原發(fā)性膽汁性膽管炎膽管上皮細胞凋亡因素及機制的研究進展

楊煥煥 袁詩雨 唐映梅

昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院胃腸科（昆明 650101）

原發(fā)性膽汁性膽管炎（primary biliary cholangitis，PBC）是一種慢性自身免疫性肝病。全球患病率升高，以中國在內(nèi)的亞太地區(qū)患病率升高尤為突出。未經(jīng)有效治療，PBC 可最終進展至肝硬化、肝衰竭，將嚴重影響患者的生存質(zhì)量［1-2］。熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）是PBC 治療的首選藥物，但約25%～50%的患者應(yīng)答不佳。奧貝膽酸是PBC 治療的二線用藥，主要用于對UDCA 應(yīng)答不佳的患者，但因其可加重患者瘙癢等癥狀限制了臨床應(yīng)用。肝移植是PBC 相關(guān)終末期肝病患者唯一根治性治療方法，但受供體來源的限制，肝移植成為PBC 治療的一個重要挑戰(zhàn)［3-4］。BEC 占肝臟細胞總數(shù)的5%，是PBC時免疫破壞的主要靶目標。BEC 在多種刺激條件下被激活通過增殖以彌補損傷的BEC。但隨著疾病的進展，BEC 凋亡逐漸增多，細胞增殖能力減弱，最終導致膽管的進行性缺失［5］。與健康人相比，PBC 患者BEC 中DNA 碎片增多，且PBC 患者BEC 中的Fas、FasL、TRAIL、顆粒酶B、穿孔蛋白表達水平顯著升高。同時，PBC時BEC 中凋亡相關(guān)基因WAF1 和P53 表達亦明顯上調(diào)，提示PBC時BEC凋亡增加［6］。諸多因素如自身抗原的暴露、異常免疫反應(yīng)、膽汁淤積、腸道菌群的改變及氧化應(yīng)激等因素均會導致BEC 凋亡，而BEC 凋亡又會促進上述因素的形成，繼而形成惡性循環(huán)，推動PBC 不斷的進展。BEC 凋亡在PBC 疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，深入探究影響B(tài)EC 凋亡的因素及相關(guān)機制，可為開發(fā)新的PBC 治療靶點提供新思路，從而使更多的PBC 患者受益。

1 PBC 時線粒體自身抗原暴露促進BEC凋亡的發(fā)生

PBC 時機體免疫異常打破對自身抗原的免疫耐受，造成肝內(nèi)中、小膽管的靶向損傷，導致膽管缺失和膽汁淤積［7］。因為BEC 缺乏谷胱甘肽的修飾，BEC 在凋亡過程中PDC-E2 可保持免疫原性并可進入凋亡小體，隨后被循環(huán)中的抗線粒體抗體（AMA）識別，并形成抗原抗體復合物，進一步激活免疫反應(yīng)和導致BEC 凋亡［5］。同時，脫落的凋亡小體形成新生抗原刺激炎癥細胞釋放炎癥細胞因子，加重局部炎癥狀態(tài)，由此引起更多的BEC 凋亡［6］。免疫細胞的攻擊也會導致BEC 自身抗原的暴露，例如在NK/BEC 的比值升高的情況下，NK 細胞攻擊BEC 并釋放自身抗原成分激活自身反應(yīng)性T 淋巴細胞而導致BEC 損傷［8］。凋亡細胞通常會被專業(yè)吞噬細胞（如巨噬細胞、樹突狀細胞）和鄰近非專業(yè)吞噬細胞（如上皮細胞等）吞噬，隨后吞噬體和溶酶體融合降解凋亡細胞。但PBC 時一方面巨噬細胞存在胞葬功能障礙，這導致凋亡細胞不能被巨噬細胞及時有效清除，致使凋亡細胞不斷積累和自身抗原的持續(xù)性暴露，繼而引發(fā)廣泛的自身免疫反應(yīng)，促進BEC 凋亡；另一方面，PBC時鄰近的正常BEC 吞噬凋亡BEC 的同時會攝入凋亡BEC 中的自身反應(yīng)蛋白等成分，從而提供自身抗原的持久性來源，使BEC 不斷受到免疫攻擊和損傷［9-10］。線粒體自身抗原的暴露是BEC 凋亡的促進因素，而通過促進BEC 谷胱甘肽的修飾，改善巨噬細胞的胞葬功能等來抑制自身抗原的暴露可能是PBC 的一個潛在治療靶點。

