定

將50 μL樣品稀釋液與150 μL DPPH 溶液(100 μmol/L,用無水乙醇溶解)在96孔板中混合,在室溫下避光反應(yīng)30 min,通過酶標(biāo)儀在517 nm處測定吸光值。以250 μg/mL Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品,以不同標(biāo)準(zhǔn)品濃度(X3)為橫坐標(biāo),DPPH自由基清除率(Y3)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,Y3=2.201 7X3+6.470 7(R2=0.997 1),自由基的清除能力以mg TE/g表示。

DPPH自由基清除率計算如公式(3)所示:

(3)

式中:Ai表示樣品組吸光值(50 μL樣品稀釋液+150 μL DPPH溶液);Aj表示空白樣品吸光值(50 μL無水乙醇+150 μL樣品稀釋液);A0表示空白組吸光值(50 μL無水乙醇+150 μL DPPH溶液)。

1.3.6 ABTS陽離子自由基清除能力測定

7 mmol/L ABTS水溶液和2.45 mmol/L過硫酸鉀水溶液混合,避光反應(yīng)12～16 h。用無水乙醇稀釋ABTS陽離子自由基溶液,使其在734 nm處的吸光度為0.70±0.02。將20 μL樣品稀釋液與180 μL ABTS陽離子自由基溶液混合,并在黑暗中靜置30 min,通過酶標(biāo)儀在734 nm處測定吸光值。以250 μg/mL Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品,以不同標(biāo)準(zhǔn)品濃度(X4)為橫坐標(biāo),ABTS陽離子自由基清除率(Y4)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,Y4=0.928 8X4+7.255 9(R2=0.999),自由基的清除能力以mg TE/g表示。

ABTS陽離子自由基清除率計算如公式(4)所示:

(4)

式中:Ai表示樣品組吸光值(20 μL樣品稀釋液+180 μL ABTS溶液);Aj表示空白樣品吸光值(20 μL無水乙醇+180 μL樣品稀釋液);A0表示空白組吸光值(20 μL無水乙醇+180 μL ABTS溶液)。

1.3.7 總抗氧化能力測定

本試驗采用T-AOC測定試劑盒對不同溶劑提取的大果沙棗提取液進(jìn)行測定,處理前分別將水、60%乙醇、80%甲醇以及DESs作為溶劑的提取液稀釋一定倍數(shù)后進(jìn)行測定,并將結(jié)果進(jìn)行計算。

1.3.8 超聲輔助DESs提取大果沙棗多酚類化合物的單因素優(yōu)化試驗

通過單因素試驗考察提取工藝參數(shù)對大果沙棗提取物多酚和黃酮得率的影響,包括不同溶劑提取(水、60%乙醇、80%甲醇和12種不同DESs)、DES-2中不同摩爾比(3：1,2：1,1：1,1：1.5,1：2,1：2.5,1：3)、不同含水率(0%,10%,20%,30%,40%,50%)、不同料液比(1：10,1：20,1：30,1：40,1：50,1：60)、不同超聲波時間(10、20、30、40、50、60、70 min)、不同提取溫度(20、30、40、50、60、70 ℃)。

1.3.9 超聲輔助DESs提取大果沙棗多酚類化合物的響應(yīng)面優(yōu)化試驗

采用Box-Behnken設(shè)計優(yōu)化提取條件。在上述單因素試驗方差分析后的基礎(chǔ)上,選擇含水率(A)、料液比(B)、超聲時間(C)和超聲溫度(D)4個變量作為Box-Behnken設(shè)計的自變量,以多酚得率(Y1)、黃酮得率(Y2)、DPPH自由基清除能力(Y3)和ABTS陽離子自由基清除能力(Y4)為響應(yīng)值,設(shè)計4因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗,共29組試驗,如表2所示。

表2 響應(yīng)面因素水平設(shè)計Table 2 Factors and levels of response surface methodology

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 20.0軟件LSD法進(jìn)行方差分析(ANOVA),并用不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);運(yùn)用OriginPro 2021軟件進(jìn)行繪圖;響應(yīng)面設(shè)計實驗及數(shù)據(jù)統(tǒng)計用Design Experct 13.0進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 最適溶劑選擇

本試驗選取廉價易得的季銨鹽類化合物——氯化膽堿(choline chloride, ChCl)作為氫鍵受體,以氫鍵供體的不同,將其分為四類共12種DESs進(jìn)行制備,包括ChCl-羧酸類、ChCl-多元醇類、ChCl-糖類和ChCl-酰胺及醇類。同時采用水、60%乙醇和80%甲醇作為傳統(tǒng)提取溶劑,在同一提取條件下,即溶劑含水率20%,料液比1：10,在50 ℃下超聲30 min進(jìn)行提取,測得的多酚和黃酮得率進(jìn)行對比,如圖1所示,所有的DESs對大果沙棗總酚的提取率遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)溶劑,但黃酮的提取率除ChCl-羧酸類DES外,均沒有達(dá)到有機(jī)溶劑所提取的含量,這里的原因可能是由于大果沙棗中主要成分是糖類,以羧酸為供氫體的DESs中存在著游離的H+,H+可促進(jìn)大果沙棗細(xì)胞壁中的纖維素、半纖維素和果膠的水解,有效加強(qiáng)了沙棗細(xì)胞中多酚類化合物向溶劑的釋放。

