老山芹多糖的分離純化、結構表征及體外降糖活性研究

羨榮華,蒲鐸文,樊梓鸞,2,于承媛,劉永旭,季子琦,劉榮,2*

1(東北林業(yè)大學 林學院,黑龍江 哈爾濱,150040)2(黑龍江省森林食品資源利用重點實驗室,黑龍江 哈爾濱,150040)

老山芹(Heraclenmdissectum),學名東北牛防風,系傘形科牛防風屬多年生草本植物,主要分布于中東北部林區(qū)、華北、俄羅斯等地。老山芹作為一種東北優(yōu)質的含有豐富營養(yǎng)價值的藥食兩用山野菜,被認為是山林野菜中的“綠色黃金”[1]。已從老山芹中分離得到多種生物活性成分,包括多糖、黃酮、香豆素、皂苷等[2]。目前,對老山芹的研究主要集中在種植和栽培領域[3],對其化學成分和生物活性的報道較少。

植物多糖是一類重要的天然活性產物,具有廣泛的生物活性,如降血糖、抗氧化、抗腫瘤、抗炎、調節(jié)免疫、調節(jié)腸道菌群等[4]。天然多糖因其良好的生物活性、生物降解性、生物相容性和無毒性,成為目前國內外研究的焦點[5]。有研究表明老山芹中多糖含量可達到10%以上[6],然而關于老山芹多糖(Heraclenmdissectumpolysaccharides, HDP)結構和生物活性的進一步研究尚未見報道。

人體內的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶是糖代謝的關鍵酶,某些植物多糖通過抑制酶活性、減少葡萄糖吸收、增加葡萄糖代謝且增加胰島素的敏感性,近而發(fā)揮調節(jié)糖代謝的作用[7]。因此,通過抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性可以明顯延緩葡萄糖向血糖的轉化,達到降低血糖的效果[8]。本研究通過對老山芹分離純化、結構表征及體外降糖活性進行研究,為老山芹多糖進一步研究及開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

老山芹,黑龍江省嫩江農場;DEAE-cellulose 52、Sephadex G-100、纖維素酶、果膠酶、α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、對硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,PNPG),上海源葉生物科技有限公司;單糖標準品、溴化鉀,阿拉丁生化科技股份有限公司;其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

ELx800 NB型酶標儀,美國Bio Tek公司;RE-52旋轉蒸發(fā)器,上海亞榮生化儀器廠;Thermo ICS5000離子色譜系統(tǒng)、Nicolet IS5型傅里葉變換紅外光譜儀,美國賽默飛世爾科技公司;JSM-7500F型冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡,日本電子株式會社(JEOL);X射線衍射(X-ray diffraction,XRD)儀,荷蘭Panalytical公司;STA449F5型同步熱分析儀,德國耐馳。

1.3 實驗方法

1.3.1 HDP的提取

老山芹去除根部后,置于60 ℃烘箱烘干后粉碎備用。取10 g老山芹粉,加入400 mL超純水,pH值調節(jié)至5,50 ℃的水浴酶解[纖維素酶和果膠酶2%(質量分數(shù)),質量比1：1]1 h,微波功率450 W加熱12 min。離心濃縮,加入4倍體積的無水乙醇,醇沉24 h。利用Sevag法[V(氯仿)：V(正丁醇)=4：1]脫蛋白,離心去除沉淀,重復多次至無白色沉淀,透析72 h后凍干得HDP。

1.3.2 HDP的分離純化

取100 mg HDP溶于10 mL超純水,0.45 μm的水系濾膜過濾。用裝好的離子交換柱進行線性梯度洗脫,洗脫液為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的NaCl溶液,洗脫速率為1 mL/min,洗脫時間為4 min/管。采用苯酚-硫酸法[9]測定每管洗脫液的總糖含量,根據(jù)洗脫體積和OD值大小繪制洗脫曲線。收集不同組分濃縮、透析、冷凍干燥。根據(jù)結果篩選出超純水溶液的洗脫組分進行SephadexG-100柱洗脫,流速為0.4 mL/min,收集單一組分,濃縮冷凍干燥得HDP-1組分。

1.3.3 多糖分子質量測定

參照ZHU等[10]的方法采用高效凝膠滲透色譜法(high performance gel permeation chromatography,HPGPC)測定。

