固相萃取技術(shù)在水果氨基酸分析前處理中的應(yīng)用
——一個(gè)儀器分析綜合實(shí)驗(yàn)

李積慧，韓健，陳建新

河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，天津 300401

高等教育是國(guó)家教育體系改革的助推器與學(xué)術(shù)創(chuàng)新的動(dòng)力與源泉[1]。教育部“化學(xué)類(lèi)本科教育質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)”將培養(yǎng)具有創(chuàng)新意識(shí)和實(shí)踐能力的專(zhuān)業(yè)人才作為人才培養(yǎng)目標(biāo)，將培養(yǎng)學(xué)生的動(dòng)手能力、科學(xué)素養(yǎng)與創(chuàng)新能力為目的的實(shí)驗(yàn)教學(xué)作為支撐目標(biāo)實(shí)現(xiàn)的關(guān)鍵[2]。為響應(yīng)國(guó)家人才發(fā)展戰(zhàn)略，開(kāi)展結(jié)合科學(xué)探究的綜合性化學(xué)實(shí)驗(yàn)成為化學(xué)教育工作者的努力方向[3-5]。

儀器分析是一門(mén)實(shí)踐性很強(qiáng)的課程。傳統(tǒng)的儀器分析以理論教學(xué)為主，配合相應(yīng)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，促進(jìn)學(xué)生對(duì)理論知識(shí)的理解。通常驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)對(duì)象簡(jiǎn)單，不涉及樣品前處理，與實(shí)際應(yīng)用有明顯差距。為構(gòu)建理論到實(shí)踐的橋梁，綜合性探究實(shí)驗(yàn)被引入實(shí)驗(yàn)教學(xué)[6-8]。通過(guò)綜合實(shí)驗(yàn)，學(xué)生可以全面了解儀器分析從樣品采集、樣品前處理、定量分析到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理整個(gè)分析過(guò)程，并在解決問(wèn)題的實(shí)踐中培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度和綜合思維能力。

1 實(shí)驗(yàn)背景

為更好理解儀器分析的原理及其實(shí)際應(yīng)用，設(shè)計(jì)了氨基酸分析儀分析水果中游離氨基酸的綜合性實(shí)驗(yàn)，涉及水果中氨基酸的提取、富集、提取液脫色以及氨基酸測(cè)定等。本文以歐李鮮果為例，培養(yǎng)學(xué)生利用儀器分析解決實(shí)際問(wèn)題的能力。歐李是我國(guó)北方特有的薔薇科櫻桃屬灌木果樹(shù)[9]。歐李果中含有多種微量氨基酸和維生素，用于果酒釀制具有特別的風(fēng)味。同時(shí)，新鮮的歐李果漿液呈寶石紅色，是天然紅色素的重要來(lái)源[10]。利用色譜理論分析歐李果中多種游離氨基酸，需避免色素在儀器分析柱上的附著及對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。因此，樣品中氨基酸分析過(guò)程中氨基酸提取、富集、色素去除決定了整個(gè)分析的準(zhǔn)確度及工作效率。

2 教學(xué)目標(biāo)與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在掌握分析化學(xué)、物理化學(xué)以及樣品前處理知識(shí)的基礎(chǔ)上，儀器分析綜合實(shí)驗(yàn)面向本校應(yīng)用化學(xué)專(zhuān)業(yè)大三本科生開(kāi)設(shè)。實(shí)驗(yàn)安排12個(gè)學(xué)時(shí)，分為三個(gè)模塊，涉及氨基酸理化性質(zhì)、色譜分離理論、固相萃取、光譜分析等知識(shí)。實(shí)驗(yàn)的教學(xué)目標(biāo)為：

(1) 通過(guò)氨基酸的提取及樣品前處理實(shí)驗(yàn)鞏固學(xué)生色譜理論及樣品前處理知識(shí)，幫助學(xué)生了解儀器分析的全過(guò)程；

(2) 以實(shí)際樣品為例提高學(xué)生利用色譜知識(shí)解決實(shí)際問(wèn)題的能力，培養(yǎng)學(xué)生的動(dòng)手能力和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度；