圖1 不同溶劑對大果沙棗多酚和黃酮得率的影響Fig.1 Effects of different solvents on the yield of polyphenols and flavonoids of E.moorcroftii Wall.ex Schlecht.注:圖中不同小寫字母表示存在顯著差異(P<0.05)(下同)。

由統(tǒng)計分析可知,ChCl-蘋果酸相較其他溶劑的提取率都顯著提高,ChCl-蘋果酸提取的多酚得率分別比水提、60%乙醇和80%甲醇提取的高出約5.2、4、3.6倍,該DESs提取的黃酮得率分別比水提、60%乙醇和80%甲醇提取的高出約23.7、5.5、4.7倍。因此,確定ChCl-蘋果酸(DES-2)為最合適的提取溶劑。

2.1.2 最適DESs摩爾比選擇

氫鍵受體和氫鍵供體摩爾比是影響DESs密度、分子間作用力、黏度、極性等物理化學(xué)性質(zhì)的因素[11]。由此設(shè)置了ChCl和蘋果酸不同的摩爾比溶劑體系,分別為3：1、2：1、1：1、1：1.5、1：2、1：2.5、1：3,提取實驗結(jié)果如圖2所示,過多的氫鍵供體或者氫鍵受體都會影響酚類化合物的得率。因此,實驗設(shè)置溶劑含水率為20%,料液比1：10,50 ℃下超聲30 min,當(dāng)兩者摩爾比例為1：1時,多酚和黃酮的得率最高,因此選擇氯化膽堿與蘋果酸的摩爾比為1：1。

圖2 不同摩爾比DESs溶劑對大果沙棗多酚和黃酮得率的影響Fig.2 Effects of DESs with different molar ratios on the yield of polyphenols and flavonoids of E.moorcroftii Wall.ex Schlecht.

2.1.3 最適DESs含水率選擇

DESs在常溫下可形成廣泛的氫鍵網(wǎng)絡(luò),具有了高黏度的特征。高黏度限制了有效成分的提取,而水的進(jìn)入,可以通過離子水之間形成氫鍵來降低DESs的黏度,進(jìn)而提高從固體到液體的傳質(zhì)速率[12]。此外,水還可增加DESs的極性,促進(jìn)生物資源中極性化合物的溶解。多酚類物質(zhì)都帶有多個羥基,屬于極性物質(zhì),但由圖3可知,隨著溶劑體系中含水量的增加,多酚和黃酮得率先增加后減少。這可能與DESs中水量過多導(dǎo)致體系中氫鍵的破壞以及影響了生物活性物質(zhì)與DESs之間的氫鍵作用有關(guān),從而造成目標(biāo)化合物的提取效率降低。實驗結(jié)果表明,ChCl-蘋果酸摩爾比1：1,料液比1：10,50 ℃下超聲30 min,DES含水量以30%為好,其多酚和黃酮的提取率達(dá)到最大值。

圖3 不同含水率對大果沙棗多酚和黃酮得率的影響Fig.3 Effects of DESs with different water content on the yield of polyphenols and flavonoids of E.moorcroftii Wall.ex Schlecht.

2.1.4 最適DESs料液比選擇

固-液萃取過程中物料與溶劑的比例對提取率有很大影響[13]。在DESs含水量為30%,提取溫度50 ℃下超聲30 min,改變料液比來測定料液比對大果沙棗中多酚和黃酮得率的影響。結(jié)果如圖4所示,當(dāng)料液比在一定范圍內(nèi),酚類化合物的得率隨溶劑量的上升而增大,可能是由于溶劑增多后,能更好地與原料相互作用,有助于更多的酚類化合物擴(kuò)散到溶劑中。隨著料液比進(jìn)一步增大到1：40,提取率無顯著性差異。原因可能為擴(kuò)散達(dá)到平衡,隨著料液比的增大,提取率幾乎沒有增加。為避免溶劑的浪費(fèi),故選擇1：40的料液比。

圖4 不同料液比對大果沙棗多酚和黃酮得率的影響Fig.4 Effects of of liquid-solid ratios on the yield of polyphenols and flavonoids of E.moorcroftii Wall.ex Schlecht.

