腫瘤相關中性粒細胞的雙向調(diào)控作用及其在膀胱尿路上皮癌中的研究進展

鄧凱 楊萌 張琳 錢俊安 史云強 王春暉，2

1昆明醫(yī)科大學附屬延安醫(yī)院泌尿外科（昆明 650000）；2云南省腫瘤免疫防治研究重點實驗室（昆明 650000）

中性粒細胞在抵御微生物感染及創(chuàng)傷后的炎癥損傷過程中發(fā)揮重要作用［1-2］。但在腫瘤進展過程中，腫瘤相關中性粒細胞（tumor-associated neutrophils，TAN）被認為是一個“旁觀者”或“中立派”。而近年來的研究表明TAN 并不是真正的“中立”，相反，TAN 可以通過多種途徑抑制或促進腫瘤進展，這種雙向調(diào)控源于TAN 高度的異質(zhì)性和可塑性。因其可塑性，TAN 在發(fā)育、分化、募集的過程中被誘導極化為許多異質(zhì)性亞群，表現(xiàn)出不同的功能表型，即TAN 的可塑性和異質(zhì)性是其發(fā)揮雙向調(diào)控作用的基礎。通過操縱TAN 在腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中的浸潤水平或其功能表型，有望為目前的腫瘤治療帶來全新的靶點和思路，但由于其異質(zhì)性，在討論TAN 的抑瘤或促瘤作用時，須考慮到具體的腫瘤類型甚至是臨床分期的不同。

1 TAN 的異質(zhì)性和可塑性

TAN來源于骨髓，是人體內(nèi)數(shù)量最多的免疫細胞，具有壽命短和更新快的特點，造血干細胞逐步發(fā)育分化為粒細胞-單核細胞祖細胞（granulocytemonocyte progenitors，GMPs）后，在G-CSF及GM-CSF的誘導下，逐步分化成熟。

TAN 發(fā)育成熟后大部分仍繼續(xù)留在骨髓，其釋放受到嚴格的調(diào)控。趨化因子受體CXCR4 和CXCR2 及其配體決定了TAN 進入血液循環(huán)的數(shù)量。其中，CXCR4與CXCL12促使TAN 繼續(xù)保留在骨髓，CXCR2、CXCL1、CXCL2 促使TAN 進入血液循環(huán)當中。G-CSF 通過誘導增加CXCL1、CXCL2或減少CXCL12、 CXCR4 的表達，促進TAN 進入循環(huán)，快速升高血液中粒細胞水平。腫瘤細胞也可分泌G-CSF，因此腫瘤患者循環(huán)中未成熟TAN 的比例較正常人明顯升高。TAN 與各組織的親和程度也不同，以上各種因素共同作用導致了TAN 在發(fā)育階段以及分布空間上的異質(zhì)性。

目前關于TAN 亞群的分型尚無特異性的標記分子，常以TAN 亞群表現(xiàn)出的功能表型作為分型依據(jù)，將發(fā)揮抗腫瘤作用或炎性反應的TAN 稱為N1 型，將發(fā)揮促腫瘤作用的TAN 稱為N2 型。也可以根據(jù)分布位置，分為外周血TAN 和腫瘤浸潤性中性粒細胞（tumor infiltrating neutrophils，TIN）。根據(jù)發(fā)育程度的不同，可分為未成熟和成熟TAN［1-3］。

轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor-β，TGF-β）可以誘導TAN 向著N2 極化。經(jīng)TGF-β 誘導后的TAN 主要為N2 型，而阻斷TGF-β 后，TME內(nèi)CD8+T 細胞的數(shù)量和活性均增加，免疫治療的療效得到增強，TME 內(nèi)的TAN 極化方向由N2 轉(zhuǎn)向了N1。IFN-β 可以誘導TAN 想著N1 的方向分化，比如在缺乏IFN-β 時，小鼠肺部腫瘤中以N2 為主，細胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule 1，ICAM1）和TNF-α 表達低，而經(jīng)過IFN-β 治療后TNF-α 及ICAM1 表達增加，T 細胞的活化增強，TAN 向著N1 極化，表現(xiàn)出抗腫瘤特性。

