SHMT2通過結(jié)合并上調(diào)HAX1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移

陳前智，沈娜，張寧，陳嫣

0 引言

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，也是癌癥死亡的主要原因之一。2020年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，女性乳腺癌已超過肺癌，成為最常見的癌癥，估計有230萬新病例，其中乳腺癌死亡人數(shù)占癌癥死亡總數(shù)的6.9%[1]。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是乳腺癌死亡的主要原因[2-3]。盡管乳腺癌生物學(xué)研究的進(jìn)步促使了分子靶向治療和內(nèi)分泌藥物的廣泛應(yīng)用，但由于乳腺癌的復(fù)雜性和異質(zhì)性，與乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移調(diào)控相關(guān)的分子機(jī)制目前尚不清楚[4-5]。因此，尋找新的乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制及相關(guān)靶向治療藥物迫在眉睫[6-7]。線粒體絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（SHMT2）是一種線粒體代謝酶，在維持正常甲基化模式、DNA穩(wěn)定性和遺傳變異方面起關(guān)鍵作用[8]。SHMT2催化細(xì)胞內(nèi)甘氨酸生物合成對細(xì)胞生長和增殖至關(guān)重要，異常的SHMT2促進(jìn)了代謝的變化，從而增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞在缺血微環(huán)境中的生存能力[9]。已有研究表明，SHMT2在乳腺癌、胃癌、食管癌和結(jié)直腸癌等組織中的mRNA和蛋白水平均顯著高于配對的癌旁組織，而且在不同腫瘤中SHMT2可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲能力[10]。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證并發(fā)現(xiàn)SHMT2在乳腺癌組織中表達(dá)顯著高于癌旁組織，而且在腫瘤細(xì)胞中敲減SHMT2基因可抑制其侵襲遷移能力。本研究以探索SHMT2調(diào)控乳腺癌侵襲遷移的分子機(jī)制為研究目標(biāo)，擬發(fā)現(xiàn)新的分子調(diào)控機(jī)制和潛在干預(yù)靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher公司；高速低溫離心機(jī)購自美國Eppendorf公司；普通倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；蛋白印跡實(shí)驗(yàn)裝置購自美國Bio-Rads公司。

MCF7、HEK293T是源于ATCC的凍存細(xì)胞株，細(xì)胞培養(yǎng)所需的DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清均購自美國Gibco公司。蛋白印跡實(shí)驗(yàn)制膠試劑和NP40細(xì)胞裂解液購自武漢啟動子公司；轉(zhuǎn)染試劑Turbo-Fect（貨號：R0531）、BCA蛋白濃度檢測試劑盒（貨號：23225）、ECL顯影液（貨號：34577）購自美國Thermo Fisher公司；GAPDH抗體（貨號：60004-1-Ig）、SHMT2抗體（貨號：11099-1-AP）、HAX1抗體（貨號：11266-1-AP）均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；SHMT2抑制劑（SHIN1，貨號：RZ-2994）購自美國MCE公司。

1.2 數(shù)據(jù)庫篩選及數(shù)據(jù)處理

從TCGA數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov）下載并整理TCGA-BRCA（乳腺浸潤癌）項(xiàng)目STAR流程的RNAseq數(shù)據(jù)并提取TPM格式的數(shù)據(jù)。根據(jù)數(shù)據(jù)格式特征情況選擇合適的統(tǒng)計方法進(jìn)行統(tǒng)計（運(yùn)用R語言stats包以及car包），用ggplot2包對數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化，分析不同組織蛋白表達(dá)的差異水平。統(tǒng)計方法：Wilcoxon rank sum test。

從TCGA數(shù)據(jù)庫下載并整理TCGA-BRCA（乳腺浸潤癌）項(xiàng)目STAR流程的RNAseq數(shù)據(jù)并提取TPM格式的數(shù)據(jù)以及臨床數(shù)據(jù)。使用R語言的survival包進(jìn)行比例風(fēng)險假設(shè)檢驗(yàn)并進(jìn)行擬合生存回歸，結(jié)果用survminer包以及ggplot2包進(jìn)行可視化，分析不同蛋白表達(dá)的生存預(yù)后情況。統(tǒng)計方法：Log rank檢驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

