肺癌外周血MMP-7mRNA與腫瘤免疫微環(huán)境特征的相關(guān)性研究*

梁 晶,陳立軍,于津生,李加麗,鄧為民,王海龍

天津市濱海新區(qū)大港醫(yī)院腫瘤科,天津 300270

根據(jù)2020年全球癌癥報(bào)告,肺癌的發(fā)病率僅次于乳腺癌,是世界上最常見的癌癥死亡原因[1]。我國肺癌的發(fā)病率、病死率仍居所有惡性腫瘤第一位,大約90%肺癌死亡是由于肺癌轉(zhuǎn)移[2]。腫瘤細(xì)胞內(nèi)在基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)的改變決定了肺癌特質(zhì),而腫瘤微環(huán)境的改變也顯著影響著肺癌的發(fā)生、發(fā)展,腫瘤基質(zhì)細(xì)胞在肺癌侵襲、轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)過程中每一個(gè)環(huán)節(jié)都有參與[3]。腫瘤基質(zhì)細(xì)胞如腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞與腫瘤免疫微環(huán)境相關(guān)性成為近年來的研究熱點(diǎn)之一。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞被腫瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子激活,誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)。基質(zhì)金屬蛋白酶-7(MMP-7)是MMPs家族中相對分子質(zhì)量最小的分泌型蛋白,它可以:(1)通過降解內(nèi)皮基底膜和細(xì)胞外基質(zhì),減少細(xì)胞間黏附;(2)通過促進(jìn)血管生長因子的分泌,誘導(dǎo)血管生成;(3)通過裂解 proMMP-2及proMMP-9以活化MMP-2、MMP-9;(4)通過促進(jìn)細(xì)胞生長及抑制凋亡等途徑促進(jìn)肺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移[4]。另有研究證實(shí)MMP-7和熱休克蛋白90在調(diào)節(jié)獲得性耐藥和腫瘤進(jìn)展中相互作用[5]。但關(guān)于MMP-7對肺癌免疫微環(huán)境的影響還少見報(bào)道。本文通過檢測肺癌患者外周血MMP-7 mRNA水平,分析其與各類免疫細(xì)胞亞群的相關(guān)性,旨在為MMP-7 促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的機(jī)制研究提供新的思路,為肺癌免疫治療尋求新靶點(diǎn)和方向。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年5月至2022年12月本院收治的125例確診為肺癌的患者作為肺癌組。納入標(biāo)準(zhǔn):全部病例均具有完整的臨床、影像學(xué)資料;經(jīng)病理或細(xì)胞學(xué)檢查證實(shí)且首次入院;未接受過任何相關(guān)治療。排除標(biāo)準(zhǔn):轉(zhuǎn)移到肺部的其他腫瘤患者;伴有精神類疾病患者;伴有高血壓、冠心病等心腦血管疾病,免疫系統(tǒng)疾病,糖尿病、腎功能不全引起的相關(guān)疾病等。另外收集同期在本院體檢的70例健康人作為對照組。兩組的年齡和性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。本研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 兩組一般資料比較

1.2試劑與儀器 Trizol、Quantscript RT Kit Quant cDNA第一鏈合成試劑盒、Real Master Mix(SYBR Gree公司)試劑盒(天根生物科技有限公司)。所有引物由上海基康生物技術(shù)有限公司合成。兔抗人CD3-PerCP、兔抗人CD4-FITC、兔抗人CD8-PE、兔抗人CD19-PE、小鼠抗人CD56-FITC、小鼠抗人NKG2D-PE,均購自美國BD公司;FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司),ABI PRISM7000熒光定量PCR分析儀(美國Applied Biosystems公司),BioPhotometer Plus核酸蛋白測定儀(德國Eppendorf公司),全自動(dòng)酶標(biāo)儀(奧地利Biocell公司)。

1.3方法

1.3.1外周血T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞受體NKG2D檢測 B細(xì)胞檢查采用雙色免疫熒光染色(CD3-FITC/CD19-PE)。CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞受體NKG2D檢查采用三色免疫熒光染色(CD3-PerCP/CD4-FITC/CD8-PE,CD3-PerCP/CD56-FITC/NKG2D-PE)。根據(jù)說明書,取20 μL熒光標(biāo)記的單克隆抗體加入EP管,設(shè)相應(yīng)的同型對照,然后加入乙二胺四乙酸(EDTA)鉀鹽抗凝全血100 μL,混勻,孵育,沖洗。加入1 000 μL裂解液,孵育,沖洗,樣品上機(jī)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞及NKG2D比例。