在同一類型腫瘤的不同分期中，TAN 的功能表型也可能存在不同，一般來說，在原發(fā)腫瘤早期，TAN 常常以N1 型為主，而隨著腫瘤的進展，TME中的TAN 逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐訬2 為主，一定程度上代表了腫瘤進展的結(jié)果［4］。受限于傳統(tǒng)定義TAN 亞群的方法，光鏡下的細胞或細胞核形態(tài)差異并不能將異質(zhì)性TAN 亞群很好的區(qū)分開，對TAN 異質(zhì)性產(chǎn)生的原因更是知之甚少。雖然近年來有研究提出以組織學染色、電鏡分析以及分子表型等對TAN 進行更加準確合理的分型，但目前為止尚沒有任何一種方法能夠用來準確鑒別TAN 的異質(zhì)性并解釋其產(chǎn)生原因。

2 TAN 的雙向調(diào)控

TAN 是TME 中存在的多種免疫細胞之一［5］，在腫瘤進展過程中發(fā)揮重要作用，但其具體是促癌還是抑癌，在不同的研究中得出的結(jié)果并不相同：一些研究結(jié)果顯示TAN 具有抗腫瘤潛力［6-7］，但另一些研究卻顯示TAN 具有促進腫瘤進展的特性。先前的研究發(fā)現(xiàn)，未成熟TAN 的異位出現(xiàn)可能是造成不同功能表型的原因，因為免疫抑制性TAN 通常具有更不成熟的表型，有人甚至將免疫抑制表型的TAN 等同于未成熟TAN，TAN 的成熟與否成為標記TAN 功能表型的重要依據(jù)。然而，并不是所有免疫異質(zhì)性TAN 都是未成熟的，而未成熟的TAN 也不一定就是免疫抑制性的，如血液中免疫抑制性TAN 同樣包括已經(jīng)發(fā)育成熟的細胞；CD1-CD66+的未成熟TAN 被證實可以活化T 細胞發(fā)揮抗腫瘤活性，而CD10+的成熟TAN 則具備相反的作用。也有人認為是粒細胞內(nèi)獨特的顆粒組成引起了未成熟和成熟TAN 表型的差異。

2.1 抗腫瘤作用在胃癌、結(jié)直腸癌（Ⅲ期）和高級別卵巢癌的研究中，TAN 的浸潤程度與較好的預后相關，提示TAN 可能具有抗腫瘤潛能，這種抗腫瘤作用通過直接或間接的多種途徑實現(xiàn)［2］。

TAN 可以通過自身接觸和細胞毒性作用直接殺傷腫瘤細胞［7］，這種殺傷作用與局部缺氧相關而與T 細胞無關，緩解缺氧后，TME 內(nèi)TAN 的募集減少，但有趣的是，在這種條件下募集的TAN 卻能夠更有效的殺傷腫瘤細胞［8］。G-CSF、趨化因子、脂多糖以及IFN-β 等多種刺激因素通過與TAN 細胞膜上的相應受體結(jié)合，以及轉(zhuǎn)化生長因子-β 受體（TGFβR）信號傳導的阻斷，可以促進H2O2的產(chǎn)生和釋放，導致瞬時受體電位陽離子通道M 亞家族成員2（transient receptor potential melastatin 2，TRPM2）的激活和開放，促使Ca2+大量流入，引起腫瘤細胞死亡［9］。肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）可通過作用于中性粒細胞上的HGF 受體（也稱為MET）促進誘導型一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，iNOS）的表達和NO 的釋放，對腫瘤細胞造成殺傷。TAN 還能通過抗體依賴的細胞毒性作用（antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC）殺傷腫瘤細胞［10］，并以機械性破壞的方式對腫瘤細胞膜進行攝取，造成腫瘤細胞的崩解死亡，該過程涉及信號調(diào)節(jié)蛋白-α（signal regulatory protein alpha，SIRPα）與CD47 的相互作用，表明靶向該通路具有潛在的治療應用價值［2，6］。在一項宮頸腺癌小鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，TAN 還能分泌一種能降解基底膜成分的廣譜蛋白酶，促使腫瘤細胞從基底膜脫落，發(fā)揮抑制腫瘤的作用（圖1A-C）。