MCF7細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)前期購自美國ATCC細(xì)胞庫，于-80℃冰箱超低溫保存。MCF7細(xì)胞用含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基（DMEM）培養(yǎng)，置于含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，用0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代。敲低質(zhì)粒（shSHMT2#1和#2）和高表達(dá)質(zhì)粒（Flag-SHMT2、HA-HAX1）均購自中國吉凱基因公司。在MCF7細(xì)胞生長進(jìn)入對數(shù)期后，用TurboFect試劑轉(zhuǎn)染敲低或高表達(dá)質(zhì)粒，孵育48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞侵襲能力檢測

將Transwell小室用不含血清的DMEM培養(yǎng)基激活后置于24孔板中。吸除培養(yǎng)基后在小室上層加入50 μl基質(zhì)膠，靜置30 min。將消化處理后的不同組細(xì)胞用不含血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，稀釋細(xì)胞并調(diào)整其含量。吸200 μl細(xì)胞懸液（約2萬個細(xì)胞），加入Transwell小室上層，在小室下方培養(yǎng)孔內(nèi)加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，靜置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h。去除培養(yǎng)基后加入4%多聚甲醛固定小室15 min，繼而用龍膽紫染色液染色20 min，用ddH2O沖洗凈后自然晾干。將小室內(nèi)側(cè)面擦凈后將其置于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，每組選取5個視野來計細(xì)胞數(shù)目并取平均值。重復(fù)3次后選取平均值。

1.5 細(xì)胞遷移能力檢測

吸200 μl不同組細(xì)胞懸液（約2萬個細(xì)胞），加入已激活的Transwell小室上層，在小室下方培養(yǎng)孔內(nèi)加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，靜置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h。去除培養(yǎng)基后加入4%多聚甲醛固定小室15 min，繼而用龍膽紫染色液染色20 min，用ddH2O沖洗凈后自然晾干。將小室內(nèi)側(cè)面擦凈后將其置于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，每組選取5個視野來計細(xì)胞數(shù)目并取平均值。重復(fù)3次后選取平均值。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

將預(yù)處理后的細(xì)胞置于6孔板中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至95%融合度時，使用10 μl移液管進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)。同時更換培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基。應(yīng)用絲裂霉素（1 μg/ml）抑制癌細(xì)胞增殖。采用倒置顯微鏡在0～24 h不同時間點(diǎn)記錄劃痕距離的變化。

1.7 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)

將處理后的細(xì)胞在冰上用NP40裂解液裂解15 min，然后在4℃低溫離心機(jī)12 000 r/min離心10 min，收集上清液并測蛋白濃度。用預(yù)制備的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（Tris-HCL-SDSPAGE）電泳分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜與一抗（稀釋1:1000）在4℃孵育過夜，用TBST洗滌后用二抗常溫孵育膜1 h。采用化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白表達(dá)水平。

1.8 蛋白質(zhì)免疫共沉淀

將相應(yīng)抗體用蛋白L磁珠（貨號：HY-K0205,MCE）處理2 h，HEK293T細(xì)胞裂解液與預(yù)處理磁珠在4℃孵育過夜。獲取磁珠后進(jìn)行蛋白印跡分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS20.0軟件和GraphPad Prism9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。兩組間差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SHMT2在乳腺癌組織的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系

通過對TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)在浸潤性乳腺癌的癌組織中SHMT2表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織（P＜0.001），見圖1A，進(jìn)而通過相關(guān)預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，SHMT2高表達(dá)組的5年疾病特異性生存率和總生存率均顯著低于SHMT2低表達(dá)組（均P＜0.001），見圖1B、1C。這就說明SHMT2表達(dá)與浸潤性乳腺癌的不良預(yù)后密切相關(guān)，提示可能起到癌基因作用。

