線性泛素連接酶復(fù)合體與去線性泛素化酶在腫瘤中的研究進(jìn)展

方宇昕，李 育，劉寶姝，董國(guó)強(qiáng) （中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系, 上海200433）

翻譯后修飾（PTM）是在蛋白質(zhì)的氨基酸側(cè)鏈上共價(jià)結(jié)合化學(xué)小分子基團(tuán)的過(guò)程，能夠顯著改變蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、構(gòu)象，從而調(diào)節(jié)、豐富蛋白質(zhì)的功能。從細(xì)胞水平而言，信號(hào)蛋白快速而特異性的翻譯后修飾，能實(shí)現(xiàn)信號(hào)的準(zhǔn)確傳遞，引發(fā)轉(zhuǎn)錄與翻譯水平的適應(yīng)性改變，使細(xì)胞及時(shí)響應(yīng)外部環(huán)境變化信號(hào)，實(shí)現(xiàn)自身調(diào)節(jié)。泛素化修飾是一種重要的翻譯后修飾，其中的關(guān)鍵分子——泛素，是一種由76 個(gè)氨基酸構(gòu)成的在進(jìn)化上高度保守的蛋白質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量8.5kDa[1]。泛素分子與底物共價(jià)結(jié)合的過(guò)程即泛素化修飾，其能調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、DNA 損傷修復(fù)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程[2]。泛素系統(tǒng)的主要功能有兩個(gè)：一是通過(guò)靶向蛋白酶體降解底物或溶酶體降解底物，實(shí)現(xiàn)對(duì)錯(cuò)誤蛋白的調(diào)控；二是通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白-蛋白相互作用、定位及功能，以實(shí)現(xiàn)精細(xì)調(diào)控細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)[3]。這種功能上的多樣性與泛素化修飾過(guò)程中所能募集的不同類型泛素信號(hào)有關(guān)，根據(jù)泛素連接數(shù)目的不同，可分為單泛素化修飾和多聚泛素化修飾。在多聚泛素化修飾中，泛素鏈主要有8 種連接模式，其中7 種為泛素鏈內(nèi)賴氨酸（Lys）與泛素分子C 末端甘氨酸（Gly）相連的模式，賴氨酸連接位點(diǎn)包括Lys6、Lys11、Lys27、Lys29、Lys33、Lys48 和Lys63，目前研究較多的是Lys48 和Lys63 位的多聚泛素化修飾。Lys48 位的多聚泛素化修飾，其功能是作為蛋白酶體降解的信號(hào)，而Lys63 位的多聚泛素化修飾主要調(diào)控非降解功能，例如參與DNA 損傷修復(fù)、機(jī)體炎癥、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能[4-6]。其他賴氨酸位點(diǎn)的多聚泛素化修飾功能目前研究較少，但他們?cè)谥T如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等過(guò)程中，同樣是非常重要的胞內(nèi)信號(hào)[7]。剩下的一種連接模式是由一個(gè)泛素分子C 末端甘氨酸的羧基基團(tuán)，與另一泛素分子N 末端甲硫氨酸（Met1）的氨基基團(tuán)以肽鍵相連的模式，形成的是線性泛素鏈（Linear ubiquitin/Met1-linked ubiquitin chains/Met1-Ub）[8]。近年來(lái)的研究表明，線性泛素鏈在免疫信號(hào)調(diào)節(jié)、NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子激活及細(xì)胞凋亡等過(guò)程中能發(fā)揮強(qiáng)有力的調(diào)控作用。更有意義的是，多項(xiàng)研究表明線性泛素鏈信號(hào)的異常調(diào)節(jié)與免疫失調(diào)、腫瘤等人類疾病密切相關(guān)[8]（圖1）。本文將介紹線性泛素連接酶復(fù)合體（LUBAC）、去線性泛素化酶（OTULIN）及其與腫瘤的關(guān)系。