(3) 在解決樣品凈化、富集等問(wèn)題的過(guò)程中培養(yǎng)學(xué)生的綜合思維能力和科學(xué)素養(yǎng)。

為實(shí)現(xiàn)教學(xué)目標(biāo)，實(shí)驗(yàn)按照“樣品準(zhǔn)備-氨基酸提取-樣品脫色-氨基酸分析-實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理”流程設(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，并將實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)、知識(shí)運(yùn)用以及學(xué)生能力培養(yǎng)相關(guān)聯(lián)。三者關(guān)系見(jiàn)表1。

3 實(shí)驗(yàn)原理

實(shí)驗(yàn)以色譜分離理論為基礎(chǔ)，用氨基酸分析儀測(cè)定歐李果中多種微量氨基酸。氨基酸分析前的提取、富集、脫色決定了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性及工作效率。學(xué)生通過(guò)文獻(xiàn)查閱，選擇固相萃取技術(shù)作為歐李果中氨基酸測(cè)定前的處理方法。固相萃取是一種現(xiàn)代樣品前處理技術(shù)，具有綠色、高效的特點(diǎn)[11-13]。固相萃取技術(shù)基于固定相與樣品各組分間作用力不同實(shí)現(xiàn)樣品中不同組分分離，從而達(dá)到樣品中目標(biāo)分析物與干擾組分分離的目的。為幫助學(xué)生更好地理解色譜分離及固相萃取理論，實(shí)驗(yàn)選取強(qiáng)陰、陽(yáng)離子、弱陰離子、弱極性及非極性固定相，考察不同極性的固相萃取柱與歐李色素及氨基酸間的不同作用，選取合適的固相萃取柱，去除色素干擾，保證氨基酸準(zhǔn)確測(cè)定。

4 實(shí)驗(yàn)部分

4.1 儀器與試劑

全自動(dòng)氨基酸分析儀(L-8900，日本Hitachi)、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-2700，日本島津)、高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma3-18K)、固相萃取裝置(VAC ELUT SPS 24，美國(guó)Varian)、XW-80A渦旋混合儀、SHA-B數(shù)顯水浴恒溫振蕩器、101-1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱、超聲波清洗器、電熱恒溫水浴鍋、勻漿機(jī)、電子分析天平、微波爐(800 W)。

無(wú)水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、甲醇、5-磺基水楊酸、納米羥基磷灰石等試劑均為分析純；高純氮(天津永騰氮?dú)鈴S)；茚三酮、乙二醇甲醚、冰乙酸、醋酸鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、無(wú)水乙醇、氯化鈉、氫氧化鈉等試劑均為色譜純，用于氨基酸分析儀的流動(dòng)相制備。同時(shí)實(shí)驗(yàn)用到多種不同極性的固相萃取柱。

4.2 樣品中游離氨基酸的提取

4.2.1 樣品準(zhǔn)備

將歐李果洗凈，吸干表面水分、去核。稱(chēng)重后倒入勻漿機(jī)中，加等量的水勻漿1 min，得到均勻的果肉漿液，倒入燒杯，封膜保存，冷藏備用。

4.2.2 游離氨基酸提取條件選擇

準(zhǔn)確稱(chēng)取準(zhǔn)備好的歐李漿液約10 g，放入不同錐形瓶中，分別以HCl (0.1 mol·L-1)、水、乙醇(體積比1 : 1)為提取液，水浴振蕩、超聲、微波三種方式考察果漿中的游離氨基酸的提取方法。提取流程及條件見(jiàn)圖1。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比，確定歐李果中氨基酸的提取方法及溶劑。

圖1 歐李中氨基酸的提取過(guò)程

4.2.3 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(2.5000 mmol·L-1)用0.02 mol·L-1的鹽酸分別稀釋成0.0100、0.0250、0.0500、0.0750、0.1000、0.1250 mmol·L-1的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，用氨基酸分析儀分離測(cè)定，得到十七種氨基酸不同濃度下的峰面積。

