三斑海馬的化學(xué)成分研究

喬方良，夏天爽，張成中，蔣益萍，辛海量 （海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系：.生藥學(xué)教研室；.中藥鑒定教研室, 上海200433）

海馬為海龍科動(dòng)物線紋海馬（Hippocampus kelloggiJordan et Snyder） 、 刺海馬（H.histrixKaup）、大海馬（H.kudaBleeker）、三斑海馬（H.trimaculatusLeach）或小海馬（海蛆）（H.japonicusKaup）的干燥體。性溫，味甘、咸，歸肝、腎經(jīng)，具有溫腎壯陽(yáng)，散結(jié)消腫的功效[1]?，F(xiàn)代研究表明，海馬含有氨基酸、甾體、脂肪酸、微量元素和磷脂等化學(xué)成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、性激素樣作用和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種藥理活性[2]。目前，我國(guó)中藥材市場(chǎng)上的海馬品種眾多，且不同品種的海馬化學(xué)成分和藥理作用存在差異，因此深入研究不同品種海馬的外觀及內(nèi)在差異，使海馬資源得到合理利用顯得十分重要。何旭輝等[3]發(fā)現(xiàn)不同品種海馬在鰓蓋的嵴紋和頭冠處有較明顯的區(qū)別，使用微性狀鑒別法能夠簡(jiǎn)單快捷的區(qū)分出不同品種的海馬。陳璐[4]通過(guò)海馬的本草考證、鑒別及藥用品種、化學(xué)成分檢查項(xiàng)等研究，建立了穩(wěn)定可控的海馬質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，為《中國(guó)藥典》中海馬內(nèi)容的補(bǔ)充提供了參考依據(jù)。閆珍珍等[5]從營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能性成分方面分析，三斑海馬具有高蛋白、低脂肪的特征，且雌海馬氨基酸營(yíng)養(yǎng)價(jià)值優(yōu)于雄性；除尿苷含量低于雄性外，雌海馬的膽甾醇和次黃嘌呤含量均高于雄性，該研究發(fā)現(xiàn)為特異性開(kāi)發(fā)海馬產(chǎn)品提供了科學(xué)依據(jù)。陳夢(mèng)等[6]使用DNA 條形碼分子鑒定技術(shù)表明COI、16 S rRNA、ATP6 序列作為條形碼均可以鑒定三斑海馬及其他混偽品海馬藥材，為保障海馬臨床用藥安全提供了新的技術(shù)手段。三斑海馬作為我國(guó)較為常見(jiàn)的一種海馬，資源豐富，在浙江、廣東、海南等沿海地區(qū)均有分布[7]。為進(jìn)一步明確三斑海馬的化學(xué)成分，更合理地開(kāi)發(fā)利用海馬資源，本文以三斑海馬為研究對(duì)象，對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行研究，從三斑海馬乙醇提取物中分離鑒定了8 個(gè)化合物（圖1），分別為：L-苯丙氨酸（化合物1，圖1A）、丙氨酸（化合物2，圖1B）、肌苷（化合物3，圖1C）、膽固醇（化合物4，圖1D）、N-乙酰基酪胺（化合物5，圖1E）、尿嘧啶（化合物6，圖1F）、D-甘露醇（化合物7，圖1G）、河豚素（化合物8，圖1H）。其中，N-乙?；野?、D-甘露醇、河豚素為首次從三斑海馬中分離得到。

圖1 三斑海馬分離出的 8 種化合物結(jié)構(gòu)

1 材料和方法

1.1 樣品

實(shí)驗(yàn)用海馬藥材購(gòu)自安徽亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)海軍軍醫(yī)大學(xué)辛海量教授鑒定為海龍科動(dòng)物三斑海馬（Hippocampus trimaculatusLeach）的干燥體。

1.2 儀器與試劑

Bruker DRX-600 MHz 核磁共振儀（TMS 內(nèi)標(biāo)，德國(guó)Bruker 公司）；1 290 高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；柱層析硅膠、GF254薄層色譜硅膠（青島海洋化工廠）；Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠（GE Pharmacia 公司）；ACE 3 C18-PFP 色譜柱（3.0 mm×150 mm, 3.0 μm, 美國(guó)Agilent 公司）；其余試劑為分析純。

1.3 提取分離

干燥三斑海馬藥材1.74 kg，剪碎后10 倍量95%乙醇浸泡過(guò)夜，85 ℃加熱回流提取3 次，每次2 h，10 倍量70%乙醇加熱回流提取2 次，每次2 h，合并提取液，65 ℃減壓濃縮至無(wú)醇味。提取物經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次用石油醚、石油醚-乙酸乙酯(20:1、10:1、5:1)、乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇(10:1、5:1、1:1)、甲醇洗脫，薄層色譜檢測(cè)，合并相同流份后，得到H-1～H-9 共9 個(gè)組分。