圖1 泛素化修飾及其功能

1 線性泛素連接酶復(fù)合體與腫瘤

LUBAC 是脊椎動(dòng)物中唯一發(fā)現(xiàn)的線性泛素連接酶，該復(fù)合體分子量約為600KDa，由三個(gè)蛋白構(gòu)成： HOIP（ HOIL-1-interacting protein， RNF31） 、HOIL-1（Heme-Oxidised IRP2 Ub Ligase-1，RBCK1）和 SHARPIN（ SHANK-Associated RH Domain Interacting Protein）（圖2）[9]。LUBAC 通過(guò)這3 部分結(jié)構(gòu)的多種分子內(nèi)相互作用維持穩(wěn)定，失去任何部分都會(huì)影響復(fù)合物的穩(wěn)定性并影響其細(xì)胞內(nèi)活性[8,10-11]。HOIP 與HOIL-1 同屬RBR（Really Interesting New Gene （RING）-in-between-RING）家族泛素連接酶，兩者協(xié)同調(diào)節(jié)LUBAC 的活性，盡管兩者都有E3 泛素連接酶活性，但只有HOIP 是主要的E3 泛素連接酶[12-13]。然而，HOIP 作為單體存在時(shí)，會(huì)通過(guò)RBR、PUB 結(jié)構(gòu)域間復(fù)雜的分子內(nèi)相互作用被自抑制[10-11,14]。HOIL-1 和SHARPIN在LUBAC 中起到輔助因子的功能，對(duì)HOIP 的活化至關(guān)重要，HOIL-1、SHARPIN 的類泛素結(jié)構(gòu)域（UBL），與HOIP 的泛素連接結(jié)構(gòu)域（UBA）結(jié)合，可以解除HOIP 的自抑制，促進(jìn)線性泛素鏈的聚集。HOIP 的RBR 結(jié)構(gòu)域是LUBAC 復(fù)合物的催化中心[15-16]，能通過(guò)特殊的RING-HECT 雜化反應(yīng)生成多聚泛素鏈[17-18]。在線性泛素化的過(guò)程中，HOIP 的RING1 結(jié)構(gòu)域會(huì)連接一個(gè)帶有泛素的E2，這一泛素供體通過(guò)瞬間形成硫酯鍵，被轉(zhuǎn)移到HOIP 的RING2 結(jié)構(gòu)域中半胱氨酸（CYS）885 位點(diǎn)。最后，泛素供體通過(guò)HOIP 的C 端線性泛素鏈決定域（LDD）與泛素受體結(jié)合，特異性地形成線性泛素鏈[17-19]。

圖2 HOIL-1、SHARPIN、HOIP、OTULIN 結(jié)構(gòu)示意圖

慢性炎癥、NF-κB 信號(hào)通路的激活與癌癥的發(fā)生、發(fā)展、耐藥息息相關(guān)[20]，YANG 等證實(shí)了LUBAC 活性的增強(qiáng)及表達(dá)上調(diào)，能通過(guò)影響NFκB 信號(hào)通路，促進(jìn)活化B 細(xì)胞樣彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤（ABC-DLBCL）的發(fā)生、發(fā)展[20]。罕見(jiàn)的HOIP 功能變體在ABC-DLBCL 患者中（突變率7.8%）較健康人群（突變率1.0%）增加了近8 倍，這種功能變體通過(guò)調(diào)節(jié)HOIP 的α 螺旋，增加了HOIP與HOIL-1 的相互作用，因而提升了LUBAC 的活性并激活NF-κB 信號(hào)通路[20]。同時(shí)，在B 細(xì)胞受體途徑（BCR）中，LUBAC 與CARD11/MALT1/BCL10 復(fù)合物的結(jié)合，對(duì)ABC-DLBCL 的生存有重要作用[20]。此外，JO 等證實(shí)，HOIP 的表達(dá)在ABC-DLBCL 細(xì)胞中有整體提升，其能夠阻止細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)NF-κB 信號(hào)通路并導(dǎo)致AID 介導(dǎo)的突變，以此促進(jìn)淋巴瘤的生成[21]。LUBAC 表達(dá)及活性的上調(diào)增強(qiáng)了BCR 介導(dǎo)的NF-κB 活性，并保護(hù)其免受基因毒性應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，以此促進(jìn)突變體細(xì)胞的聚集及淋巴瘤的生成[20-22]。SONG 等證實(shí)LUBAC 在ε 蛋白的作用下，能使NF-κB 重要調(diào)節(jié)因子NEMO 線性泛素化，可促進(jìn)NF-κB 的持續(xù)激活，從而導(dǎo)致雌激素陰性乳腺癌的發(fā)生[23]。以上研究表明LUBAC 介導(dǎo)的NF-κB 的活化可以成為多種腫瘤發(fā)生的一種途徑。JO 等還利用高通量篩選，獲得能夠特異性抑制LUBAC 活性的天然物質(zhì)——硫藤黃素，在小鼠移植瘤模型中能抑制腫瘤的生長(zhǎng)[21]。