2 PBC 時異常免疫反應(yīng)在BEC 凋亡中具有重要作用

PBC 的主要病理基礎(chǔ)是T 淋巴細胞浸潤為主，其他多種天然免疫細胞參與的肝內(nèi)膽管上皮細胞的免疫破壞［11］。BEC 表達多種Toll 樣受體（Tolllike receptors，TLR），微生物及代謝產(chǎn)物等與之結(jié)合激活TLR 促進BEC 分泌 CX3CL1、IL-6、TNFα 等趨化因子和細胞因子，后者可招募多種免疫細胞浸潤至門靜脈和BEC 周圍［12］，這些免疫細胞通過不同作用機制促進BEC 凋亡，進而導致膽管進行性減少和膽汁淤積等，最終導致PBC 不可逆性進展。

2.1 CD4+T 淋巴細胞和CD8+T 淋巴細胞T 淋巴細胞是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，PBC 患者門靜脈有大量CD4+T 和CD8+T 淋巴細胞浸潤。CD4+T 淋巴細胞除了可以通過直接分泌IL-6，12，17，21 和IFN-γ 等細胞因子促進細胞損傷，還可以通過增強和維持CD8+T 淋巴細胞反應(yīng)和刺激B 淋巴細胞分化為漿細胞產(chǎn)生抗體從而促進BEC 凋亡的發(fā)生。與CD4+T 細胞相比，CD8+T 細胞對BEC 具有更直接的殺傷作用，主要通過表達FasL 與BEC表達上調(diào)的Fas 受體結(jié)合及釋放穿孔素和顆粒酶兩種方式誘導BEC 凋亡。其次，CD8+T 細胞還可以通過表達KLRG1和分泌IFN-γ促進BEC損傷［8，13］。

2.2 Th1、Th17、Treg 和Tfh 細胞CD4+T 淋巴細胞在不同細胞因子的刺激下可分化為Th1 和Th17細胞，可分別通過產(chǎn)生IFN-γ 和IL-17 誘導BEC 凋亡。PBC 患者外周血中Treg 細胞的數(shù)量顯著減少，同時單核細胞浸潤增加，血清AMA 抗體增加，Treg 細胞的數(shù)量減少和功能異常可能導致自身反應(yīng)性T 細胞不受控制激活，導致促炎細胞因子的產(chǎn)生，進一步加重BEC 凋亡和損傷。此外，PBC 患者循環(huán)中的濾泡輔助性T（Tfh）細胞增多，在受到抗原等刺激后IL-21 生成增多，繼而促進自身反應(yīng)性B 淋巴細胞分化為漿細胞并產(chǎn)生AMA 抗體。表明Tfh 細胞通過參與AMA 的產(chǎn)生間接介導PBC患者BEC 凋亡和損傷［13］。

2.3 B 淋巴細胞B 淋巴細胞在PBC 的發(fā)病機制中具有重要作用。首先BEC損傷后暴露的PDC-E2激活B 淋巴細胞后通過分泌IL-6、IFN-γ 和TNF-α等細胞因子促進Th1、Th17 細胞增殖與分化可以啟動對BEC 的損傷反應(yīng)［14］；其次，B 細胞通過分化成漿細胞產(chǎn)生抗體形式參與BEC 的凋亡。漿細胞分泌產(chǎn)生的AMA 與凋亡小體中的PDC-E2 形成抗原抗體復合物反過來又可以激活多種免疫細胞，吸引免疫攻擊繼而導致BEC 損傷；此外，漿細胞還可分泌IgA 抗體并通過pIgR 介導進入膽管上皮細胞并通過激活caspase 途徑促進BEC 凋亡［11，13］。

