食管鱗狀細(xì)胞癌患者與健康人群腸道菌群的差異研究

曹燕珍，圖蓀阿依·吾麥爾，胡佳捷，楊麗麗，房新志

0 引言

2020年，全球?qū)⒔?0萬食管癌新發(fā)病例和54萬例食管癌死亡病例，分別位于全球惡性腫瘤發(fā)病和死亡排名的第7位和第6位[1]，而食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）是食管癌最常見的組織學(xué)亞型。腸道菌群被稱為人體的另一大“器官”，其人體消化、代謝、免疫等各方面都有重要作用[2]。腸道菌群主要由厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和變形菌門四大類組成[3]，其中在健康狀態(tài)下，超過80%的腸道微生物組是由專性厭氧菌組成的，屬于厚壁菌和擬桿菌，少于5%屬于變形菌門[4]，微生物群落之間比例的顯著變化或新細(xì)菌群的擴(kuò)張以及功能的改變，可導(dǎo)致宿主和微生物間相互作用的不平衡，進(jìn)而引起菌群失調(diào)[5]。有研究表明，以厚壁菌門，尤其是產(chǎn)丁酸鹽的菌種巨大消耗是消化道腫瘤腸道菌群組成的主要形式，可導(dǎo)致食管鱗狀細(xì)胞癌、胃癌等消化道腫瘤的發(fā)生[6]，與腸道微生物組相比，關(guān)于食管微生物組的研究是有限的，需進(jìn)一步研究[7]。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集新疆醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院2019年1月—12月胃鏡下活檢確診的食管鱗狀細(xì)胞癌患者30例，其中男21例、女9例；同期收集健康體檢者25例為對(duì)照組，其中男18例、女7例。食管鱗狀細(xì)胞癌組平均年齡62.03±10.51歲，健康對(duì)照組46.28±12.90歲。兩組人群中均為新疆本地居民，所有患者在采樣前1個(gè)月均未使用過抗生素藥物。食管鱗狀細(xì)胞癌的診斷依據(jù)食管癌診療規(guī)范（2018年版）[8]。本研究所有患者均知情同意，并獲得新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（K-2019022）。

1.2 方法

1.2.1 微生物擴(kuò)增子測(cè)序法 擴(kuò)增子測(cè)序在微生物生態(tài)學(xué)研究中被用于探索微生物群落，是一種半定量方法，揭示了微生物群落中細(xì)菌群體的相對(duì)豐度。細(xì)菌的16srRNA基因是最廣泛使用的針對(duì)微生物組檢查的擴(kuò)增子，具體實(shí)驗(yàn)步驟見圖1。

圖1 微生物擴(kuò)增子測(cè)序法步驟Figure 1 Experimental procedures of microbial amplification sequencing

1.2.2 數(shù)據(jù)處理 Trim Galore軟件除去序列最末端質(zhì)量低于20的堿基，去除可能包含的adapter序列，之后去除小于100 bp的短序列[15]；FLASH2軟件拼接雙側(cè)末端測(cè)序得到的成對(duì)序列，得到merge序列；用Mothur軟件查找并去除序列中的引物[15]；用Usearch去除總堿基錯(cuò)誤率大于2的序列以及長度小于100 bp的序列[15]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

Alpha多樣性采用Observed指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和coverage指數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)，基于Wilcoxon秩和檢驗(yàn)兩組間多樣性指數(shù)差異[16]。采用非度量多維尺度分析（NMDS）及主坐標(biāo)分析（PCoA）評(píng)估Beta多樣性[17]。多樣性分析使用R軟件進(jìn)行，LEfSe軟件篩選最可能解釋組間差異的物種，使用Metastats進(jìn)行組間相對(duì)豐度的分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腸道菌群多樣性分析

2.1.1 Alpha多樣性分析 R軟件對(duì)兩組進(jìn)行Observed、Chao1、ACE、Shannon、Simpson、Coverage指數(shù)比較，秩和檢驗(yàn)顯示兩組間多樣性指數(shù)均無差異（P＞0.05），見圖2。

圖2 Alpha多樣性指數(shù)箱Figure 2 Boxplot of alpha-diversity indices

2.1.2 Beta多樣性分析NMDS及PCoA 分析食管鱗狀細(xì)胞癌患者組與健康對(duì)照組Beta多樣性，兩組間有較大的相似性，但存在一定差異。其中PCoA分析使用基于加權(quán)UniFrac距離分析的PCoA圖來評(píng)估β多樣性，展現(xiàn)樣本間物種豐度差異，見圖3。

圖3 NMDS及PCoA分析圖Figure 3 NMDS and PCoA analysis charts

2.2 LEfSe差異性物種篩選

據(jù)LEfSe差異性分析，兩組樣本之間存在顯著性差異，以|LDA|＞2，P＜0.05為差異篩選閾值，可得到兩組間有62個(gè)物種存在差異顯著性的豐富度，見圖4。

圖4 兩組人群LEfSe差異性分析柱狀圖Figure 4 Histogram of LEfSe difference analysis between the two groups