LUBAC 介導(dǎo)的NF-κB 的激活是人類與小鼠腫瘤耐藥的關(guān)鍵因素。RUIZ 等人證明了人類與小鼠的肺鱗癌（LSCC）細(xì)胞中均存在LUBAC 表達(dá)水平的上調(diào)，這導(dǎo)致了腫瘤中線性泛素鏈的堆積以及NF-κB 活性的增強(qiáng)，從而導(dǎo)致對(duì)順鉑耐藥的產(chǎn)生[24]。利用LUBAC 的小分子抑制劑膠霉毒素，通過(guò)抑制LUBAC 的活性，降低NF-κB 的活性，能夠使LSCC 細(xì)胞重新對(duì)順鉑的治療變得敏感，半劑量的順鉑與膠霉毒素的聯(lián)合用藥，顯著抑制了腫瘤在小鼠體內(nèi)生長(zhǎng)，荷瘤小鼠的生存期明顯延長(zhǎng)，且未顯示出毒副作用[25]。同樣，HOIP 也被證實(shí)能夠在許多腫瘤株中誘導(dǎo)對(duì)順鉑耐藥的產(chǎn)生。MACKAY等發(fā)現(xiàn)低表達(dá)HOIP 的細(xì)胞會(huì)顯示出對(duì)順鉑的高度敏感性，這主要依賴于ATM 介導(dǎo)的DNA 損傷檢查點(diǎn)的激活，所導(dǎo)致的半胱氨酸蛋白酶8 與半胱氨酸蛋白酶3 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的增加。HOIP 表達(dá)量的降低能使對(duì)順鉑耐藥的卵巢癌細(xì)胞，重新恢復(fù)對(duì)順鉑的敏感性[26]。以上研究表明抑制LUBAC的活性在特定的腫瘤中，可能能夠直接或間接地成為有效治療手段?；贚UBAC 在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、耐藥過(guò)程中的重要作用，研究人員開(kāi)始了針對(duì)LUBAC 抑制劑的探索（圖3）。除了JO 等人報(bào)道的硫藤黃素，以及RUIZ 等人報(bào)道的膠霉毒素以外，JOHANSSON 等人利用基于片段的共價(jià)配體篩選技術(shù)，獲得了靶向LUBAC 催化亞基HOIP 活性位點(diǎn)半胱氨酸的抑制劑，并進(jìn)一步通過(guò)基于細(xì)胞的分析和化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，證明以環(huán)戊二烯吡啶醇衍生物為代表的一類化合物能有效地滲透到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，標(biāo)記并抑制HOIP 和NF-κB 的激活，這些化合物有潛力作為先導(dǎo)化合物，開(kāi)發(fā)選擇性探針，以研究LUBAC 生物學(xué)功能[27]。Virginia等人報(bào)告了一種基于MALDI-TOF 質(zhì)譜的無(wú)標(biāo)記高通量篩選方法，能檢測(cè)抑制劑對(duì)泛素E2 偶聯(lián)酶和E3 連接酶的抑制強(qiáng)度和特異性，并發(fā)現(xiàn)苯達(dá)莫司汀是潛在的LUBAC 抑制劑[28]。KATSUYA 等建立了由LUBAC 介導(dǎo)的線性泛素化的細(xì)胞非依賴實(shí)驗(yàn)，及以NF-κB 熒光素酶報(bào)告基因?yàn)榛A(chǔ)的基于細(xì)胞的LUBAC 實(shí)驗(yàn)，兩者構(gòu)成了高通量篩選平臺(tái)，以此發(fā)現(xiàn)LUBAC 抑制劑。篩選所得的化合物JTP-0819958 能選擇性作用于HOIP 催化結(jié)構(gòu)域的賴氨酸殘基，實(shí)現(xiàn)對(duì)LUBAC 活性的抑制，并在細(xì)胞水平降低LUBAC 介導(dǎo)的線性泛素鏈的生成與炎性細(xì)胞因子所導(dǎo)致的NF-κB 的激活[29]。KATSUYA等以JTP-0819958 為先導(dǎo)化合物，測(cè)得其LUBAC抑制活性IC50值為2.8 μmol/L，構(gòu)效關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)其中的α、β-不飽和酮結(jié)構(gòu)是活性必須基團(tuán)，能通過(guò)邁克爾加成反應(yīng)可逆抑制LUBAC 的活性，并由此設(shè)計(jì)合成了HOIPIN-2～8，最終發(fā)現(xiàn)HOIPIN-8有最強(qiáng)的LUBAC（IC50=11 nmol/L）、NF-κB 通路的抑制活性，其可能的作用位點(diǎn)同樣是HOIP 催化結(jié)構(gòu)域的賴氨酸殘基，HOIPIN-8 是已報(bào)道的最有效的LUBAC 抑制劑[30]。STRICKSON 等人發(fā)現(xiàn)NF-κB 抑制劑BAY 11-7 082 能通過(guò)使LUBAC 失活，發(fā)揮抗炎作用、誘導(dǎo)B 細(xì)胞淋巴瘤和白血病T細(xì)胞死亡，并阻止蛋白質(zhì)向DNA 損傷位點(diǎn)募集[31]。AGUILAR-ALONSO 等開(kāi)發(fā)了基于HOIP 的固定α 螺旋的多肽C-helix3，其能夠通過(guò)與HOIP 結(jié)合，阻斷HOIL-1 與HOIP 的相互作用，抑制LUBAC活性及功能，并實(shí)現(xiàn)降低細(xì)胞存活率、減少NFκB 信號(hào)通路的激活及其相關(guān)基因的產(chǎn)生[32]。雖然目前針對(duì)LUBAC 抑制劑的研究尚處于初級(jí)階段，但可以預(yù)見(jiàn)的是，通過(guò)抑制LUBAC 活性，影響機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，會(huì)成為當(dāng)前及今后腫瘤治療研究的新方向。