4.3 樣品脫色處理

歐李氨基酸分析過(guò)程中，果肉的紅色素干擾實(shí)驗(yàn)測(cè)定。為考察不同固相萃取柱對(duì)水果提取液中氨基酸的凈化作用，選擇強(qiáng)陽(yáng)離子固相萃取柱(Waters Oasis Max Part)、強(qiáng)陰離子固相萃取柱(Waters Oasis Mcx Part)、弱陰離子固相萃取柱(AccuBond SPE AMIno cartridges)、弱極性氧化鋁柱(DIKMA ProElut AL-A)、弗羅里硅土柱(AccuBond SPE FLORISIL cartridges)、硅膠柱(DIKMA ProElut SI)、非極性C18柱(AccuBond SPE ODS-C18cartridges)、活性炭柱以及自制納米羥基磷灰石柱等九種固相萃取柱作為歐李氨基酸分析的前處理工具(依次編號(hào)1-9)。實(shí)驗(yàn)前學(xué)生需確定上述固相萃取柱固定相的官能團(tuán)，了解氨基酸與歐李色素的結(jié)構(gòu)。采用色素保留模式，考察離子交換、弱極性、非極性作用對(duì)歐李果肉色素的去除及氨基酸測(cè)定的影響。通過(guò)實(shí)驗(yàn)幫助學(xué)生理解不同分子間作用力對(duì)色素的去除能力。

4.3.1 固相萃取柱篩選

(1) 準(zhǔn)確移取2 mL上述的歐李提取液，分別加樣到已活化的不同極性固相萃取柱；

(2) 收集濾液，比色，初步篩選出濾液為無(wú)色的固相萃取柱用于歐李果中氨基酸測(cè)定前的凈化；

(3) 篩選出的固相萃取柱用于氨基酸加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，考察其對(duì)氨基酸測(cè)定的影響。選擇氨基酸回收率高又具有色素去除能力的固相萃取柱用作歐李果中氨基酸分析前處理工具。

4.3.2 氨基酸回收率實(shí)驗(yàn)

(1) 上述初篩出的固相萃取柱活化，4 mL低濃度氨基酸標(biāo)液(0.0200 mmol·L-1)上樣，收集萃取液過(guò)濾(0.22 μm)，用氨基酸分析儀測(cè)試經(jīng)固相萃取柱處理后氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的回收率。

(2) 選擇氨基酸回收率高的固相萃取柱進(jìn)一步考察其對(duì)中濃度(0.0500 mmol·L-1)、高濃度(0.1000 mmol·L-1)氨基酸的回收率。

4.3.3 固相萃取柱脫色能力考察

選擇氨基酸回收率高的固相萃取柱進(jìn)一步考察其脫色能力。準(zhǔn)確移取2 mL上述歐李提取液用于固相萃取處理，得到的萃取液用分光光度計(jì)作光譜掃描，比較歐李提取液經(jīng)不同固相萃取柱處理前后的光譜變化，從而判斷固相萃取柱的脫色能力。

5 結(jié)果與討論

5.1 氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的回歸曲線(xiàn)

由氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與峰面積線(xiàn)性回歸得到十七種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(圖2)。十七種氨基酸的線(xiàn)性回歸系數(shù)R在0.9978-0.9999之間，表明十七種氨基酸溶液在0.0100-0.1250 mmol·L-1濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性良好，可用于微量氨基酸的定量。實(shí)驗(yàn)幫助學(xué)生鞏固了儀器分析的外標(biāo)定量法及數(shù)據(jù)處理。

圖2 十七種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線(xiàn)

5.2 游離氨基酸提取結(jié)果比較

三種提取方式下，不同溶劑提取歐李中游離氨基酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。比較結(jié)果表明，振蕩、超聲提取法測(cè)得氨基酸的百分含量?jī)?yōu)于微波提取。由于部分氨基酸在乙醇中的溶解度較差，水、鹽酸(0.1 mol·L-1)為提取液，多數(shù)氨基酸的提取效果優(yōu)于乙醇提取液(乙醇與水的體積比為1 : 1)。綜合提取效果、溶劑成本、環(huán)境友好等因素，以水為提取溶劑，恒溫水浴振蕩作為歐李果肉中游離氨基酸的提取方式，保證游離氨基酸充分轉(zhuǎn)移到溶劑中。實(shí)驗(yàn)過(guò)程幫助學(xué)生理解樣品中氨基酸提取原則和方法選擇。