1.3.4 多糖的單糖組成分析

參照ZHANG等[11]的方法采用離子色譜法測定。

1.3.5 多糖紫外-可見光光譜(ultraviolet-visible spectroscopy,UV-VIS)和傅立葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)分析

可見分光光度計對純化多糖的純度進行鑒定,配制質量濃度為1 mg/mL的溶液,在波長為200～400 nm進行紫外光譜掃描,檢測是否含有蛋白質。

稱取2 mg干燥的多糖樣品和200 mg溴化鉀,混勻后研磨至細,壓成薄片后檢測。以溴化鉀為空白對照,在波數(shù)為4 000～500 cm-1進行紅外光譜掃描。

1.3.6 剛果紅試驗

根據(jù)XU等[12]的方法對多糖是否具有三股螺旋結構進行測定。

1.3.7 掃描電鏡分析

用導電膠將多糖粘在樣品臺上,在真空噴鍍儀內噴上金膜,掃描電子顯微鏡下觀察樣品表面形態(tài)。

1.3.8 XRD衍射分析

采用X射線衍射,衍射條件為:Cuk α衍射,管壓35 kV,管流100 mA,角度10°～70°,角度梯度0.02°。

1.3.9 多糖熱重分析

稱取樣品5 mg,放置坩堝中,使用熱重分析儀對其熱穩(wěn)定性進行測試。

1.3.10 老山芹多糖的體外降血糖活性測定

參考文獻[13]的方法進行修改測定。

α-淀粉酶抑制:將10 μL的α-淀粉酶(1 U/mL)溶液與20 μL多糖溶液混合,37 ℃下反應15 min。加500 μL的淀粉溶液(1%,質量分數(shù)),反應10 min,加入600 μL的DNS試劑,沸水浴加熱15 min。冷卻后,在540 nm處測定吸光度,阿卡波糖作對照。抑制率計算如公式(1)所示:

(1)

式中:A1,實驗組吸光值;A2,背景組吸光值;A0,對照組吸光值。

α-葡萄糖苷酶抑制:40 μL α-葡萄糖苷酶溶液(0.2 U/mL)添加到20 μL的樣品溶液中,37 ℃條件下,反應20 min后加入50 μL PBS(0.2 mol/L,pH值為6.9),40 μL PNPG(0.251 mg/mL),37 ℃條件下,反應20 min。加入140 μL Na2CO3溶液(2 mol/L)終止反應,405 nm下測定吸光度,阿卡波糖作對照,計算同公式(1)。

2 結果與分析

2.1 HDP的提取、分離和純化

經過提取、脫蛋白、透析凍干后得到的HDP,提取得率為10.28%。HDP經DEAE-cellulose 52離子交換柱分離,分別在水洗脫與梯度鹽洗脫部分得到4個峰,如圖1所示,分別命名為HDP-1、HDP-2、HDP-3、HDP-4。各組分所得多糖比率分別為84.27%、8.96%、4.72%、2.05%。由于HDP-2、HDP-3、HDP-4的峰值和峰面積較小即含量比較少,因此選取HDP-1為下一步分離對象,經Sephadex G-100凝膠柱純化,得到單一對稱的單峰組分,透析后濃縮凍干得純化多糖樣品HDP-1。苯酚-硫酸法測得的HDP-1總糖含量為83.27%。

分別對分子量100 kDa、30 kDa、10 kDa超濾膜超濾所得截留液以及濾過液進行蛋白質含量測定，結果顯示，10 kDa和30 kDa超濾膜對蛋白質的脫除率分別為70.81%和77.62%，100 kDa超濾膜對蛋白質的脫除率最高，達82.21%。隨著超濾膜分子量的增大，蛋白質去除率提高。這是由于實驗中用于超濾的靈芝子實體多糖溶液是經過纖維素酶和蛋白酶復合酶解靈芝子實體所得，因此較其他提取方法所得粗多糖溶液，酶解液中含有相對較多的游離小分子蛋白質。

a-DEAE-52 纖維素柱色譜法洗脫曲線;b-SephadexG-100 柱層析的洗脫曲線圖1 DEAE-52 纖維素柱色譜法洗脫曲線和SephadexG-100柱層析的洗脫曲線Fig.1 Elution curves of polysaccharides by 52 cellulose column chromatography and SephadexG-100 column chromatography