除了直接殺傷腫瘤細胞外，TAN 分泌的趨化因子CXCL10、CCL2、CCL3、CXCL1 和 CXCL2，能夠募集T 細胞和其他免疫細胞增強抗腫瘤免疫［11］（圖1D）。TAN 還可以促進巨噬細胞分泌IL-12，促進非常規(guī)T 細胞（CD4-CD8-TCRαβ+double-negative unconventional T cells，UTCαβ）向Ⅰ型免疫反應的極化和IFN-γ 的產(chǎn)生［11］（圖1E）。TME 中存在的干擾素-γ（IFN-γ）和GM-CSF 能促進TAN 成熟為抗原呈遞細胞（antigen presenting cell，APC），表達主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ類和Ⅱ類分子，刺激CD4+和CD8+T細胞的增殖和活化。有趣的是，有體外試驗表明TAN 釋放的中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）也可以引發(fā)和加強T 細胞的抗腫瘤免疫，但目前在癌癥患者的文獻報道中，NETs 均為促腫瘤作用，故NETs 在體內(nèi)是否具備抗腫瘤作用尚需進一步的研究［1］。

圖1 TAN 的抗腫瘤作用Fig.1 Anti-tumor effects of TAN

2.2 促腫瘤作用在包括非小細胞肺癌、頭頸部腫瘤、黑色素瘤、肝細胞癌在內(nèi)的多種腫瘤活檢樣本中，TAN 的浸潤程度與總生存率（overall survival，OS）呈負相關［12］，而術(shù)前較高的系統(tǒng)免疫炎癥指數(shù)和中性粒細胞淋巴細胞比值（neutrophils to lymphocytes ratio，NLR）與多種實體腫瘤的不良預后相關［13-14］。大量體外實驗和動物實驗也證實了TAN 通過多種途徑促進腫瘤進展：

通過釋放ROS 造成肺上皮細胞DNA 損傷：這種損傷本身比較輕微，但在致癌物存在的情況下可以被顯著放大，從而促進腫瘤的發(fā)生，即TAN 通過釋放ROS 提高了組織對致癌物質(zhì)的敏感性［15］。此外，人和小鼠腸黏膜中活化的TAN 可通過釋放促炎癥的RNA 微粒，促進上皮細胞DNA 的雙鏈斷裂，造成基因組不穩(wěn)定性，組織愈合受損，促進腫瘤發(fā)生［16］（圖2A）。

通過旁分泌信號通路刺激腫瘤細胞的增殖：在斑馬魚RAS 驅(qū)動的腫瘤模型研究中，TAN 通過釋放前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）或彈性蛋白酶直接促進腫瘤細胞的增殖。此外，白介素1受體拮抗劑（IL-1RA）可以對抗抑癌基因誘導的腫瘤細胞凋亡，間接促進腫瘤增殖（圖2B）。

通過抑制其他免疫細胞發(fā)揮促瘤作用［1］：TAN 除了通過ROS、iNOS 和精氨酸酶1（arginase 1，Arg1）等介質(zhì)實現(xiàn)對T 細胞的直接抑制外［1］，還可以通過 CCL17、CCL2 募集腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAM）和調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Tregs）重塑TME，抑制T 細胞的抗腫瘤免疫。

通過代謝途徑塑造抑制性TME：在乳腺癌模型中，腫瘤誘導的中性粒細胞能夠通過參與線粒體氧化代謝來維持ROS 的產(chǎn)生以抑制T 細胞［17］。另有研究發(fā)現(xiàn)TAN 在分化過程中發(fā)生了糖酵解向脂肪酸氧化的轉(zhuǎn)變，通過上調(diào)脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白2（fatty acid transporter protein 2，F(xiàn)ATP2），增加花生四烯酸（arachidonic acid，AA）的攝取和PGE2 的合成參與抑制性免疫微環(huán)境的形成。