H-1～H-3 組分合并后經(jīng)硅膠柱色譜（乙酸乙酯-甲醇 10:1、5:1、2:1）分離，葡聚糖凝膠柱色譜純化得到化合物1（11 mg）。H-4～H-6 組分合并，經(jīng)硅膠柱色譜（石油醚-乙酸乙酯 10:1、5:1、1:1）分離，合并較純斑點(diǎn)，再經(jīng)反相C18柱，葡聚糖凝膠柱色譜（40%甲醇）純化2 次，硅膠柱色譜分離得到化合物2 （19 mg）和 化合物3（39 mg）。H-7 和H-8 組分合并后甲醇溶解，溶解部分經(jīng)反相C18柱分離，收集7-1 至7-7 共7 個(gè)組分。7-1 經(jīng)硅膠柱色譜（乙酸乙酯-甲醇 1:1）分離，反相體系分離，葡聚糖凝膠柱色譜（40%甲醇）純化2 次，再經(jīng)硅膠柱色譜純化，培養(yǎng)結(jié)晶析出白色固體，得到化合物8（9 mg）。7-2 經(jīng)硅膠柱色譜（乙酸乙酯-甲醇1:1）分離，葡聚糖凝膠柱色譜(45%甲醇)純化2 次，得到化合物4（15 mg）和化合物5（7 mg）。7-4 經(jīng)硅膠柱色譜(乙酸乙酯-甲醇 1:1)分離，再經(jīng)反相C18柱色譜(10%甲醇)，葡聚糖凝膠柱色譜，硅膠柱色譜(二氯甲烷-甲醇 2:1)純化，得到化合物7（6 mg）。H-9 組分經(jīng)硅膠柱色譜（乙酸乙酯-甲醇1:1），反相C18柱色譜（10%甲醇），葡聚糖凝膠柱色譜分離后，合并較純斑點(diǎn)，析出固體過(guò)濾，得到化合物6（9 mg）。三斑海馬提取分離過(guò)程見(jiàn)圖2。

2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 為白色粉末，分子式為C9H11NO2。1H NMR (600 MHz, D2O)δ: 7.38 (2H, dd,J=7.4, 6.8 Hz, H-3', 5'), 7.33 (1H, t,J=6.9 Hz, H-4'), 7.27 (2H,dd,J=7.4, 6.8 Hz, H-2', 6'), 3.93 (1H, dd,J=7.9, 5.2 Hz, H-2), 3.24 (1H, m, H-3a), 3.06 (1H, m, H-3b);13C NMR (150 MHz, D2O)δ: 36.4 (C-3), 56.1 (C-2),127.7 (C-4′), 129.1 (C-3′, 5′), 129.4 (C-2′, 6′), 135.1(C-1′), 173.9 (C-1)。該化合物核磁共振數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[8]基本一致，確定化合物為L(zhǎng)-苯丙氨酸(Lphenylalanine)。

化合物2 為白色固體，分子式為C3H7NO2。1H NMR (600 MHz, D2O)δ: 3.70 (1H, q,J=6.4 Hz, H-2), 1.40 (3H, d,J=6.4 Hz, H-3);13C NMR (150 MHz,D2O)δ: 16.1 (C-3), 50.6 (C-2), 175.8 (C-1)。該化合物核磁共振數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[9]基本一致，確定化合物為丙氨酸(alanine)。

化合物3 為白色固體，分子式為C10H12N4O5。1H NMR (600 MHz, D2O)δ: 3.76 (1H, m, H-5'), 3.54(1H, m, H-5'), 4.21 (1H, m, H-3'), 4.36 (1H, m, H-2'),6.00 (1H, d,J=5.7 Hz, H-1'), 8.12 (1H, s, H-2), 8.24(1H, s, H-8);13C NMR (150 MHz, D2O)δ: 61.3 (C-5′), 70.4 (C-3′), 74.1 (C-2′), 85.5 (C-4′), 88.4 (C-1′),124.2 (C-5), 140.2 (C-2), 146.1 (C-8), 148.4 (C-4),158.4 (C-6)。該化合物核磁共振數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[10]基本一致，確定化合物為肌苷(inosine)。

化合物4 為針狀結(jié)晶，分子式為C27H46O。1H NMR (600 MHz, CDCl3)δ: 5.37 (1H, m, H-6), 3.55(1H, m, H-3), 0.68 (3H, s, H-18);13C NMR (150 MHz, CDCl3)δ: 11.9 (C-18), 18.7 (C-21), 19.4 (C-19), 21.1 (C-11), 22.5 (C-26), 22.8 (C-27), 23.8 (C-15), 24.3 (C-23), 28.0 (C-25), 28.2 (C-12), 29.7 (C-2), 31.7 (C-8), 31.9 (C-7), 35.8 (C-20), 36.2 (C-22),36.5 (C-10), 37.3 (C-1), 39.5 (C-24), 39.8 (C-16),42.3 (C-13), 42.3 (C-4), 50.2 (C-9), 56.2 (C-17), 56.8(C-14), 71.8 (C-3), 121.7 (C-6), 140.8 (C-5)。該化合物核磁共振數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[11]基本一致，確定化合物為膽固醇(cholesterol)。