表2 不同提取條件下歐李果中氨基酸測(cè)定結(jié)果

5.3 固相萃取柱的選擇

5.3.1 固相萃取條件初篩

樣品溶液經(jīng)氧化鋁、弗羅里硅土及活性炭固相萃取柱處理后萃取液仍顯果肉提取液本來(lái)的寶石紅色。文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，歐李紅色素為水溶性、酸性條件穩(wěn)定的黃酮類(lèi)花色苷類(lèi)化合物[14]。盡管三種固定相均為多孔吸附材料，在酸性水溶劑條件下氧化鋁的羥基、弗羅里硅土的氧化鎂及硅羥基與中等極性色素間分子間作用力降低，非極性活性炭與極性色素分子間作用力弱，無(wú)法充分凈化樣品溶液。實(shí)驗(yàn)幫助學(xué)生直觀理解不同極性固定相與色素間的作用力不同以及溶劑極性在固相萃取過(guò)程的影響。

其余六種固相萃取柱處理后的歐李提取液為無(wú)色，其對(duì)色素的去除能力及對(duì)氨基酸測(cè)定的影響需通過(guò)儀器進(jìn)一步考察。

5.3.2 氨基酸回收率

為避免固相萃取處理對(duì)樣品氨基酸測(cè)定結(jié)果的影響，實(shí)驗(yàn)用具有色素吸附能力的六種固相萃取柱處理氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.0200 mmol·L-1)，根據(jù)氨基酸的回收率，判斷不同固相萃取柱對(duì)氨基酸測(cè)定結(jié)果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 氨基酸溶液經(jīng)不同固相萃取柱處理后的回收率

回收率結(jié)果表明，氨基酸混合液通過(guò)1、3、6號(hào)固相萃取柱的回收率明顯降低，通過(guò)2、7、9號(hào)柱回收率較高。根據(jù)固相萃取理論，學(xué)生們共同探討產(chǎn)生上述結(jié)果的原因，總結(jié)如下：酸性條件下氨基酸的氨基官能團(tuán)帶正電荷(-NH3+)，羧基(-COOH)基團(tuán)未解離。1號(hào)強(qiáng)陽(yáng)離子柱固定相在水溶劑中解離為帶負(fù)電荷的磺酸根離子(-SO3-)，與氨基酸分子間形成靜電作用，多種氨基酸被固相萃取柱保留；3號(hào)柱固定相的氨基官能團(tuán)與帶正電荷的氨基酸官能團(tuán)形成氫鍵，部分氨基酸與固相萃取柱間較強(qiáng)作用力導(dǎo)致其無(wú)法完全流出固相萃取柱；6號(hào)硅膠柱的硅羥基與氨基酸形成氫鍵，同樣不利于氨基酸流出固相萃取柱，導(dǎo)致氨基酸的回收率偏低。相反，2號(hào)陰離子柱固定相在水溶液中解離為帶正電荷的季銨鹽，與帶正電的氨基酸分子間存在靜電斥力，氨基酸在該柱上幾乎不保留，經(jīng)該固相萃取柱處理的十七種氨基酸回收率均在95.47%-100.82%范圍內(nèi)；7號(hào)C18柱的非極性固定相與氨基酸極性官能團(tuán)間弱相互作用，對(duì)氨基酸測(cè)定影響??；9號(hào)強(qiáng)堿磷灰石柱固定相的層狀結(jié)構(gòu)及少量羥基與氨基酸官能團(tuán)有氫鍵作用，氨基酸通過(guò)該固相萃取柱的回收率低于2號(hào)柱及7號(hào)柱。實(shí)驗(yàn)表明2號(hào)強(qiáng)陰離子柱、7號(hào)C18固相萃取柱對(duì)氨基酸測(cè)定結(jié)果影響較小。

為進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)論，分別選擇中濃度(0.0500 mmol·L-1)、高濃度(0.1000 mmol·L-1)氨基酸混合標(biāo)樣，經(jīng)C18柱、強(qiáng)陰離子固相萃取柱及納米羥基磷灰石柱處理，中濃度十七種氨基酸的回收率范圍分別為99.16%-102.40%、97.97%-101.48%及92.38%-101.61%；高濃度氨基酸的回收率范圍分別為99.59%-103.86%、98.42%-101.57%及80.42%-96.69%。比較高、中、低濃度氨基酸回收率結(jié)果表明，C18柱與強(qiáng)陰離子固相萃取柱對(duì)十七種氨基酸的回收率均明顯高于納米羥基磷灰石固相萃取柱。前兩種固相萃取柱用于含氨基酸樣品前處理對(duì)測(cè)定結(jié)果影響較小。