圖3 LUBAC 抑制劑結(jié)構(gòu)

2 去線性泛素化酶與腫瘤

OTULIN，是目前唯一能夠水解線性泛素鏈的哺乳動(dòng)物去泛素化酶，也被稱為Fam105b 或Gumby，由352 個(gè)氨基酸構(gòu)成，其擁有一段含Cys129/His339/Asn341 三分子催化中心的高度保守的OTU 結(jié)構(gòu)域[33-34]，該結(jié)構(gòu)域以底物輔助催化機(jī)制發(fā)揮功能，即OTULIN 僅在與線性泛素鏈作用時(shí)被激活[34]。OTULIN 的C 端是PDZ（PSD95-Dlg1-ZO-1）結(jié)構(gòu)域結(jié)合基序，N 端是PUB 相互作用基序（PIM），可與HOIP 的PUB 結(jié)構(gòu)域發(fā)生相互作用，發(fā)揮去線性泛素化酶的功能（圖2）[35-36]。OTULIN 能在不影響其他種類泛素鏈的情況下，專一性地水解線性泛素鏈，即使在高濃度OTULIN 情況下，也不會(huì)作用于與線性泛素鏈結(jié)構(gòu)高度相似的Lys63 連接模式的泛素鏈，其與線性泛素鏈的結(jié)合常數(shù)KD為20 nmol/L，與Lys63 連接的泛素鏈KD為12 μmol/L，兩者有超過(guò)100 倍的結(jié)合活性差[34]。OTULIN 同樣廣泛參與機(jī)體免疫、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個(gè)過(guò)程，OTULIN 的存在可以防止LUBAC 復(fù)合體的自身泛素化，以及線性泛素鏈在細(xì)胞內(nèi)的堆積[37-39]。此外OTULIN 在TNFα 與NOD2 響應(yīng)的刺激下，可以限制LUBAC 的活性以及NF-κB 通路的激活[39]。OTULIN 的N 端可通過(guò)與蓬亂蛋白2（DVL2）相互作用，與LUBAC 共同調(diào)節(jié)Wnt 信號(hào)通路[40]（圖4）。