通過表達免疫檢查點受體/配體來抑制其他免疫細胞：在人和小鼠肝癌模型及人類胃癌患者中，TAN 通過表達程序性細胞死亡蛋白配體1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）抑制T 細胞的抗腫瘤反應。而阻斷PD-1/PD-L1 后，T 細胞受到的免疫抑制減弱，浸潤和活化得到加強［18］（圖2D）。

促進腫瘤血管的生成：基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）與血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的激活、誘導、血管生成以及早期腫瘤生長有關，主要由腫瘤內(nèi)TAN 和腫瘤周圍的巨噬細胞表達。CD11b+Gr1+TAN 表達的Bv8 蛋白上調(diào)可以促進小鼠腫瘤的血管生長，而抗Bv8 抗體可以抑制腫瘤的生長并抑制血管生成，提示TAN 可能在癌變早期通過MMP-9、Bv8 等促進腫瘤組織血管生成（圖2C）。

NETs 是一種TAN 胞膜破裂后釋放的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，主要由松散的DNA 骨架構(gòu)成，其他成分還包括MMP9、中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、組織蛋白酶G（cathepsin G，CG）和髓系過氧化物酶（myeloid peroxidase，MPO）等［19］，NETs通過多種途徑促進腫瘤進展［20］（圖2B，D，E）。

圖2 TAN 的促腫瘤作用Fig.2 Pro-tumor effects of TAN

如前所述，TAN 通過不同的途徑在不同種類和臨床分期的腫瘤中發(fā)揮抗瘤或是促瘤的調(diào)控作用，針對這些可能的調(diào)控機制，目前已有多種藥物正在進行臨床試驗［6］，如TGFβ 抑制劑用于促進N1 型TAN 的發(fā)育，CXCR2 拮抗劑用于抑制TAN向腫瘤的募集，非甾體類藥物通過抑制COX2 抑制腫瘤細胞增殖并減輕前列腺素介導的免疫抑制等。即使如此，關于TAN 具體的抗腫瘤或促腫瘤作用機制目前仍不十分清楚，而鑒于TAN 亞群高度的異質(zhì)性，筆者認為在具體的腫瘤類型中討論其調(diào)控作用可能更為合理。

3 TAN 在UBC 中的研究進展

UBC 被認為是一種高度免疫原性惡性腫瘤，包括非肌層浸潤性膀胱癌（non-muscle-invasive bladder cancer，NMIBC）和肌層浸潤性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer，MIBC），TAN 的雙向調(diào)控作用在UBC 臨床診療中具有巨大潛力。

3.1 NLR 用于預測UBC 預后多項研究證實外周血NLR與UBC較差的臨床預后相關［21-22］，NLR值與腫瘤的分級、分期顯著相關，還與NMIBC 患者的高復發(fā)風險有關。在一項回顧性分析中，899例UBC患者行根治性膀胱全切術(shù)而未行其他輔助治療，其中，術(shù)前較高的NLR 與患者病理分級、膀胱外腫瘤侵犯以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關，術(shù)前NLR ≥ 2.7 的患者，10年腫瘤特異性生存率更低。因此，NLR 被認為是預測膀胱癌患者預后、分層的重要指標［22-23］。NLR 也被一些研究作為預測高危NMIBC 對BCG 治療反應性的工具，可為高危NMIBC 患者提供個體化的治療方案［24］。需要指出的是，絕大多數(shù)研究中采用的NLR 指標只能反映外周血中中性粒細胞的數(shù)量，并不能反映TME中真實的TAN浸潤情況。

3.2 靶向TAN 與其他UBC 經(jīng)典治療的聯(lián)合對于高危NMIBC，經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)加BCG 膀胱內(nèi)灌注治療可以有效降低術(shù)后復發(fā)率以及腫瘤的進展率。然而一些患者對BCG 治療并不敏感，而有研究認為NLR 可以作為預測高危NMIBC 對BCG 治療反應性的工具，并根據(jù)評估結(jié)果為NMIBC 患者提供最佳的治療方案［24］