5.4 固相萃取柱對(duì)色素的吸附

在保證固相萃取處理對(duì)氨基酸測(cè)定結(jié)果影響最小的前提下，考察其對(duì)歐李果色素的去除能力。在可見(jiàn)光區(qū)(360-800 nm)，歐李提取液經(jīng)三種固相萃取柱凈化后的吸收光譜與原溶液的吸收光譜比較見(jiàn)圖3。從下到上，強(qiáng)陰離子固相萃取柱處理后樣品溶液在可見(jiàn)光區(qū)無(wú)吸收，表明樣品中的紅色素被固相萃取柱完全去除；納米羥基磷灰石柱的脫色效果優(yōu)于C18固相萃取柱，溶液中仍有少部分色素殘留；C18固相萃取柱處理后樣品溶液的吸收光譜比原溶液的光譜有明顯下降，但仍有較強(qiáng)的吸收峰，表明該固相萃取柱不能充分凈化樣品中的色素。因此，選擇強(qiáng)陰離子固相萃取柱用于歐李溶液的前處理，既能保證氨基酸測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，又能徹底去除溶液中紅色素對(duì)測(cè)定的干擾。

圖3 經(jīng)不同固相萃取柱凈化后歐李提取液的吸收光譜圖

探究三種不同極性固相萃取柱對(duì)色素保留的原因，酸性條件下，強(qiáng)陰離子固定相的季銨鹽帶正電荷，與黃酮類(lèi)花色苷的多羥基形成強(qiáng)的氫鍵作用，從而充分富集歐李提取液中的紅色素；羥基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2)的羥基同樣能與色素的羥基形成氫鍵，但羥基磷灰石分子中羥基較少，與色素間作用力較弱，導(dǎo)致少量色素不能被固相萃取柱保留；而C18固相萃取柱為非極性固定相，在極性溶劑中與極性色素的芳香環(huán)間存在疏水作用，導(dǎo)致部分色素被保留，提取液中仍存在色素殘留。

5.5 實(shí)驗(yàn)收獲

通過(guò)歐李氨基酸分析綜合實(shí)驗(yàn)，學(xué)生了解了樣品分析的全過(guò)程，掌握了樣品分析前處理的基本原則——高回收率、過(guò)程簡(jiǎn)單、綠色環(huán)保。在固相萃取柱的選擇過(guò)程中，學(xué)生體驗(yàn)了不同極性固定相與氨基酸及色素分子間的庫(kù)侖力、氫鍵力、范德華力以及溶劑極性、pH對(duì)固相萃取分離的影響。實(shí)驗(yàn)鞏固了學(xué)生的色譜理論知識(shí)，確定了樣品氨基酸分析的凈化方法。通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較確定樣品中氨基酸的提取條件，培養(yǎng)了學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶W(xué)習(xí)態(tài)度和動(dòng)手能力。在探索樣品前處理方法的過(guò)程中，學(xué)生們分析問(wèn)題、解決問(wèn)題的綜合能力得到提高，達(dá)成了實(shí)驗(yàn)的教學(xué)目標(biāo)。儀器分析綜合實(shí)驗(yàn)的開(kāi)設(shè)，幫助學(xué)生理解和運(yùn)用分析化學(xué)理論知識(shí)，提升科學(xué)素養(yǎng)和實(shí)踐能力，為畢業(yè)論文開(kāi)展奠定了基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)設(shè)四年以來(lái)，學(xué)生獨(dú)立思考、解決問(wèn)題的能力得到明顯提高。

6 結(jié)語(yǔ)

儀器分析綜合實(shí)驗(yàn)是一次教學(xué)相長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，學(xué)生作為主體體驗(yàn)色譜分離理論與實(shí)際應(yīng)用的緊密聯(lián)系，提高了他們參與實(shí)驗(yàn)的積極性。教師在指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中感受到學(xué)生的學(xué)習(xí)主動(dòng)性和創(chuàng)新能力，認(rèn)識(shí)到給學(xué)生更多獨(dú)立思考空間的重要性。綜合實(shí)驗(yàn)過(guò)程是培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立思考和形成綜合性思維的過(guò)程，學(xué)生在實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用理論知識(shí)、提高實(shí)驗(yàn)技能使個(gè)人綜合能力得到提升。為更好實(shí)現(xiàn)教學(xué)目標(biāo)，教師需要盡可能挖掘身邊的實(shí)驗(yàn)素材，合理地設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)熱情，提升學(xué)生的綜合素質(zhì)。