圖1 SHMT2在乳腺癌中的表達(dá)(A)及其與預(yù)后的相關(guān)性(B, C)Figure 1 Expression level of SHMT2 in breast cancer(A) and its correlation with prognosis(B, C)

2.2 敲低SHMT2可降低MCF7細(xì)胞的侵襲能力

在MCF7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染shNC對照質(zhì)?；騭hSHMT2低表達(dá)質(zhì)粒，用Transwell小室法檢測發(fā)現(xiàn)敲低SHMT2可顯著降低MCF7細(xì)胞的侵襲能力（t=5.375,P=0.0058），見圖2。

圖2 敲低SHMT2對MCF7細(xì)胞侵襲能力的影響Figure 2 Effect of SHMT2 knockdown on invasion ability of MCF7 cells

2.3 敲低SHMT2可降低MCF7細(xì)胞的遷移能力

在MCF7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染shNC對照質(zhì)?；騭hSHMT2低表達(dá)質(zhì)粒，用Transwell小室法進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)敲低SHMT2可顯著降低MCF7細(xì)胞的遷移能力（t=6.274,P=0.0033），見圖3。

圖3 敲低SHMT2對MCF7細(xì)胞遷移能力的影響Figure 3 Effect of SHMT2 knockdown on migration ability of MCF7 cells

2.4 SHMT2結(jié)合并上調(diào)HAX1蛋白

為了進(jìn)一步明確SHMT2調(diào)控乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移變化的分子機(jī)制，本研究發(fā)現(xiàn)在蛋白免疫共沉淀中用SHMT2作為誘餌蛋白，SHMT2能夠與HAX1相互結(jié)合，見圖4A。進(jìn)一步在MCF7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染shNC對照質(zhì)粒、shSHMT2#1或shSHMT2#2低表達(dá)質(zhì)粒，通過蛋白印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲低SHMT2可降低HAX1的蛋白水平，見圖4B。這些結(jié)果說明，SHMT2能夠結(jié)合HAX1蛋白并上調(diào)其蛋白水平。

圖4 SHMT2蛋白結(jié)合(A)并下調(diào)(B)HAX1蛋白Figure 4 SHMT2 protein bound to(A) and down-regulated(B) HAX1 protein

2.5 SHMT2對MCF7細(xì)胞遷移能力的調(diào)控

為了進(jìn)一步驗(yàn)證SHMT2調(diào)控乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力是否依賴于HAX1通路，本研究設(shè)計了相關(guān)逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)。將MCF7細(xì)胞分為三組，即shNC對照組、shSHMT2敲低組、shSHMT2+HA-HAX1回復(fù)組，轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒后通過Transwell小室實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲低SHMT2對MCF7細(xì)胞遷移能力的抑制作用可被高表達(dá)HAX1逆轉(zhuǎn)（t=6.274,P=0.0033;t=8.041,P=0.0013），見圖5A。繼而用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)可以得到類似結(jié)果（t=6.943,P=0.0023;t=5.654,P=0.0048），見圖5B。這就意味著，SHMT2對MCF7細(xì)胞遷移能力的促進(jìn)作用是依賴于HAX1蛋白的。

2.6 SHMT2抑制劑（SHIN1）對MCF7細(xì)胞遷移能力的作用

SHIN1是SHMT1/2特異性抑制劑，可抑制SHMT2相關(guān)功能。本研究為了在細(xì)胞水平驗(yàn)證SHIN1是否能抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力，將MCF7細(xì)胞分為三組，即Vector空載對照組、Flag-SHMT2高表達(dá)組、Flag-SHMT2+SHIN1抑制劑組，對不同組進(jìn)行處理后通過Transwell小室實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SHMT2高表達(dá)可明顯增加MCF7細(xì)胞遷移能力，而加入SHMT2抑制劑（SHIN1, 10 nmol/L）后可顯著抑制細(xì)胞遷移能力（t=10.16,P=0.0005；t=8.741,P=0.0009），見圖6A。繼而用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)可以得到類似結(jié)果（t=4.416,P=0.0115;t=6.091,P=0.0037），見圖6B。

