聚乳酸/殼聚糖/氧化石墨烯載阿司匹林仿生支架的制備與表征

劉淑瓊，吳芳芳，劉瑞來(lái)，許禎毅

（武夷學(xué)院生態(tài)與資源工程學(xué)院，福建省高校綠色化工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 武夷山 354300）

骨組織工程在骨疾病和骨缺損的治療中起著重要的作用。支架材料是影響骨修復(fù)和治療完整性的關(guān)鍵因素。三維（3D）仿生支架的化學(xué)成分和物理結(jié)構(gòu)對(duì)骨細(xì)胞的黏附、增殖、分化、調(diào)控和血管形成具有重要意義[1-2]。然而，單靠支架的化學(xué)性質(zhì)或物理結(jié)構(gòu)較難預(yù)測(cè)現(xiàn)有支架對(duì)細(xì)胞行為的調(diào)節(jié)和組織再生的生物學(xué)效應(yīng)[3]。研究顯示，支架與藥物的有效結(jié)合可以促進(jìn)骨修復(fù)，增強(qiáng)骨組織再生的能力[4-8]。因此，具有藥物釋放功能的新型仿生支架將成為組織工程中的研究熱點(diǎn)。藥物控釋體系是指制備一定劑型的生物醫(yī)用材料作為藥物或生物活性物質(zhì)的載體，并根據(jù)設(shè)計(jì)的劑量，使藥物在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)以特定的速度緩慢釋放到身體的特定部位，以治療疾病、提高免疫力和促進(jìn)組織修復(fù)[9]。目前藥物控釋體系的研究非常廣泛，如膠束、納米顆粒、納米纖維和組織工程支架等。其中尤以納米尺度的載藥體系為研究熱點(diǎn)[10-12]，這與納米材料的納米效應(yīng)息息相關(guān)[13-14]。納米材料是一種結(jié)構(gòu)單元尺度為1～100nm 的新型材料。但在藥物釋放領(lǐng)域，一般將納米的尺寸界定在1～1000nm 之間[15]。細(xì)胞外基質(zhì)中的纖維尺度是50～500nm，因此仿生載藥支架既能滿足細(xì)胞對(duì)支架結(jié)構(gòu)和形態(tài)的要求，又能滿足藥物作為納米載體的要求。

在組織工程中，靜電紡絲、自組裝、3D打印、相分離等技術(shù)已被用于制造仿生支架[16-18]。其中，靜電紡絲和相分離應(yīng)用最多。但是傳統(tǒng)靜電紡絲技術(shù)在制備具有大孔結(jié)構(gòu)和類似于天然細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)的支架上面臨著巨大的挑戰(zhàn)，而復(fù)雜的3D 多孔結(jié)構(gòu)對(duì)于細(xì)胞行為調(diào)控和組織再生則至關(guān)重要[19]。相分離法操作方便，設(shè)備簡(jiǎn)單，可控制形成類似于天然ECM 的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，該方法被認(rèn)為能夠解決靜電紡絲所帶來(lái)的問(wèn)題，已被有效地應(yīng)用于納米纖維支架的制備[20]。