2.4 巨噬細胞巨噬細胞是PBC 發(fā)病中重要的先天性免疫細胞，其對BEC 的促凋亡作用主要表現(xiàn)在以下3 個方面：（1）在AMA 存在的情況下，巨噬細胞和凋亡的BEC 共培養(yǎng)時TRAIL 產(chǎn)生顯著增加，與BEC 中表達上調(diào)的DR5 受體結(jié)合促進BEC大量凋亡；（2）抗原抗體抗復合物等刺激使巨噬細胞中的炎癥小體NOD 樣受體蛋白-3 激活繼而促進IL-18、IL-1β 等炎癥因子的釋放，從而導致周圍BEC 凋亡增加［15-16］；（3）PBC 時浸潤的巨噬細胞表達CD40L，與BEC 上的CD40 結(jié)合后可通過激活NF-KB 和AP-1 途徑增加BEC 中FasL 的表達間接促進了BEC 凋亡［17］。

2.5 NK 和NKT 細胞自然殺傷（natural killer ，NK）細胞主要在PBC 患者的門脈區(qū)富集，IFN-a 和TLR4 配體是NK 細胞的重要刺激物，可以驅(qū)動NK細胞激活通過分泌IFN-γ 和穿孔素有效殺死BEC。除了直接殺傷BEC 外，NK 細胞還能在APC 存在的情況下激活自身反應(yīng)性CD4+T 細胞進而促進BEC凋亡和疾病進展［8，13］。自然殺傷T（natural killer T，NKT）細胞在接受BEC 呈遞的脂質(zhì)抗原刺激后分泌IFN-γ 并通過FasL 介導BEC 凋亡［18］。

綜上所述，在不同刺激因素下先天性和適應(yīng)性免疫細胞可以單獨或通過相互作用的方式共同誘導PBC 時BEC 凋亡的發(fā)生?；诿庖呓閷У陌l(fā)病機制，目前已提出幾種關(guān)于PBC 免疫治療策略，如甲氨蝶呤等免疫抑制劑；針對免疫細胞或細胞因子的靶向藥物，如B 細胞靶向療法和抗CD20 單克隆抗體-利妥昔單抗等，但上述免疫治療效果有限。PBC 是一種自身免疫性肝病，多種免疫細胞和細胞因子均參與了PBC 的發(fā)病，因而單獨的一種免疫治療方法可能達不到較好的臨床效果，故繼續(xù)深入研究PBC 時各種免疫細胞在PBC 中的作用及機制，開發(fā)聯(lián)合免疫治療可能成為未來PBC治療的一種新的治療方案。

3 PBC 時膽汁酸代謝異常加重BEC 凋亡

PBC 時BEC 凋亡增加進而導致膽管進行性缺失和膽汁淤積。膽汁淤積時疏水性膽汁酸的增加又可對細胞造成毒性損害，其誘導BEC 凋亡與胞質(zhì)內(nèi)游離鈣離子的增加、JNK 激活、ROS 生成增強以及Bax 介導的線粒體外膜通透性增加導致細胞色素C 釋放相關(guān)［19］。陰離子交換蛋白2（anion exchanger protein2，AE2）與膽汁酸的代謝密切相關(guān)。AE2 和Ⅲ型肌醇三磷酸受體（InsP3R3）位于BEC的頂膜中，可促進碳酸氫鹽的分泌使管腔呈堿性進而防止疏水性膽汁酸進入BEC 并誘導細胞毒性。PBC 時，膽管上皮細胞中的AE2 和InsP3R3 表達降低，一方面使碳酸氫鹽在BEC 中積累，激活可溶性腺苷酸環(huán)化酶（sAC）—碳酸氫鹽的傳感器，活化的sAC 通過Bax 的磷酸化、細胞色素C 的釋放和Caspase-3 途徑參與膽汁酸誘導的BEC 凋亡。另一方面，由于碳酸氫鹽的分泌不足，無法與膽汁酸充分結(jié)合并形成去質(zhì)子化的膽汁酸鹽，從而使毒性膽汁酸進入BEC 并導致其凋亡。miRNA-506 在BEC 中過表達可抑制AE2 和InsP3R3 的活性，導致PDC-E2 過表達和線粒體功能障礙、促進氧化應(yīng)激和膽汁酸誘導的細胞凋亡［11，19-21］。熊去氧膽酸是PBC 治療的是首選藥物，其可通過上調(diào)BEC 中AE2 的表達，促進碳酸氫鹽的分泌，減少疏水性膽汁酸對BEC 的損傷和抑制免疫反應(yīng)及Bax 的易位維持線粒體膜的穩(wěn)定性等減少BEC 凋亡，但部分患者對其應(yīng)答不佳。奧貝膽酸及其他藥物雖然也可通過改善膽汁淤積抑制BEC 凋亡及延緩PBC 的進展，但因其副作用限制了其臨床應(yīng)用。miRNA-506、AE2 通過影響膽汁酸代謝在PBC 的發(fā)病機制中具有重要作用，靶向miRNA-506、AE2 等的藥物研發(fā)可能為PBC 的治療帶來新希望。