2.1.5 最適DESs超聲時間選擇

多酚類化合物濃度達(dá)到平衡之前,延長萃取時間可以提高多酚類化合物的產(chǎn)率[14]。如圖5所示,在10～30 min,大果沙棗中多酚和黃酮得率呈增長態(tài)勢,再隨著超聲時間的延長,提取量雖略有上升,但差異并不顯著,可能是萃取過程非常接近固液平衡時,擴(kuò)散速度降低。因此,設(shè)置ChCl-蘋果酸摩爾比為1：1,料液比1：40,超聲溫度為50 ℃,選擇超聲時間為30 min為最適反應(yīng)時間。

圖5 不同超聲時間對大果沙棗多酚和黃酮得率的影響Fig.5 Effects of off ultrasonic time on the yield of polyphenols and flavonoids of E.moorcroftii Wall.ex Schlecht.

2.1.6 最適DESs超聲溫度選擇

提高萃取溫度可以降低DESs的密度、黏度和表面張力,從而使其更容易滲透到細(xì)胞中去提高酚類化合物得率[15]。在同一提取條件下(ChCl-蘋果酸摩爾比為1：1,1：40的料液比,超聲時間為30 min),不同超聲溫度對多酚和黃酮得率的影響如圖6所示。提取溫度在30～50 ℃內(nèi)增加時,多酚和黃酮得率呈上升趨勢,并且在50 ℃時達(dá)到最大值。而在此之后,隨著溫度的不斷升高,多酚和黃酮得率略有上升,但差異并不顯著。因此,選擇最佳的提取超聲溫度為50 ℃。

圖6 不同超聲溫度對大果沙棗多酚和黃酮得率的影響Fig.6 Effects of off ultrasonic temperature on the yield of polyphenols and flavonoids of E.moorcroftii Wall.ex Schlecht.

2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及方差分析

響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果如表3所示,響應(yīng)面結(jié)果方差分析如表4所示。利用Design-Expert分析軟件對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸方程擬合,得到各因素[A(含水率)、B(料液比)、C(超聲時間)、D(超聲溫度)]對多酚得率(YTPC)、黃酮得率(YTFC)、DPPH自由基清除能力(YDPPH)和ABTS陽離子自由基清除能力(YABTS)的二次多元回歸方程如下:

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Design and result Box-Behnken

表4 響應(yīng)面結(jié)果方差分析Table 4 Analysis of Box-Behnken

YTPC=-114.381 60-0.345 311×A+3.161 20×B+0.093 888×C+3.920 88×D+0.010 075×AB+0.007 112×AC+0.004 609×AD-0.008 405×BC-0.003 347×BD+0.008 937×CD-0.011 998×A2-0.031 741×B2-0.005 738×C2-0.038 246×D2;

YTFC=-111.535 340+0.278 845×A+0.536 704×B+0.695 315×C+4.042 55×D+0.007 827×AB+0.006 422×AC-0.007 631×AD-0.004 691×BC+0.008 004×BD-0.001 894×CD-0.010 113×A2-0.008 213×B2-0.009 06×C2-0.037 183×D2;

YDPPH=-104.281 36+0.567 028 9×A+1.765 60×B+0.644 188×C+2.990 54×D-0.000 803×AB-0.001 375×AC-0.007 568×AD-0.008 882×BC-0.007 993×BD+0.005 615×CD-0.003 037×A2-0.010 588×B2-0.008 038×C2-0.023 567×D2;

YABTS=-301.708 97+4.082 88×A+1.991 88×B+3.959 33×C+6.790 92×D-0.006 316×AB-0.031 6×AC-0.026 080×AD-0.024 104×BC+0.012 815×BD+0.001 316×CD-0.030 054×A2-0.010 728×B2-0.029 666 7×C2-0.056 843×D2。

通過分析29組數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)多酚類化合物得率和各抗氧化能力之間并無明顯線性關(guān)系,僅考察單一響應(yīng)值過于片面。因此,通過對多個響應(yīng)值考察,可全面討論多酚類化合物與各抗氧化活性的關(guān)系,并可有效篩選出具有高抗氧化活性且富含多酚類化合物的提取方法。

依據(jù)表4分析,4個因素模型P<0.000 1,說明該模型適合并具有顯著性;失擬項P>0.05不顯著,表明模型擬合度良好;總決定系數(shù)R2和模型調(diào)整系數(shù)Radj2均接近于1,表明實驗值與預(yù)測值具有高度的相關(guān)性,該模型相關(guān)度較好。從響應(yīng)面試驗結(jié)果中可以看出料液比(B)和超聲溫度(D)是影響4個響應(yīng)值最大的2個因素,超聲時間(C)和含水率(A)的影響相對較小。