聚乳酸（PLA）是一種無(wú)毒、無(wú)刺激性、高強(qiáng)度、可塑性強(qiáng)的生物高分子材料，具有良好的生物降解性和生物相容性，已在生物醫(yī)學(xué)方面顯示出應(yīng)用潛力，如組織工程、縫合、植入和藥物傳遞[21-22]。PLA 因其具有可調(diào)的降解速率、優(yōu)良的加工性能、獨(dú)特的藥代動(dòng)力學(xué)和藥理功效等特點(diǎn)而被廣泛研究。雖然前人的研究表明PLA 可以用于骨組織修復(fù)，但所得到的材料往往存在一些缺點(diǎn)，如細(xì)胞親和力和親水性均較差[23]。殼聚糖（CS）是一種從幾丁質(zhì)中提取的天然陽(yáng)離子多糖，具有獨(dú)特的生物相容性、生物降解性、無(wú)毒無(wú)刺激性和高pH 敏感性等優(yōu)點(diǎn)，是一種具有巨大潛力的智能給藥載體，已在生物醫(yī)用領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[24-25]。氧化石墨烯（GO）是一種新穎的二維碳材料，因其獨(dú)特的物理和化學(xué)特性而備受關(guān)注[11-12]。GO 具有較高的比表面積和豐富的親水官能團(tuán)（如羰基、羥基、羧基和環(huán)氧基團(tuán)），具有較強(qiáng)的吸附性能和良好的親水性[25]。GO 還因含有較多的官能團(tuán)容易實(shí)現(xiàn)功能化和修飾，這大大促進(jìn)了藥物的吸附和緩釋[10-12]。此外，GO 在藥物載體、細(xì)胞成像、組織工程支架和可穿戴醫(yī)療設(shè)備等方面的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用也已經(jīng)得到驗(yàn)證[10-11]。復(fù)合材料是解決支架材料性能缺陷的一種簡(jiǎn)單而有效的方法。Mao 等[10]報(bào)道了GO 可顯著促進(jìn)PLA/GO納米纖維膜中RhB的釋放。此外，納米纖維結(jié)構(gòu)對(duì)PLA/GO 納米纖維膜的釋藥性能起著至關(guān)重要的作用。本文作者課題組[26]之前的研究也表明GO的加入可以提高PLA基體的親水性。在另一項(xiàng)研究[11]中，研究人員采用雙皮克林乳液法制備了GO@PLA@HA 載藥復(fù)合微膠囊，但文中只提到了載藥微膠囊的相關(guān)特性，并沒(méi)有考慮將其用作骨支架的可行性。Rasoulzadehzali 等[24]制備了殼聚糖/氧化石墨烯-銀復(fù)合水凝膠，結(jié)果顯示，該復(fù)合水凝膠具有更持久和可控的藥物釋放能力。Joz Majidi 等[27]采用溶劑鑄造法制備了PLA/GO 和PLA/GO/CS 復(fù)合支架，結(jié)果顯示GO-CS 納米復(fù)合材料的摻入不僅提高了PLA 的表面親水性、楊氏模量和結(jié)晶度，而且大大提高了PLA 的生物相容性，但該支架不具備納米仿生結(jié)構(gòu)。Ji等[12]成功制備了新型多孔GO/CTS/HA 納米復(fù)合膜，為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mMSCs）的增殖提供了理想的支架。綜上表明：PLA、CS和GO在載藥及組織工程中均有良好的應(yīng)用。然而，目前將這三種化合物復(fù)合并結(jié)合相分離制備仿生3D 多孔骨組織工程載藥支架的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

阿司匹林（ASA）是一種非甾體抗炎藥，具有鎮(zhèn)痛、解熱、抗炎、抗風(fēng)濕和抗血栓形成等作用[28-29]。近來(lái)有研究表明，它對(duì)骨修復(fù)和骨治療也具有一定的作用，如可以抑制破骨細(xì)胞的分化成熟，顯著促進(jìn)嚙齒動(dòng)物骨修復(fù)[30]。Ren 等[28]報(bào)道：與純鈦種植體相比，載ASA 的移植體大大促進(jìn)了MC3T3-E1 細(xì)胞向成骨細(xì)胞的增殖和分化。因此，本文采用相分離的方法制備了一系列新型3D 仿生PLA/CS/GO/ASA 載藥復(fù)合支架，并研究了ASA 含量對(duì)支架形態(tài)、理化性質(zhì)、細(xì)胞相容性、血液相容性和藥物緩釋性能的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

聚乳酸 （PLA， 3052D，Mn=250000g/mol，Natureworks）；殼聚糖（CS，BR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氧化石墨烯（GO）由實(shí)驗(yàn)室自制，具體制備過(guò)程可參見(jiàn)文獻(xiàn)[26]；其他試劑均來(lái)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，全部為分析純。