4 PBC 時腸道菌群的異常改變與BEC 凋亡有關(guān)

研究證實腸道菌群的改變與PBC 疾病密切相關(guān)，并可加重BEC 凋亡的發(fā)生。肝臟通過腸肝軸與腸道緊密相連，失衡的腸道菌群通過此軸可引起一系列的肝臟病理反應(yīng)。PBC 患者中腸道菌群多樣性發(fā)生改變，乳酸桿菌等有益菌減少，變形菌、腸桿菌等致病菌增加。微生物和宿主抗原之間的分子模擬可能增強易感個體的自身免疫反應(yīng)。人與大腸桿菌、支原體等微生物的PDC-E2 成分十分相似，可通過分子模擬機制導致對自身抗原免疫耐受性的打破，誘發(fā)自身免疫反應(yīng)，進而導致BEC 損傷［22-24］。腸道菌群的異位可使巨噬細胞、膽管上皮細胞上的TLR 表達上調(diào)，其激活后可釋放TNF-α、CCL4 等炎癥細胞因子和趨化因子，進而通過炎癥反應(yīng)和吸引免疫攻擊繼而導致BEC凋亡、肝內(nèi)膽管缺失和膽汁淤積。膽汁淤積反過來又會導致腸道菌群的改變，形成惡性循環(huán)，使更多的BEC 發(fā)生凋亡。此外，腸道菌群及代謝產(chǎn)物還會通過促進活性氧的產(chǎn)生、增加氧化應(yīng)激等方式促進BEC 凋亡［25-27］。多數(shù)PBC 患者有腸道菌群的改變，腸道菌群的失衡與PBC 的發(fā)病及其預(yù)后均相關(guān)，其可作為PBC 患者診斷的生化標志物和潛在治療靶點。

5 PBC 時氧化應(yīng)激參與BEC 凋亡

氧化應(yīng)激是指氧化和抗氧化防御之間的不平衡導致的細胞生物學功能損害。PBC 患者血清中氧化應(yīng)激的生化標志物增多，而超氧化物歧化酶、谷胱甘肽S 轉(zhuǎn)移酶等抗氧化分子水平則顯著下降［28-29］。PBC 時IFN-β、TNF-α 等促炎細胞因子可以誘導BEC 活性氧的產(chǎn)生，并通過ATM/p53/p21WAF1/Cip1 通路導致細胞周期阻，BEC 凋亡增加而再生受損，最終導致肝內(nèi)中小膽管的進行性減少。同時，炎癥細胞因子誘導的氧化應(yīng)激增加了BEC 對化學誘導細胞毒性的敏感性，這與抗氧化酶的抑制密切相關(guān)［30-31］。PBC 時氧化應(yīng)激通常伴有谷胱甘肽的降低，通過增加caspase-3 的活性、降低bcl-2 在BEC 上的表達和誘導P53 及p-JNK 的表達等促進BEC 凋亡，谷胱甘肽抑制劑處理增強了BEC 對氧化劑誘導凋亡的敏感性，說明谷胱甘肽的耗竭在BEC 凋亡中具有重要作用［16］。谷胱甘肽的降低一方面可增強氧化應(yīng)激對BEC的損傷作用，另一方面降低的谷胱甘肽使PDC-E2的修飾異常而使其保持免疫完整性，繼而觸發(fā)自身免疫反應(yīng)而導致BEC 損傷。氧化應(yīng)激還可使線粒體能量代謝障礙及線粒體膜通透性增加、細胞色素C釋放增加，繼而導致BEC凋亡。抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少活性氧等的產(chǎn)生，增加外源性谷胱甘肽，可抑制PBC 時BEC 的損傷，進而延緩疾病的進展。