2.2 多糖分子質量測定

如圖2所示,HDP-1的出峰時間為17.142 min,存在單一對稱峰,多分散系數(shù)為1.202,表明HDP-1經分離純化后為均一多糖。通過糖分子質量標準曲線y=-0.413 2x+11.13計算,HDP-1的平均分子質量分別為11.141 kDa。HDP-1屬于低分子質量多糖,可能是由于提取時,酶的作用以及高溫的影響破壞了多糖的分子鏈,降解多糖使其分子間氫鍵斷裂從而導致多糖分子質量的降低[14]。有研究表明受提取方式的影響,一些多糖分子質量降低時,可能會使其水溶性增加,生物活性增強[15]。

圖2 HDP-1的分子質量分布Fig.2 HPGPC profile of molecular weight distribution of HDP-1

2.3 單糖組成分析

由圖3可知,HDP-1由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖、木糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸組成,摩爾比為5.96：1.95：1：1.03：1.02：0.29：0.31：0.12。由于HDP未有報道,與老山芹同屬的傘形科白芷多糖的研究表明[16],白芷多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖等7種單糖組成,摩爾組成比例為1.19：1.19：0.765：1：8.08：3.34,與本文分離純化得到的單糖種類及占比類似,葡萄糖和半乳糖占比最高。

圖3 單糖標準品和HDP-1單糖組成的離子色譜圖Fig.3 Ion chromatogram of standards and HPD-1注:Fuc:巖藻糖;Rha:鼠李糖;Ara:阿拉伯糖;Gal:半乳糖;Glc:葡萄糖;Xyl:木糖;Man:甘露糖;Fru:果糖;Rib:核糖;Gal-ua:半乳糖醛酸;Gul-ua:古羅糖醛酸;Glc-ua:葡萄糖醛酸;Man-ua:甘露糖醛酸。

2.4 多糖紫外可見光譜和紅外光譜分析

紫外可見光譜結果見圖4-a,HDP-1在260 nm和280 nm波長處均無明顯特征吸收,說明多糖中不含有蛋白質和核酸[17]。

a-HDP-1紫外-可見光光譜分析;b-HDP-1紅外光譜分析圖4 HDP-1 的紫外-可見光光譜和紅外光譜分析Fig.4 UV spectra and FI-IR spectra of HDP-1

2.5 剛果紅試驗

如圖5所示,在NaOH作用下,HDP-1與剛果紅絡合物沒有紅移現(xiàn)象,表明HDP-1不具備三螺旋結構[21]。多糖的三螺旋結構與分子質量及單糖組成有關,小分子質量的多糖一般為單股螺旋結構,且雜多糖一般不會形成三螺旋結構[22]。這與前文分子質量及單糖組成得到的結論相互驗證。

圖5 HDP-1剛果紅實驗結果Fig.5 Results of Congo red with HDP-1

2.6 掃描電鏡分析

圖6為分別使用不同放大倍數(shù)的HDP-1的表觀形貌。從圖中可以看出在低倍鏡下多糖表面粗糙呈片狀,內部成分復雜聚集,HDP-1組分純度高,未見雜質;在高倍鏡下可以看到有細小不均勻的顆粒排列緊湊,相互堆積為表面較為緊實的結構,中心有貫穿的孔洞。多糖粗糙的表面結構使其更易與水結合,提高其溶解性[23]。多糖組分中單糖組成的差異也可能對多糖表面粗糙程度產生影響[24]。而其多孔結構可能是微波的熱效應短時間升高其內部溫度,使結構變得膨脹所導致。

圖6 HDP-1的掃描電鏡圖Fig.6 SEM image of HDP-1

2.7 XRD衍射分析

多糖的結晶結構直接影響物理性質,包括溶解度、溶脹度、黏度或不透明性[25]。通過測定XRD圖譜(圖7),顯示在20°左右,HDP-1有一個較為明顯的大小不同的衍射峰,其峰形圓鈍,峰強度較低,因此HDP-1結晶度較低,主要以非定型的結晶態(tài)存在。曾凡珂等[26]報道的荸薺皮多糖的XRD圖譜衍射峰主要集中在2θ為20°～30°,峰形與HDP接近,結晶程度低,溶解性和生物利用度較好。

