ICP-MS法分析不同采收時期何首烏微量元素的動態(tài)變化

吳進(jìn)軒范偉兵安子龍馬恩耀王永福

(1.廣州采芝林藥業(yè)有限公司，廣東 廣州 510000；2.甘肅廣藥白云山中藥科技有限公司，甘肅 定西 743000)

前言

何首烏[1]是我國中醫(yī)臨床中常用名藥，作為一個傳統(tǒng)的大宗藥材，應(yīng)用廣泛，化學(xué)成分較為復(fù)雜?，F(xiàn)代有相關(guān)研究顯示，何首烏對高脂血癥、動脈粥樣硬化等疾病有一定的治療效果，同時還有抗氧化、抗腫瘤的作用，是臨床上滋補(bǔ)肝腎的中藥。何首烏中存在二苯乙烯苷類化合物、總多糖、游離蒽醌和結(jié)合蒽醌等多種有效結(jié)構(gòu)，因此何首烏具有抗氧化作用，抗動脈粥樣硬化作用，免疫調(diào)節(jié)作用，此外，何首烏及其所含的活性成分還有抗炎、抗菌及腦血管保護(hù)作用。人體內(nèi)含有許多對人體具有重要影響作用的微量元素。微量元素就是占據(jù)人體總重量的萬分之一及以下的元素，目前公認(rèn)有13種微量元素對動物生命是不可缺少的[4]，這些微量元素對人體有重要的生理作用。對酶系統(tǒng)、激素作用及核酸代謝有重要的影響。微量元素可被許多種方法測定出來，由于傳統(tǒng)的金屬元素分析方法樣品前處理較復(fù)雜，靈敏度較低，且不能同時測定多種元素，因此其應(yīng)用受限。本文采用ICP-MS法，采用正交實(shí)驗(yàn)方法測定，對不同采收時期何首烏微量元素含量的動態(tài)變化進(jìn)行測定。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HCKJ2021-A014電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，安捷倫；HCKJ2021-C163 400克搖擺式高速粉碎機(jī)，溫嶺市大機(jī)械有限公司；HCKJ2021-A00高效液相色譜儀，廣州紫安科技有限公司；HCKJ2021-B027醫(yī)用離心機(jī)，山東百歐；HCKJ2021-B001電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠；HCKJ2021-B004微波消解儀，安東帕；HCKJ2021-B020百萬分之一分析天平；HCKJ 2021-C003藥典篩，浙江上虞市道墟五四儀器沙篩廠；HCKJ2021-B047恒溫水浴鍋，上海勝衛(wèi)電子科技有限公司；HCKJ2021-C004漩渦混合器，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；HCKJ2021-C012超純水機(jī)，賽多利斯。

1.2 試劑和樣品

硝酸，過氧化氫，單元素對照溶液Al(GSB0417132 004)、K(GSB0417332004)、Ca(GSB0417202004)、Fe(GSB0417262004)、Zn(GSB0417612004)。

1.3 樣品處理及制備

1.3.1 樣品處理

將不同生長期的何首烏樣品置于50～60℃的環(huán)境下烘干、粉碎，后過四號篩(65目)并密封避光保存，備用。

1.3.2 供試品溶液制備

精密稱量已過篩何首烏樣品粉末約0.2000g后置于氟乙烯消解罐內(nèi)，精密量取7mL濃硝酸并加入，蓋好內(nèi)蓋后放置于微波消解儀中，將消解程序設(shè)置為190℃、20min，進(jìn)行消解。完成消解后，拿出消解罐并放置于加熱板上，將溫度設(shè)置為100℃，加熱30min到紅棕色蒸汽揮盡。取出，放冷，將消解后的溶液移入25mL的容量瓶中，并用超純水進(jìn)行少量多次去洗滌消解罐，將洗滌液合并入容量瓶中后用超純水定容，搖均勻，密封待測?？瞻兹芤旱闹苽渫鲜霾僮?。高效液相色譜含量測定及樣品處理方法同2020年版《中國藥典》規(guī)定。