6 PBC 時影響B(tài)EC 凋亡的其他因素及相關(guān)機制

女性優(yōu)勢是PBC 疾病的另一特征，好發(fā)年齡為40～60 歲，隨著年齡的增加，體內(nèi)雌激素水平逐漸下降。雌激素可保護線粒體功能，其缺乏可上調(diào)雌激素相關(guān)受體γ（estrogen-related receptorγ，ERRγ）的表達并通過增加BEC 中Bcl-2 家族中的促凋亡分子進而增加BEC 凋亡的易感性。在培養(yǎng)人的BEC 中，雌激素相關(guān)受體α（estrogen-related receptor α，ERRα）被過氧化物酶體增殖物激活受體γ 共激活因子-1α（peroxisome proliferator-activated receptorγ coactivator-1α，PGC-1α）激活，PGC-1α-ERRα 軸誘導脂肪酸氧化產(chǎn)生活性氧促進細胞凋亡［32-33］。Galectin-3（一種半乳糖凝集素）和B7-H4分子在BEC 中表達上調(diào)，可分別通過抑制CD8+T淋巴細胞浸潤、IgA 抗體的產(chǎn)生和FasL 的產(chǎn)生抑制BEC 凋亡。上述表明Gal-3 和B7-H4 分子是BEC 凋亡的保護性因素。此外，PBC 時BEC 中P53、WAF1 和Bcl-2 家族中的促凋亡蛋白分子表達上調(diào)，則可通過影響細胞周期和線粒體功能促進BEC 凋亡［6，34-35］。影響B(tài)EC 凋亡的因素很多，促凋亡和抗凋亡因素的失衡是BEC 凋亡和PBC 疾病進展重要原因，也是PBC 治療的關(guān)鍵所在。

7 總結(jié)與展望

PBC 是一種以中年女性發(fā)病為主的自身免疫性肝病，肝內(nèi)中、小膽管的損傷和膽汁淤積為其主要特點。熊去氧膽酸和奧貝膽酸分別是PBC治療的一線和二線用藥，但有相當一部分患者由于對上述藥物應(yīng)答不佳或因嚴重副作用而得不到有效治療，最終進展至終末期肝病。受供體來源的限制，肝移植成為PBC 相關(guān)終末期肝病治療的重要挑戰(zhàn)。目前PBC 發(fā)病機制尚不完全明確，但越來越多的證據(jù)表明BEC凋亡在PBC的發(fā)病機制中起重要作用。線粒體自身抗原的暴露、異常免疫反應(yīng)、毒性膽汁酸、腸道菌群的改變及氧化應(yīng)激等因素通過不同的作用機制促進PBC時BEC凋亡的發(fā)生。進一步深入探索及研究PBC 時影響B(tài)EC 凋亡的因素及相關(guān)機制可為未來PBC 開發(fā)新的治療靶點或新的治療方案提出提供堅實的理論基礎(chǔ)，這將使更多的PBC 患者受益。

【Author contributions】YANG Huanhuan was responsible for writing the article，YUAN Shiyu was responsible for collecting and organizing the literature，and TANG Yingmei was responsible for revising the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.