河豚毒素處方前初步研究

徐己人，鄭紫云，李 園，魯 瑩，儲智勇, （.上海海洋大學, 上海 006；.江蘇中洋集團股份有限公司, 江蘇 海安 6600；.海軍軍醫(yī)大學藥學系, 上海 004）

河豚毒素（TTX）屬于氨基全氫化喹唑啉化合物，分子式為C11H17O8N3，分子量為319。其分子結構類似于生物堿[1]，呈獨特的籠形，如圖1。河豚毒素粗品為黃褐色粉末，純品為白色晶體，呈弱堿性，容易潮解，微溶于水溶液，易溶于無機酸水溶液，且在弱酸條件下穩(wěn)定；對于熱不敏感，但在高溫下毒性會增強，強酸強堿條件下其結構可被破壞[2]。

圖1 河豚毒素結構式

河豚毒素是一種高效的神經類毒素，由于能夠特異性的阻斷Na+離子通道，進而產生麻痹作用，因此低濃度的河豚毒素被認為是一種優(yōu)良的神經類候選藥物，一直受到科研人員尤其是新藥研發(fā)人員的關注[3]。目前已有將河豚毒素作為止痛藥[4-5]和成癮戒斷藥[6]的相關探索和研究。由于河豚毒素在藥學領域有著廣闊前景，關于其藥學應用的研究報道逐年增多，但大多集中在分析方法[7]、藥理機制[8]或藥物載體研究[9]，對其可成藥性的相關研究報道較少。本文按照新藥研發(fā)要求，建立高效液相反相離子對色譜法，對河豚毒素在不同溶劑中的溶解性和不同pH 環(huán)境中的穩(wěn)定性進行考察，為河豚毒素的處方前研究積累數據，為其進一步臨床應用提供有力支撐。

1 材料

1.1 儀器

LC-2030C 高效液相色譜儀（日本島津制作所）；AL-104 電子天平（METTLER TOLEDO，瑞士）；數顯pH 計（sartorius，德國）；紫外可見分光光度計（安捷倫科技（中國）有限公司）；循環(huán)水式真空泵（上海豫康科教儀器設備有限公司）；SECURA125-1CN 型十萬分之一電子天平（賽多利斯，德國）；Arium@ mini 超純水機（賽多利斯，德國）。

1.2 試藥

河豚毒素原料藥（中洋生物科技江蘇有限公司，批號：20220089，含量88%）；河豚毒素對照品（泰州康特生物工程有限公司，批號：201206，含量≥99%）；磷酸、98%甲酸、檸檬酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、庚烷磺酸鈉、磷酸二氫銨、乙酸銨、鹽酸、30%H2O2和冰醋酸均為分析純試劑（國藥集團化學試劑有限公司）。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為Shim-pack GISI C18-AQ（4.6×250 mm，5 μm）；流動相為5 mmol/L 庚烷磺酸鈉-25 mmol/L磷酸二氫銨，等度洗脫；進樣量為10 μl；柱溫：25 ℃；流速1 ml/min；檢測波長為196 nm；檢測時長為40 min。

2.2 對照品儲備液的制備

取TTX 對照品適量，精密稱定，用0.1%磷酸溶液溶解并稀釋制成濃度為1.0 mg/ml 的TTX 對照品儲備液。

2.3 供試品儲備液的制備

取TTX 原料藥適量，精密稱定，用0.1%磷酸溶液溶解并稀釋制成濃度為1.0 mg/ml 的供試品儲備液。

2.4 溶解度試驗測試溶液的制備

按照《中國藥典》（2020 版）四部通則8 004 緩沖液配制方法，配制pH 值分別為3.5、4.5、5.0、6.5、7.0、7.4、8.0 的緩沖液[10]。稱取研成細粉的TTX 原料藥各2 mg，分別置于4 ml 不同pH 值的緩沖液（25±2 ℃）中，30 min 內每隔5 min 強力振搖30 s，觀察溶解情況，如無目視可見顆粒，視為完全溶解。如完全溶解則繼續(xù)加入研成細粉的TTX 原料藥，同法操作直至飽和，取適量經濾膜濾過，作為溶解度試驗測試溶液。

2.5 強酸與強堿破壞試驗測試溶液的制備

取研成細粉的TTX 原料藥約1 mg，置于10 ml容量瓶中，分別用0.1 mol/L 鹽酸和0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液溶解并定容，置于70 ℃下反應20 min。精密量取各反應溶液適量，冷卻至室溫，分別加入對應體積的0.1 mol/L 氫氧化鈉或0.1 mol/L 鹽酸進行中和并終止反應。取適量樣品經濾膜過濾后作為強酸與強堿破壞試驗測試溶液。

2.6 氧化破壞試驗測試溶液的制備

取研成細粉的TTX 原料藥約1 mg，置于10 ml容量瓶中，加入30% H2O2溶液溶解定容后，室溫反應10 min。精密量取反應溶液適量，經濾膜過濾，作為氧化破壞試驗測試溶液。