大量研究表明TAN 與MIBC 患者較差的化療、放療反應性以及較低的生存率相關，并且TAN 促進腫瘤發(fā)生、進展與轉(zhuǎn)移的功能也在一些腫瘤模型中得到驗證，靶向TAN 并聯(lián)合經(jīng)典放、化療的療法顯示出一定潛在應用價值。研究表明，UBC 腫瘤細胞可以通過對上調(diào)CXCL1、CXCL8，促進TAN分泌VEGFA 和MMP9，促進淋巴管的形成和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移［25］，提示靶向TAN 可能具有抑制UBC 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的潛力。然而有研究表明并不是所有的TAN 浸潤水平升高都意味著更差的預后，有文獻報道在病理分期為pT2N0M0 時，CCR5+TAN 浸潤水平與TNM 分期呈負相關，并且對輔助化療和ICIs 治療有更好的反應性［26］。相較于管腔內(nèi)生型乳頭狀MIBC，基底型MIBC 顯示出明顯更高水平的趨化因子吸引中性粒細胞浸潤，而二者不同的腫瘤免疫微環(huán)境也提示兩種類型的MIBC 可能受益于完全不同的治療方法［27］。

3.3 靶向于TAN 的腫瘤治療策略及困境基于目前的研究結(jié)果，靶向于TAN 的腫瘤治療策略大致分為兩類。首先是通過直接耗竭TAN 或抑制其在TME 中的募集，從而減少N2 亞群的促腫瘤作用，然而，考慮到嚴重甚至致命感染的明顯風險，全身性的中性粒細胞耗竭策略在臨床上是不現(xiàn)實的。其次是通過各種辦法干預體內(nèi)TAN 的功能表型，減少N2 亞群的同時增加N1 亞群，其中最常用的方法是阻斷TGF-β 或以IFN-β、高劑量的G-CSF誘導，促進TAN 的抗腫瘤潛能，但目前對于TAN亞型的極化機制知之甚少，甚至連誘導后的TAN亞群也無法做到精確的標識和鑒別，盡管如此，TAN 亞群的極化和重塑仍被認為是重要的和潛力巨大的腫瘤治療策略。也有人提出從外周血提取抗瘤的N1 后再進行外源性輸注的技術(shù)，然而，這些針對TAN 的全身性操作可能會引起嚴重的不良事件，如急性肺損傷［6］，并且由于TAN 本身壽命較短，無法長期保持功能狀態(tài)，需要多次、大量輸注粒細胞，存在嚴重不良反應風險等缺點，該技術(shù)的臨床應用仍存在爭議。

雖然大量研究顯示出TAN 雙向調(diào)控在腫瘤治療中的臨床應用潛力，但鑒于目前的研究結(jié)果大部分來源于體外試驗或動物實驗，這些結(jié)論在人體內(nèi)是否也同樣成立尚不得而知，筆者認為，靶向TAN 的腫瘤治療策略要取得進一步的突破，依賴于對TAN 亞群更深入的研究和更精準的分型，并以此為前提揭示TAN 不同的亞群募集和極化過程中的確切重塑機制。此外，還需要構(gòu)建更加接近于臨床的研究模型，在已有研究成果的基礎上進一步討論TAN 在復雜環(huán)境下對腫瘤的調(diào)控作用。

4 總結(jié)

綜上所述，TAN 因其可塑性和復雜的發(fā)育分化過程，在不同腫瘤或組織形成具有明顯功能表型差異的異質(zhì)性亞群，這些亞群表現(xiàn)出抗瘤和促瘤的雙向調(diào)控作用，深刻影響著腫瘤發(fā)生、進展和轉(zhuǎn)移過程。目前的研究顯示出TAN 應用潛力的同時面臨較多未知和挑戰(zhàn)，進一步揭示TAN 亞群分型和極化的機制是下一步研究的關鍵，有望為新一代腫瘤治療提供新的靶點。

【Author contributions】DENG Kai wrote and revised the article.YANG Meng ，ZHANG Ling，QIAN Jun'an，SHI Yun-qiang revised the article.WANG Chunhui reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.