1.3.2外周血MMP-7 mRNA的檢測 標(biāo)本的采集及RNA提取:用EDTA抗凝真空采血管采集研究對象空腹外周靜脈血3 mL。分離淋巴細(xì)胞,吸取淋巴細(xì)胞懸液置于1.5 mL無菌EP管中,清洗,離心去上清液,用Trizol法提取總RNA。

cDNA的合成:在20 μL反應(yīng)體系中取2 μL/g總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。該反應(yīng)體系組成如下:10×RTmix 2 μL,oligo(dT)15 2 μL,dNTP 2 μL,RNA 2 μg,Quant Reverse Transcripase 1 μL,最后加入DEPC處理水補(bǔ)至20 μL。37 ℃溫育60 min,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增與檢測:PCR反應(yīng)體系為25 μL,以無菌純H2O代替DNA模板作為陰性對照。PCR反應(yīng)體系包括:上、下游引物(10 μmol/L)各1.25 μL,2.5×RealMaster Mix/20×SYBR solution 11.25 μL,模板5 μL,其余用無菌去離子液補(bǔ)足。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃ 45 s,60 ℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán),在ABI PRISM7000熒光定量PCR分析儀上進(jìn)行反應(yīng)。MMP-7 基因及內(nèi)參引物序列見表2。

表2 MMP-7 基因及內(nèi)參引物序列

2 結(jié) 果

2.1兩組外周血MMP-7 mRNA水平比較 肺癌組外周血MMP-7 mRNA水平為36.420±11.339,高于對照組的14.631±4.858,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2不同臨床資料肺癌患者外周血MMP-7 mRNA水平比較 不同性別、病理分型、分化程度的肺癌患者外周血MMP-7 mRNA水平比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不同臨床分期的肺癌患者外周血MMP-7 mRNA水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中ⅢB期、Ⅳ期肺癌患者外周血MMP-7 mRNA水平均高于Ⅰ～ⅢA期(P<0.05),ⅢB期與Ⅳ期肺癌患者外周血MMP-7 mRNA水平比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同臨床資料肺癌患者外周血MMP-7mRNA水平比較

2.3兩組外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、NKG2D比例比較 與對照組相比,肺癌組外周血CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞、NKG2D比例均明顯降低(P<0.05),CD8+T細(xì)胞比例明顯升高(P<0.05)。見表4。

表4 兩組外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、NKG2D比例比較

2.4肺癌患者外周血MMP-7 mRNA水平與CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、NKG2D比例的相關(guān)性分析肺癌患者外周血MMP-7 mRNA水平與CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞、NKG2D比例呈負(fù)相關(guān)(r=-0.190、-0.237、-0.329,P<0.05),與CD8+T細(xì)胞比例呈正相關(guān)(r=0.230,P<0.05)。見圖1。

注:A表示MMP-7 mRNA與CD4+T細(xì)胞的相關(guān)性;B表示MMP-7 mRNA與CD8+T細(xì)胞的相關(guān)性;C表示MMP-7 mRNA與B細(xì)胞的相關(guān)性;D表示MMP-7 mRNA與NKG2D的相關(guān)性。圖1 肺癌患者外周血MMP-7mRNA水平與CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、NKG2D比例的相關(guān)性散點(diǎn)圖