圖7 HDP-1的X射線衍射圖Fig.7 XRD patterns of HDP-1

2.8 多糖熱重分析

由TG曲線(當前溫度下樣品質量與初始質量之比)和DTG曲線(將TG曲線上的各點相對于時間坐標進行一次微分)分析結果(圖8)可知,HDP-1組分在20～240 ℃失重16.79%,在這個階段,在81.93 ℃處有一個明顯的熱損失峰值,同時在202.55 ℃處開始出現(xiàn)一個較平緩的吸熱峰,推測是多糖分子脫水引起的,這與前文的紅外光譜結果中分析的HDP-1在1 598 cm-1處有結合水特征吸收峰的結果一致;HDP-1組分在240～600 ℃失重29.54%,在281.21 ℃時有吸收峰,并陡然增強,這可能是多糖化學降解和熱分解造成的吸熱峰,包括糖環(huán)的脫水和解聚以及水和二氧化碳的形成[27]。根據(jù)上述實驗結果可以發(fā)現(xiàn),HDP-1有著較好的熱穩(wěn)定性。

圖8 HDP-1熱重分析圖Fig.8 Thermogravimetric analysis of OPS

2.9 體外降血糖活性測定

如圖9所示,HDP對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用呈劑量依賴性,均低于陽性對照組(阿卡波糖)的抑制能力。由圖9-a可知,當質量濃度為1.25 mg/mL時,HDP-1對α-淀粉酶的抑制率為62.11%;當質量濃度為10 mg/mL,抑制率達到88.73%。由圖9-b可知,HDP-1抑制α-葡萄糖苷酶的作用稍弱于α-淀粉酶。當質量濃度為10 mg/mL時,HDP-1對α-葡萄糖苷酶抑制率為73.25%。當質量濃度為15 mg/mL時,抑制率達90.95%。經回歸方程計算HDP-1對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶IC50值分別為0.765和3.288 mg/mL,以上數(shù)據(jù)證明老山芹多糖對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶有較強的抑制能力。

a-α-淀粉酶抑制作用;b-α-葡萄糖苷酶抑制作用圖9 老山芹多糖對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制作用Fig.9 α-amylase activity α-glucosidase activity of HDP-1

研究表明,葡萄糖和半乳糖含量高的多糖具有較強的抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性[28]。分子質量、單糖組成、空間構象等因素均會影響多糖的生物活性。大部分具有降血糖活性的多糖都具有葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖,還有少部分具有半乳糖醛酸、鼠李糖和巖藻糖,多糖中個別單糖的存在或缺失會影響其降血糖活性[29]。因此,HDP-1其單糖組成種類豐富可能是決定其有良好降血糖活性的原因。此外,低分子質量的多糖通過抑制腸道內碳水化合物的降解進而抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性[30]。因此,推測HDP-1的良好降血糖活性可能也與其分子質量較低有關。

3 結論

采用微波輔助酶法提取得到老山粗多糖HDP,經DEAE-cellulose 52和Sephadex G-100柱分離純化得到組分HDP-1。結果表明,HDP-1是一種相對分子質量為11.141 kDa的均一多糖,總糖含量為83.27%,不含核酸和蛋白質。單糖組成分析表明HDP-1是由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖、木糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸組成的雜多糖,摩爾比為5.96：1.95：1：1.03：1.02：0.29：0.31：0.12。HDP-1具有多糖的特征吸收基團,主要以β構型的吡喃糖苷存在且不具有三螺旋結構。掃描電鏡下HDP-1呈球狀或柱狀的結構。XRD衍射光譜及熱重分析結果顯示,HDP-1主要以非定型的結晶狀態(tài)存在且具有較好的熱穩(wěn)定性。HDP-1對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的半數(shù)抑制濃度(IC50值)為0.765、3.288 mg/mL,具有較好的體外降糖活性,證明了老山芹多糖的潛在藥理價值。

本研究為進一步探討老山芹多糖降血糖活性與結構的關系提供數(shù)據(jù)支持,同時也為天然植物多糖在醫(yī)藥和功能食品中的應用提供理論依據(jù)。