3 討論

越來越多的研究表明，SHMT2蛋白在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[11]。Li等研究表明，在MDA-MB-231細(xì)胞系中，某些細(xì)胞亞群中與SHMT2相關(guān)的一碳代謝活性升高，其轉(zhuǎn)移潛能也顯著增加。敲低SHMT2表達(dá)可有效抑制體外轉(zhuǎn)移性亞克隆的增殖水平。此外，在動物模型中進(jìn)一步驗(yàn)證了抑制SHMT2引起的代謝重編程會降低癌細(xì)胞增殖能力[12]。一項(xiàng)研究表明，在128例乳腺癌病例中檢測發(fā)現(xiàn)，SHMT2蛋白表達(dá)與腫瘤的侵襲性（TNM分期和Elson分級）呈劑量依賴性相關(guān)。分層分析結(jié)果表明，SHMT2有助于預(yù)測患者的預(yù)后，尤其是在雌激素受體（ER）陰性的乳腺癌患者中[13]。本研究中，我們通過數(shù)據(jù)分析驗(yàn)證了SHMT2在乳腺癌癌組織中蛋白表達(dá)顯著高于相應(yīng)的癌旁組織，而且SHMT2高表達(dá)與乳腺癌的不良預(yù)后密切相關(guān)。從而在組織及臨床水平驗(yàn)證了SHMT2與乳腺癌的相關(guān)性，可能在疾病發(fā)生發(fā)展過程中起致癌作用。

最近有研究發(fā)現(xiàn)SHMT2過表達(dá)與乳腺癌的臨床治療耐藥相關(guān)。在拉帕替尼治療過程中，SHMT2升高的細(xì)胞可以減輕活性氧(ROS)的毒性作用，更容易在治療中存活下來[14]。此外，通過上調(diào)抗氧化酶HMOX1、SHMT2和SLC7A11的表達(dá)，乳腺癌細(xì)胞通過EIF2AK3/EIF2AK4-pEIF2S1-ATF4軸表現(xiàn)出對紫杉醇的耐藥性[15]?？傊?，這些結(jié)果表明SHMT2可能是一個有價值的乳腺癌預(yù)后生物標(biāo)志物。

本研究中，我們進(jìn)一步通過相關(guān)細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SHMT2在乳腺癌MCF7細(xì)胞系中可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲遷移。為了研究其具體分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過蛋白免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)探索SHMT2可能的下游作用靶點(diǎn)。HS-1-相關(guān)蛋白X-1（HAX1）是最初被鑒定為一個35 kDa的蛋白，與Src激酶底物HS-1相互作用，并被認(rèn)為參與B細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[16]。HAX-1參與抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞遷移，這是腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過程，提示在腫瘤中可能發(fā)生HAX-1過表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞存活和增強(qiáng)惡性細(xì)胞的侵襲能力[17-18]。我們通過免疫共沉淀法發(fā)現(xiàn)SHMT2和HAX1可以相互結(jié)合，而且通過轉(zhuǎn)染shSHMT2低表達(dá)質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)敲低SHMT2可降低HAX1蛋白表達(dá)水平。在MCF7細(xì)胞系中敲低SHMT2同時高表達(dá)HAX1，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)HAX1可逆轉(zhuǎn)敲低SHMT2對腫瘤細(xì)胞遷移能力的促進(jìn)作用。進(jìn)而驗(yàn)證了SHMT2可通過結(jié)合并上調(diào)HAX1表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移。在Transwell小室實(shí)驗(yàn)中我們進(jìn)一步驗(yàn)證了SHMT2抑制劑可顯著降低MCF7乳腺癌細(xì)胞的遷移能力。

本研究通過生物信息學(xué)分析和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SHMT2是乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子，并發(fā)現(xiàn)了SHMT2-HAX1信號軸在相關(guān)調(diào)控中的關(guān)鍵作用，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究了SHMT2抑制劑對乳腺癌轉(zhuǎn)移的治療潛力，為乳腺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子調(diào)控提供了新的線索和思路，為其臨床治療提供了潛在的干預(yù)靶點(diǎn)。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。