圖4 LUBAC 與OTULIN 共同調(diào)控細(xì)胞內(nèi)線性泛素化過(guò)程示意圖

DAMGAARD 等揭示了OTULIN 在肝臟穩(wěn)態(tài)與病理狀態(tài)中的重要作用，作者構(gòu)建了肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)特異性敲除OTULIN 的（OtulinΔHEP）小鼠，該模型會(huì)自發(fā)產(chǎn)生諸如肝炎、肝細(xì)胞凋亡、代償性的肝細(xì)胞增生等癥狀，并導(dǎo)致脂肪性肝炎、肝纖維化以及肝細(xì)胞癌（HCC）。Fas 相關(guān)死亡域（FADD）基因的消除能挽救這一過(guò)程，敲入未激活的受體相互作用蛋白激酶1（RIPK1）同樣能防止小鼠患上肝臟疾病，這也進(jìn)一步證明了缺失OTULIN 的肝細(xì)胞的凋亡，是引發(fā)肝臟疾病的關(guān)鍵，OTULIN 在肝臟中能預(yù)防慢性肝炎及肝細(xì)胞癌，起到關(guān)鍵的保護(hù)作用[41]。同樣，HOSTE 等證實(shí)了OTULIN 在維持皮膚穩(wěn)態(tài)、防止疣狀癌的發(fā)生中也有重要作用。作者構(gòu)建了角質(zhì)細(xì)胞特異性缺失OTULIN 的小鼠（ΔKerOTULIN），該模型會(huì)自發(fā)產(chǎn)生炎癥性皮膚損傷并發(fā)展成疣狀癌。在缺失OTULIN 的角質(zhì)細(xì)胞中會(huì)顯示1 型干擾素與白細(xì)胞介素-1β 的響應(yīng)信號(hào)，從基因?qū)用婊蛩幬飳用嬉种七@些細(xì)胞因子可以一定程度抑制皮膚炎癥。此外，表達(dá)會(huì)引發(fā)人類OTULIN 相關(guān)自身炎癥綜合征（ORAS）的OTULIN 突變基因，會(huì)引發(fā)相類似的皮膚炎癥表型，以此證明OTULIN 在抑制皮膚炎癥、維持免疫穩(wěn)態(tài)、避免皮膚腫瘤發(fā)生中的重要價(jià)值[42]。

不同于OTULIN 在肝臟、皮膚中的保護(hù)作用，WANG 等證實(shí)OTULIN 在一定條件下參與腫瘤耐藥的形成。三陰性乳腺癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin 信號(hào)通路被異常激活，其在癌癥的發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥中發(fā)揮著重要作用。在化療過(guò)程中，基因毒性的治療會(huì)導(dǎo)致OTULIN56 位酪氨酸的磷酸化，使OTULIN從與HOIP 結(jié)合中被釋放，并增強(qiáng)OTULIN 與βcatenin 的相互作用，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路以一種OTULIN 依賴的方式被進(jìn)一步活化，誘導(dǎo)耐藥的產(chǎn)生。此外，作者還證明了抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路或OTULIN 能恢復(fù)三陰性乳腺癌移植瘤模型對(duì)化療藥物的敏感性并減少腫瘤的轉(zhuǎn)移[43]。同時(shí)，體內(nèi)OTULIN 水平較高的乳腺癌患者，表現(xiàn)出較低的總體生存率與無(wú)疾病生存期。由于Wnt/β-catenin信號(hào)通路在正常組織中廣泛存在，通過(guò)抑制OTULIN以克服腫瘤耐藥與轉(zhuǎn)移，是治療三陰性乳腺癌的一種新選擇。

3 總結(jié)與展望

線性泛素化修飾作為一種特殊的翻譯后修飾，由于其在細(xì)胞死亡、免疫信號(hào)調(diào)節(jié)及其他細(xì)胞重要功能中所發(fā)揮的作用，成為了近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。LUBAC 與OTULIN 在細(xì)胞內(nèi)可實(shí)現(xiàn)對(duì)線性泛素鏈信號(hào)的精細(xì)調(diào)節(jié)，而其異常表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致ORAS、腫瘤等嚴(yán)重疾病的發(fā)生。目前已能實(shí)現(xiàn)利用小分子化合物或多肽對(duì)LUBAC 的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)，但其具體作用機(jī)制仍有待深入闡明。以HOIPIN-8 為代表的高活性LUBAC 抑制劑（IC50=11 nmol/L）在體外展現(xiàn)出了較優(yōu)的抑制效果，然而，需開(kāi)展更為廣泛的體內(nèi)藥效與安全性實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證LUBAC 抑制劑的優(yōu)勢(shì)，以及LUBAC 作為腫瘤、炎癥等疾病治療靶點(diǎn)的潛在價(jià)值。對(duì)于OTULIN 而言，由于其在不同組織中廣泛的生理調(diào)控功能，未來(lái)針對(duì)OTULIN的研究重點(diǎn)，仍將停留在對(duì)其生理作用與機(jī)制的闡明。同時(shí)，目前尚無(wú)OTULIN 小分子配體或抑制劑的報(bào)道，因此，開(kāi)發(fā)精確調(diào)節(jié)OTULIN 活性的分子，實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)或疾病治療，也是未來(lái)極具價(jià)值的研究方向。