1.3.3 對照品溶液的制備

精密吸取Mg、Al、K、Ca、Fe、Cu、Zn 7種元素的單元素對照品溶液，并用2%的硝酸溶液進(jìn)行稀釋，稀釋后的濃度為1000ppm的混合對照品儲備液。采用逐級稀釋法制備質(zhì)量濃度為2ppb、5ppb、10ppb、20ppb、50ppb、100ppb、200ppb、500ppb、1000ppb、2000ppb、5000ppb的系列混合對照品溶液。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法性考察

2.1.1 線性關(guān)系及檢出限

采用5%稀硝酸將K、Cu、Mg、Fe、Zn、Ca、Mn 7種元素對照溶液逐級稀釋[5]，空白為5%稀硝酸溶液，繪制各元素線性方程。單元素的同濃度溶液連續(xù)進(jìn)行進(jìn)樣11次，并參照IUPAC的國際標(biāo)準(zhǔn)展開檢出限的實(shí)驗(yàn)測定，結(jié)果顯示，7種元素的r在0.9978～1范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系，線性方程及檢出限結(jié)果見表1。

表1 何首烏線性方程、線性范圍和檢出限

表2 正交設(shè)計方案

2.1.2 精密度

精密吸取濃度為100ppb的混合對照品溶液[6]，按1.3連續(xù)進(jìn)樣6次，測得上述7種微量元素濃度RSD值為0.98%～4.99%，表明儀器精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取經(jīng)過1.3提取的何首烏樣品溶液[7]，分別放置于0h、2h、4h、6h、8h進(jìn)樣測定，測得上述7種微量元素濃度RSD值為1.37%～4.67%，表明樣品在8h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn)

從同一份何首烏樣品中精密稱取0.2000g樣品6份，按照1.3制備供試品溶液，測得7種元素的RSD值為1.27%～4.95%，說明方法重復(fù)性良好。

2.2 消解方法的建立

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

何首烏的消解參數(shù)包括混酸比、消解時間、消解溫度，在實(shí)驗(yàn)過程當(dāng)中保持其他參數(shù)一定，調(diào)節(jié)某一影響因素，通過對比微量元素總含量的多少選擇最佳的消解條件[8]。

2.2.1.1 混酸比單因素實(shí)驗(yàn)

在何首烏樣品中依次加入7mL、6mL、5mL、4mL、3mL、2mL、1mL濃硝酸并用過氧化氫補(bǔ)足至7mL，微波消解程序?yàn)?60℃，10min，操作方法同1.3，進(jìn)行測定，得出實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為如圖1所示。

圖1 混酸比對微波消解法提取何首烏微量元素含量的影響

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，在消解程序?yàn)?60℃、10min的條件下，加入7mL的硝酸，測得的微量元素含量最高。

2.2.1.2 消解時間單因素實(shí)驗(yàn)

將消解時間分別設(shè)置為10min、15min、20min、25min、30min，混酸比為1∶1，溫度為160℃，其他操作方法同上述操作，進(jìn)行測定，得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 時間對微波消解法提取何首烏微量元素含量的影響

從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，設(shè)定其他條件不變，時間為20min時，測出的微量元素含量最高。

2.2.1.3 消解溫度單因素實(shí)驗(yàn)

將消解溫度分別設(shè)置為160℃、170℃、180℃、190℃、200℃，混酸比為1∶1，消解時間為10min，其他操作方法同上述操作，進(jìn)行測定，得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 溫度對微波消解法提取何首烏微量元素含量的影響

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，在其他條件不變的情況下，溫度為190℃時，測出的微量元素含量最高。

2.2.2 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)已有的理論和實(shí)驗(yàn)分析，影響微波消解法提取何首烏內(nèi)的微量元素的含量的因素主要有混酸比、溫度及消解時間。適當(dāng)提高消解溫度對微量元素提取有促進(jìn)作用，但溫度太高時，微量元素提取含量將減少；消解時間太長或者太短都會導(dǎo)致微量元素提取含量過低，加入硝酸含量為7mL進(jìn)行消解時，微量元素提取含量較高。因此為了研究3種因素對微波消解法提取何首烏微量元素含量高低的影響大小，設(shè)計正交實(shí)驗(yàn)。

2.2.2.1 實(shí)驗(yàn)方案

以混酸比、消解溫度、消解時間為考察因素，用L9(34)正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)[9]。

2.2.2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)上述正交設(shè)計方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，比較均值，何首烏的最佳消解環(huán)境為7mL硝酸、190℃、20min。