2.2.2 驗證試驗結(jié)果分析

高多酚和黃酮得率是本次大果沙棗多酚類化合物提取研究的主要目標(biāo),抗氧化活性是評判酚類活性常用的一種指標(biāo),故本實驗提取工藝首先需保證較高得率的多酚和黃酮,其次還應(yīng)具有對DPPH自由基及ABTS陽離子自由基較高的清除能力,同時還要考慮能耗及對后續(xù)工藝的影響。通過對本實驗?zāi)Ｐ头治霰砻?經(jīng)過DesignExpert 13.0優(yōu)化后的最佳提取工藝為:含水率24.998%,料液比1：48.315(g：mL),超聲時間33.264 min,超聲溫度57.263 ℃,在此條件下,理論預(yù)計多酚得率63.947 mg/g、黃酮得率33.606 mg/g、DPPH自由基清除能力為36.447 mg TE/g、ABTS陽離子自由基清除能力為82.583 mg TE/g。在驗證實驗中,考慮實際條件,將操作工藝參數(shù)調(diào)整為含水率25%、料液比1：48(g：mL)、超聲時間34 min、超聲溫度57 ℃,做3組平行實驗。大果沙棗多酚得率為63.378 mg/g,黃酮得率為33.528 mg/g,DPPH自由基清除能力為35.004 mg TE/g,ABTS陽離子自由基清除能力為82.443 mg TE/g,與理論值分別相差0.89%、0.23%、3.96%、0.17%,說明該模型與實際擬合效果較好,在提高了活性成分得率的同時保證了抗氧化活性,適用于大果沙棗多酚類活性成分和抗氧化活性的同時提取,說明本模型有效。

2.2.3 不同提取方法對TPC、TFC得率及抗氧化活性影響的比較

用水、60%乙醇、80%甲醇和ChCl-蘋果酸分別提取,將多酚、黃酮得率和DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力、總抗氧化能力進(jìn)行比較。通過Pearson correlation test進(jìn)行相關(guān)性分析(圖7),結(jié)果表明,多酚得率、黃酮得率、DPPH自由基清除能力、ABTS陽離子自由基清除能力與總抗氧化能力之間具有正相關(guān)性關(guān)系,說明不同溶劑提取的大果沙棗中多酚、黃酮含量雖不同,但是都具有抗氧化活性。同時表明本研究所采用的提取方法在提高了活性成分得率的同時保證了抗氧化活性,適用于大果沙棗多酚類化合物的提取。

圖7 不同提取方法對大果沙棗活性成分與抗氧化能力相關(guān)性分析Fig.7 Correlation analysis of active components and antioxidant capacity by different extraction methods注:*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。

3 結(jié)論與討論

實驗采用超聲輔助DESs提取新疆大果沙棗中多酚類化合物。在單因素試驗的基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken設(shè)計方法,對新疆大果沙棗中多酚、黃酮得率和DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力同時進(jìn)行優(yōu)化。實驗得到最優(yōu)提取工藝參數(shù)為含水率25%、料液比1：48(g：mL)、超聲時間34 min、超聲溫度57 ℃,此條件下多酚得率為62.87 mg/g,黃酮得率為33.53 mg/g,DPPH自由基清除能力為34.27 mg TE/g,ABTS陽離子自由基清除能力為82.44 mg TE/g,與模型的預(yù)測值相近。通過Pearson correlation test 進(jìn)行相關(guān)性分析結(jié)果表明,多酚得率、黃酮得率、DPPH自由基清除能力、ABTS陽離子自由基清除能力與總抗氧化能力之間具有正相關(guān)性關(guān)系。從多酚類化合物得率、生物活性以及相關(guān)性分析3個角度分析,本研究所采用的提取方法在提高了多酚類化合物得率的同時保證了抗氧化活性,適用于后期對大果沙棗抗氧化活性的研究。

通過和傳統(tǒng)提取方法的比較,得到DESs ChCl-蘋果酸體系對大果沙棗多酚的提取得率比水提、60%醇提、80%甲醇提取的高8.75、6.72、6.05倍;黃酮得率比水提、60%醇提,80%甲醇提取的高49.73、11.59、9.92倍。通過與其他研究的比較,本研究提取的大果沙棗黃酮含量比凱迪日耶·玉蘇普等[16]提取的高5.67倍,比夏泆斌等[17]研究的4個不同地域的大果沙棗品種的多酚和黃酮提取含量也高出約11倍和6倍,說明本實驗采用的提取方法高效,將DESs應(yīng)用于大果沙棗多酚類化合物的提取具有較高的實用價值。

DESs作為一種新型的提取體系,具有綠色環(huán)保、可持續(xù)和低成本等優(yōu)點,大量研究表明,其提取有效成分的效率均高于傳統(tǒng)有機(jī)溶劑,故DESs在一定程度上能夠替代傳統(tǒng)有機(jī)溶劑[18],可應(yīng)用于功能性食品和制藥等領(lǐng)域,為新疆大果沙棗的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。