化合物5 為褐色固體，分子式為C10H13NO2。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ: 6.96 (2H, d,J=1.8 Hz, H-2, 6), 6.68 (2H, d,J=1.8 Hz, H-3, 5), 2.73 (2H,m, H-8), 2.55 (2H, m, H-7), 1.74 (3H, s, CH3);13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ: 24.6 (CH3), 38.2 (C-7), 43.6 (C-8), 115.6 (C-3, 5), 129.8 (C-2, 6), 156.4(C-4), 176.7 (C-10)。該化合物核磁共振數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[12]基本一致，確定化合物為N-乙酰基酪胺(N-acetyltyramine)。

化合物6 為類白色固體，分子式為C4H4N2O2。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ: 5.45 (1H, d,J=7.5 Hz, H-5), 7.40 (1H, d,J=7.5 Hz, H-6), 10.81 (1H, br s, NH), 11.00 (1H, br s, NH);13C NMR (150 MHz,DMSO-d6)δ: 100.7 (C-5), 142.6 (C-6), 151.9 (C-2),164.8 (C-4)。該化合物核磁共振數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[13]基本一致，確定化合物為尿嘧啶(uracil)。

化合物7 為白色固體，分子式為C6H14O6。1H NMR (600 MHz, D2O)δ: 3.80 (2H, m), 3.73 (2H,m), 3.70 (2H, m), 3.61 (2H, m);13C NMR (150 MHz,D2O)δ: 63.2 (C-1, 6), 69.3 (C-3, 4), 70.9 (C-2, 5)。該化合物核磁共振數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[14]基本一致，確定化合物為D-甘露醇(D-mannitol)。

化合物8 為白色固體，分子式為C4H8SO2Cl2。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ: 3.36 (2H, t,J=6.6 Hz), 3.19 (2H, t,J=6.6 Hz);13C NMR (150 MHz,DMSO-d6)δ: 35.4, 47.5。該化合物核磁共振數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[15]基本一致，確定化合物為河豚素(tetrodoine)。

3 討論

近年來(lái)，海洋生物因其次生代謝產(chǎn)物具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)骨架和特殊的藥理活性受到了廣泛關(guān)注，海馬作為常見(jiàn)的海洋動(dòng)物，同時(shí)也是經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的名貴中藥，藥用歷史悠久、療效顯著，備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，海馬中含有多種化學(xué)成分，包括膽固醇、膽甾-4-烯-3-酮、膽甾-5-烯-3β, 7α-二醇等甾體化合物；苯丙氨酸、丙氨酸、鳥(niǎo)氨酸、?；撬岬榷喾N氨基酸；SHP-1、HTP-1、HKPLP 等多肽類成分；十四酸、EPA、DHA 等脂肪酸類成分，以及核酸類、糖蛋白、肌酸酐等。藥理研究表明，海馬提取物可改善腎陽(yáng)虛模型動(dòng)物的體征，提高性激素水平；可通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB 和MAPK信號(hào)通路抑制炎癥因子的釋放從而發(fā)揮抗炎作用；可通過(guò)清除自由基發(fā)揮抗氧化作用；還可增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力，提高免疫力等；此外，海馬提取物對(duì)骨質(zhì)疏松的防治具有一定的作用，為動(dòng)物藥抗骨質(zhì)疏松研究提供了新方向[2,7,16-19]。

本研究從三斑海馬中分離得到了8 個(gè)化合物，其中N-乙?；野贰-甘露醇、河豚素為首次從三斑海馬中分離得到，進(jìn)一步明確了三斑海馬的化學(xué)成分。趙曉喆等[20]采用核磁代謝組學(xué)技術(shù)在三斑海馬甲醇提取物中指認(rèn)出33 種化學(xué)成分，其中包括丙氨酸、苯丙氨酸和肌苷。陳璐[4]通過(guò)HPLCMS 分析得到海馬化學(xué)成分中含有核酸類成分3 種，即尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤；此外，從海馬中分離鑒定出的甾體類化合物以膽固醇為主，占總膽甾醇的59.02%～95.99%。José等[21]從溶藻弧菌的菌株M3-10 中分離到了N-乙酰基酪胺，發(fā)現(xiàn)其具有較高的細(xì)菌群體感應(yīng)抑制劑的活性，并且N-乙?；野房赡孓D(zhuǎn)阿霉素耐藥白血病P388 細(xì)胞的耐藥性[22]，提示在中藥海馬中N-乙?；野房赡芡ㄟ^(guò)獨(dú)特的途徑參與發(fā)揮抗菌抗炎作用。甘露醇是臨床常用的脫水劑，在治療腦水腫、降低顱內(nèi)壓等方面發(fā)揮重要作用，具有清除自由基、抗氧化等活性[23]，可能參與中藥海馬的抗氧化過(guò)程?；诤ｑR顯著的藥效活性，深入探究海馬的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)中藥海馬進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用具有非常重要的意義。