2.7 穩(wěn)定性試驗測試溶液的制備

取研成細粉的TTX 各適量，精密稱定，分別用PBS 緩沖液（pH 值=7.4）、0.1%甲酸溶液、0.1%檸檬酸溶液溶解，并稀釋制成濃度為0.1 mg/ml 的TTX 溶液，然后分別置于4 ℃、25 ℃、37 ℃中儲存，在第1、2、3、5、7、14、21、28 d 各取適量經濾膜過濾，作為溫度適應性測試溶液。

3 結果

3.1 方法學驗證結果

3.1.1 系統(tǒng)適用性

分別將對照品儲備液及供試品儲備液用0.1%磷酸溶液稀釋至0.1 mg/ml，作為對照品溶液和供試品溶液，按“2.1”項進行測試。如圖2 所示，TTX 的保留時間為22.665 min。理論板數為14 501，供試品溶液中主峰與鄰峰的分離度為6.4。結果表明，此色譜條件可以滿足TTX 相關測試要求。

圖2 TTX 對照溶液(A)與供試品溶液(B)的典型色譜圖

3.1.2 標準曲線

取對照品儲備液，用0.1%磷酸溶液配制濃度為4、10、20、40、80 μg/ml 的TTX 對照品測試溶液，按“2.1”項進行測試。以濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得回歸方程為Y=12 601.2X-2 263.69（r=0.999 9）。結果表明，TTX的濃度與峰面積在測試范圍內呈良好線性關系。

3.1.3 準確度與精密度

取對照品儲備液，用0.1%磷酸溶液分別稀釋至10、20、40 μg/ml 的溶液各3 份，按“2.1”項進行測試，計算其含量的平均值為101.000%，RSD 為0.60%，表明該方法準確度良好，滿足測試要求。

3.1.4 進樣重復性及穩(wěn)定性

取供試品溶液，按“2.1”項重復測試6 次，計算得到的RSD 為0.17%，表明該方法重復性良好。室溫分別放置0、2、4、6、8、10、12、24、48 h 后按“2.1”進行測試。計算得到的RSD 為1.48%，表明供試品溶液在48 h 內穩(wěn)定性良好。

3.2 溶解度及穩(wěn)定性考察結果

3.2.1 溶解度考察結果

由表1 結果可看出，TTX 幾乎不溶于堿性水溶液，但溶解度隨著pH 值降低而逐漸增大，易溶于pH 值為3.5 的酸性水溶液。

表1 TTX 在不同pH 值水溶液中的溶解度

3.2.2 破壞試驗結果

實驗結果表明，強堿對TTX 的破壞能力最強，在0.1mol/L 氫氧化鈉溶液中、70 ℃條件下反應20 min 后，TTX 被完全降解。強酸對TTX 的破壞能力次之，TTX 在70 ℃、0.1mol/L HCl 溶液中反應20 min 后的降解率為60.78%；氧化對TTX 的破壞能力相對最弱，在30% H2O2溶液中反應20 min后的降解率為17.06%。

3.2.3 穩(wěn)定性考察結果

不同介質、不同溫度條件下TTX 穩(wěn)定性試驗結果見圖3。當溶劑為pH 值=7.4 的PBS 溶液時，不同溫度下TTX 均表現出降解趨勢，在25 ℃與37 ℃條件下保存28 d 的TTX 溶液降解率均超過50%，在37 ℃時PBS 溶液中的TTX 降解率更高達88.07±0.27%，提示在后續(xù)劑型研究中，需注意TTX 在體外釋放液中的穩(wěn)定性。以0.1%甲酸溶液或0.1%檸檬酸溶液為溶劑的TTX 溶液則較為穩(wěn)定，在25 ℃和37 ℃下保存28 d 含量均未表現出顯著性變化。

圖3 TTX 在不同溫度、不同介質中的穩(wěn)定性(A.4 ℃條件下TTX 濃度變化趨勢；B.25 ℃條件下TTX 濃度變化趨勢；C.37 ℃條件下TTX 濃度變化趨勢)

4 討論

TTX 作為一種具有廣泛應用前景的潛在鎮(zhèn)痛藥物，其在藥理和作用機制方面的相關研究已有較多報道[11-13]，但對于其理化性質和成藥性研究的報道極少。本研究建立了高效液相反相離子對色譜法，測定TTX 在不同溶劑中的溶解性，并考察溫度、溶劑pH 值和氧化劑對其穩(wěn)定性的影響。實驗結果表明TTX 在酸性條件下具有較高的溶解度，前期試驗還表明TTX 不溶于乙醇，二氯甲烷等有機溶劑。穩(wěn)定性試驗結果顯示TTX 在強堿溶液中較不穩(wěn)定，實驗條件下20 min 即被強堿全部降解，而在酸性條件、氧化環(huán)境中較為穩(wěn)定。不同溫度穩(wěn)定性試驗結果同樣顯示，TTX 在0.1%甲酸或檸檬酸溶液中4 周內穩(wěn)定性均良好；而在pH 值=7.4 PBS 中降解較為迅速，即使在4 ℃條件下，pH 值=7.4 PBS 中28 d 的降解率仍然接近50%，37 ℃條件下28 d 降解率接近90%。研究結果可為TTX處方設計及制備工藝提供實驗依據，并提示研究者在開展TTX劑型研究和體外釋放研究時應重點關注其穩(wěn)定性和降解情況。