2.2.3 顯著性差異實(shí)驗(yàn)

根據(jù)上述正交設(shè)計方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4 顯著性差異實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，根據(jù)方差分析，消解時間對微波消解何首烏提取微量元素有顯著性影響。

2.2.4 數(shù)據(jù)分析

不同的采收時期，何首烏的微量元素含量不同。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Mg、Al、K、Ca、Fe、Zn、Cu微量元素呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 樣品微量元素含量

從圖4可以看出[10]，Mg、Al、K、Ca、Fe、Zn、Cu 7種微量元素均呈現(xiàn)先升后降的趨勢，在種植第521天微量元素含量達(dá)到最高值。其中，7種微量元素的含量大小排列順序?yàn)镵>Ca>Mg>Al>Fe>Zn>Cu，何首烏內(nèi)的K元素含量最高，這是因?yàn)镵是植物生長過程中不可或缺的元素之一，植物體內(nèi)的K能做60多種酶的活化劑，可以促進(jìn)何首烏的光合作用，促進(jìn)糖代謝等多種化學(xué)反應(yīng)，還可以促進(jìn)氮的吸收和蛋白質(zhì)的合成等，因此何首烏對K的需求非常大，含量高；Mg先升后降的幅度較大，且7種元素在種植第521天(10月)出現(xiàn)高峰，這可能與何首烏生理活動旺盛、酶化反應(yīng)強(qiáng)烈有關(guān)。K、Zn的變化趨勢較平穩(wěn)，上升跟下降的趨勢變化幅度不大，說明何首烏對K、Zn的吸收較穩(wěn)定。

據(jù)其他文獻(xiàn)[11]，不同產(chǎn)區(qū)的何首烏采收期略有不同，不同采收時期何首烏的微量元素含量也存在一定的差異，在種植第521天微量元素含量出現(xiàn)一個峰值，但上升和下降的趨勢不盡一致。據(jù)中國藥典記載，何首烏最佳采收期為10月，而微量元素含量也在10月出現(xiàn)峰值，這與藥典上記載的最佳采收期一致，符合藥典所述；Mg、Al、K、Ca、Fe、Zn、Cu 7種微量元素在種植的第521天的含量較高。Fe、Cu、Zn是機(jī)體多種酶的活性中心[13]，與機(jī)體的免疫功能有密切關(guān)系。如體內(nèi)缺乏Zn，人體的免疫系統(tǒng)將會受到損害，使得機(jī)體免疫的應(yīng)答、發(fā)生和發(fā)展能力降低；抗感染、抗腫瘤的能力也降低；缺Fe不僅會引起貧血，還會使免疫功能和細(xì)胞的吞噬功能受到損害；Cu是影響機(jī)體免疫功能的微量元素之一；Ca、Mg也是高等植物體內(nèi)所必需的微量元素[12]，對植物體的生長發(fā)育具有重要作用；K元素在治療心血管疾病，促進(jìn)血液循環(huán)，造血活血抗動脈粥樣硬化具有顯著療效；何首烏具有補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨的作用。其藥理作用由有機(jī)有效成分發(fā)揮效用外，可能與Fe、Cu、Zn元素含量較高有關(guān)，這些微量元素參與入體調(diào)節(jié)機(jī)體平衡，增強(qiáng)人體免疫功能。

3 討論

本研究通過電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)探討不同采收時期何首烏微量元素的動態(tài)變化，進(jìn)行方法性考察，結(jié)果證明，生長時期與微量元素的含量間關(guān)系密切，是影響藥材質(zhì)量的重要因素；何首烏中微量元素的動態(tài)變化，為藥材質(zhì)量提供保障。此研究揭示了何首烏在不同時期微量元素含量動態(tài)變化規(guī)律，為何首烏種植、采收及加工提供一定依據(jù)；中藥材有效成分的含量高低、質(zhì)量好壞不僅與藥材自身、季節(jié)變化或海拔氣候有關(guān)系，還與施肥、土壤含水量等外部環(huán)境影響因素有關(guān)。是否可以利用微量元素的外源性刺激影響何首烏有效成分的含量，進(jìn)而提高藥材產(chǎn)量，有待進(jìn)一步研究。