3 討 論

腫瘤微環(huán)境包括腫瘤細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、微血管,以及浸潤其中的信號(hào)分子[6]。肺癌微環(huán)境中免疫細(xì)胞的功能及其信號(hào)交流與腫瘤微環(huán)境有關(guān)時(shí),被稱為肺癌免疫微環(huán)境[7]。MMPs是維持肺癌細(xì)胞外基質(zhì)平衡最重要的一類蛋白水解酶,目前人類有23種 MMPs 家族成員,其中MMP-7(基質(zhì)溶解素)的編碼基因定位于人 11q21～q22,其 cDNA 長 1 094 bp,由 267個(gè)氨基酸、4個(gè) MMPs 特征區(qū)域組成,基質(zhì)中的蛋白多糖和糖蛋白是其發(fā)揮作用的主要底物,因MMP-7缺乏c端血紅蛋白結(jié)構(gòu)域,結(jié)構(gòu)精簡,能夠特異性識(shí)別底物的結(jié)構(gòu)部分很少,所以MMP-7能夠降解幾乎所有的細(xì)胞外基質(zhì)[8]。另有研究表明,MMP-7通過切割細(xì)胞生長因子、細(xì)胞表面受體、細(xì)胞黏附分子等途徑,改變腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為,同時(shí),被切割掉的這些因子可以誘導(dǎo) MMP-7 調(diào)節(jié)抗凋亡細(xì)胞的產(chǎn)生,反過來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞繁殖,使腫瘤具有更強(qiáng)的侵襲性[9]。有研究證實(shí)MMP-7高表達(dá)于肺癌上皮組織[4]。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR對肺癌患者外周血MMP-7 mRNA進(jìn)行定量檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn):肺癌患者外周血MMP-7 mRNA水平升高,ⅢB期、Ⅳ期肺癌患者外周血MMP-7 mRNA水平明顯高于Ⅰ～ⅢA期,間接證明MMP-7在肺癌侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮的作用及潛在的臨床意義。提示外周血MMP-7 mRNA可作為肺癌診斷和預(yù)后判斷的腫瘤標(biāo)志物,MMP-7有望成為肺癌治療的新靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示:與對照組相比,肺癌組外周血CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞、NKG2D比例明顯降低(P<0.05),CD8+T細(xì)胞比例明顯升高(P<0.05),提示肺癌微環(huán)境處于免疫抑制狀態(tài)。有研究發(fā)現(xiàn),黑色素瘤中的腫瘤相關(guān)性成纖維細(xì)胞中MMPs、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-10、血管內(nèi)皮生長因子和細(xì)胞程序性死亡-配體1在低氧條件下表達(dá)和分泌增加,而這些蛋白質(zhì)組學(xué)的變化加強(qiáng)了腫瘤相關(guān)性成纖維細(xì)胞對T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷的抑制作用[10]。由于MMPs家族的蛋白酶活性使NKG2D從癌細(xì)胞表面脫落產(chǎn)生可溶性NKG2D,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞表面NKG2D下調(diào),介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸[11]。MMP-7會(huì)讓syndecan-1/CXCL1蛋白質(zhì)復(fù)合體脫落,脫落的 CXCL1會(huì)趨化并活化腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞,從而產(chǎn)生免疫抑制微環(huán)境[12]。本研究結(jié)果顯示:肺癌患者外周血MMP-7 mRNA水平與CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞、NKG2D比例呈負(fù)相關(guān),與CD8+T細(xì)胞比例呈正相關(guān)。這間接提示MMP-7可能調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的表達(dá),與肺癌免疫微環(huán)境相關(guān),與以往研究結(jié)論一致。說明MMP-7不但具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的功能,為腫瘤侵襲鋪平道路,而且MMP-7還調(diào)節(jié)與炎癥、血管生成、細(xì)胞增殖、凋亡和遷移有關(guān)的幾種癌癥信號(hào)傳導(dǎo)途徑,具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)能力,參與介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸。另有基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn),cMMP-7 DNA疫苗免疫在BALB/c小鼠中誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞和Th1型反應(yīng),并產(chǎn)生高水平的γ-干擾素[13]。這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)從另一個(gè)角度也證實(shí)了MMP-7與腫瘤免疫相關(guān)。另有研究表明,許多生長因子、細(xì)胞因子如IL-6、TGF-β、β-干擾素可調(diào)節(jié)MMPs的表達(dá),這些生長因子、細(xì)胞因子與免疫細(xì)胞也交互聯(lián)系,因此免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的募集、激活、重新編程是腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞相互調(diào)控和交流的結(jié)果[14],結(jié)合本研究結(jié)果,推斷免疫細(xì)胞可能通過細(xì)胞因子傳遞信息或者間接激活MMP-7相關(guān)信號(hào)通路促進(jìn)其表達(dá)。

綜上所述,本研究證實(shí)了肺癌患者存在腫瘤免疫抑制微環(huán)境特征,發(fā)現(xiàn)MMP-7 mRNA可能參與肺癌免疫微環(huán)境的形成,同時(shí)肺癌免疫抑制微環(huán)境也可能激活了MMP-7 mRNA的表達(dá),為MMP-7促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究提供了新方向,MMP-7有望成為肺癌免疫治療的新靶點(diǎn)。