2.3 健康對(duì)照組與食管鱗狀細(xì)胞癌組糞便菌群相對(duì)豐度比較

食管鱗狀細(xì)胞癌組患者變形菌門Proteobacteria、疣微菌門Verrucomicrobia的相對(duì)豐度高于健康對(duì)照組（P＜0.05）；食管鱗狀細(xì)胞癌組患者M(jìn)egamonas屬的相對(duì)豐度低于健康對(duì)照組（P=0.025），其余相對(duì)豐度見表1。

3 討論

食管癌是多種因素共同作用的結(jié)果，本研究主要探討菌群結(jié)構(gòu)與食管鱗狀細(xì)胞癌的關(guān)系，盡管菌群與一些疾病的因果關(guān)系尚不確切[18]，有研究[19]表明腸道微生物菌群對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過程中有著不可忽視的影響，可以保護(hù)宿主組織免受病原入侵，并有助于食管黏膜屏障的結(jié)構(gòu)完整性。還有研究表明[20]，上消化道的微生物豐富度較低與食管鱗狀細(xì)胞發(fā)育不良有關(guān)，這被認(rèn)為是ESCC的前體病變。特定細(xì)菌的聯(lián)合作用促進(jìn)腸道炎性反應(yīng)和癌癥，細(xì)菌形成的生物膜為癌細(xì)胞提供了庇護(hù)所[21]，而目前研究較多的腸道微生物是梭桿菌，食管鱗狀細(xì)胞癌可能與具核梭桿菌、牙齦卟啉單胞菌感染相關(guān)[22]，而這些細(xì)菌的存在與食管鱗狀細(xì)胞癌患者生存時(shí)間縮短有關(guān)[23-24]。本研究中梭桿菌門未做出有意義的菌屬，可能與樣本量較少有關(guān)。

Alpha多樣性指數(shù)中，Chao1指數(shù)主要反映群落的豐富度，Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)用于體現(xiàn)腸道菌群落的均勻程度，即各菌落的豐度差異[25]。本研究結(jié)果顯示，兩組菌群Alpha多樣性無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這與劉曉波等[26]研究結(jié)果一致，提示食管鱗狀細(xì)胞癌患者與健康患者菌群間總體多樣性無明顯差異；Beta反映的是不同個(gè)體菌落結(jié)構(gòu)的相似程度，樣本集中則提示有較高的聚集性。NMDS和PCoA分析通過降維方法，表現(xiàn)各樣本的距離分布，對(duì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的數(shù)據(jù)排序結(jié)果的顯示更加穩(wěn)定[27]。本研究Beta多形性結(jié)果顯示，兩組微生物多樣性呈相似性趨勢(shì)，這與Zhao等[28]研究結(jié)果一致。NMDS和PCoA分析展現(xiàn)樣本間物種豐富度存在差異，說明食管鱗狀細(xì)胞癌患者與健康人群腸道菌群落豐富度存在一定的差異。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)食管鱗狀細(xì)胞癌患者變形菌門的相對(duì)豐度顯著高于健康對(duì)照組，與已有研究[29]結(jié)果一致，這可能與食管反流可引起食管黏膜壁損傷，使食管上皮細(xì)胞處在微生物滋生環(huán)境中，導(dǎo)致了慢性炎性反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)，而慢性炎性反應(yīng)是食管進(jìn)展為食管鱗狀細(xì)胞癌的重要危險(xiǎn)因素[30]。疣微菌門可能促進(jìn)腸道黏膜破壞，增加腸道通透性，導(dǎo)致脂多糖進(jìn)入血液并遷移到食管組織，與TLR4等受體結(jié)合，影響NF-κB信號(hào)通路從而引起食管鱗狀細(xì)胞癌[31]。正常人體消化道菌群98%以上為厚壁菌門和擬桿菌門[32]，食管鱗狀細(xì)胞癌組患者厚壁菌門Megamonas屬的相對(duì)豐度則低于健康對(duì)照組，這與Nasrollahzadeh等研究結(jié)果相反，可能與食管炎性反應(yīng)及腫瘤的發(fā)生導(dǎo)致厚壁菌門中的一些菌豐富度降低有關(guān)[33]。

大多數(shù)情況下，微生物菌群與宿主和諧相處，通常處于共生狀態(tài)。然而，在某些情況下，這種共生關(guān)系可能會(huì)破裂。菌群失調(diào)將導(dǎo)致有害菌群豐度增高，有益菌群豐度減少，產(chǎn)生致癌性代謝產(chǎn)物及細(xì)胞因子[34]，然而食管鱗狀細(xì)胞癌特定菌株及其代謝物仍然未知，需進(jìn)一步研究。本研究通過對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)與組分的變化研究來探索，結(jié)果表明其可以作為一個(gè)準(zhǔn)確、靈敏的食管癌生物學(xué)診斷指標(biāo)，為食管鱗狀細(xì)胞癌的診療提供新的途徑。然而，由于本研究樣本量少，沒有對(duì)患者年齡、性別、病理分期等進(jìn)一步分析以及兩組人群特定的地理位置、長期飲食習(xí)慣及實(shí)驗(yàn)技術(shù)等方面的問題也可能會(huì)造成差異[35]，因此，需要后續(xù)研究來探討食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展與定植菌群結(jié)構(gòu)與組分變化的機(jī)制，為今后食管鱗狀細(xì)胞癌的診療提供更加有效的方法。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。