1.2 PLA/CS/GO/ASA載藥仿生復(fù)合支架的制備

本文采用熱致相分離法來(lái)制備PLA/CS/GO/ASA 復(fù)合納米纖維載藥仿生支架。以5%ASA 含量的載藥支架的制備過(guò)程為例：首先，將0.15g CS、0.06g GO 和0.15g ASA 依次溶解到27g 1,4-二氧六環(huán)/水（90/10，質(zhì)量比）的混合溶劑中，并超聲分散30min，得到5%ASA 含量的均相溶液，往均相溶液中加入3g PLA，置于60℃恒溫?cái)嚢柚敝罰LA完全溶解。取該混合溶液置于模具中，然后將模具放置于0℃ 3h 再放置于-40℃ 2h 進(jìn)行凝膠相分離，待相分離結(jié)束，將支架放置于真空冷凍干燥機(jī)（0.940mbar，-56℃）干燥3d，收于干燥器中待用。其他不同ASA 含量的載藥支架的制備同上，只需改變ASA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即0、5.0%、10.0%、15.0%、30.0%和50.0%的ASA 含量分別為0.00、0.15g、0.30g、0.45g、0.90g和1.50g，所得載藥支架依次命名為PSGA0、PSGA5、PSGA10、PSGA15、PSGA30和PSGA50。

1.3 PLA/CS/GO/ASA 載藥仿生復(fù)合支架的表征

采用掃描電子顯微鏡（SEM，Vega 3 sbh，TESCAN）對(duì)PLA/CS/GO/ASA 載藥仿生復(fù)合支架的結(jié)構(gòu)形貌和支架對(duì)血小板的黏附情況進(jìn)行分析。具體操作：將樣品脆斷（血小板黏附樣品則直接觀測(cè)樣品表面），切取約1mm的薄片，將薄片斷面朝上噴金110s（旋轉(zhuǎn)噴金儀，SBC-12，30mA），測(cè)試條件：電壓10kV，電流10mA。

采用Nicolet Avatar 360傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR，Nicolet IS5，Thermo fisher Ltd.）分析不同ASA 含量的PLA/CS/GO/ASA 載藥仿生復(fù)合支架的基團(tuán)特征，測(cè)試條件為：分辨率4cm-1，掃描次數(shù)為64次，掃描范圍4000～400cm-1。

采用Philips X’pert MPD X 射線衍射儀（XRD，D8 Advance，布魯克有限公司）分析含有不同ASA含量的復(fù)合支架的晶體結(jié)構(gòu)。測(cè)試條件為：Cu Kα，管壓40kV，管流40mA，步長(zhǎng)0.02°，掃描速率4°/min，掃描范圍5°～60°。

1.4 孔隙率和接觸角

孔隙率是根據(jù)比重瓶法進(jìn)行測(cè)定的，具體的操作步驟可參考文獻(xiàn)[31]。采用接觸角測(cè)定儀（JYPHa，承德金和有限公司）評(píng)價(jià)支架的親水性能。具體操作是將5μL去離子水滴到支架表面，由儀器自動(dòng)捕捉水滴形態(tài)，并測(cè)定相應(yīng)的接觸角大小。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。

1.5 纖維直徑的測(cè)量

利用納米測(cè)量軟件對(duì)復(fù)合支架的納米纖維直徑大小進(jìn)行統(tǒng)計(jì)測(cè)量。每個(gè)樣品隨機(jī)測(cè)量50 條纖維直徑并取平均值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)

用小鼠成骨前細(xì)胞系MC3T3-E1 評(píng)價(jià)PLA/CS/GO/ASA 載藥仿生復(fù)合支架的細(xì)胞相容性。將MC3T3-E1（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）培養(yǎng)在含有88%a-MEM 培養(yǎng)基（a-MEM，L570KJ，上海源培生物科技有限公司）、10%胎牛血清（FBS，C0230，BOVOGEN，南美）、1% l -谷氨酰胺（Gln，北京索萊寶生物科技有限公司）和1%青霉素-鏈霉素（碧云天生物科技有限公司）的傳統(tǒng)培養(yǎng)基上。然后將細(xì)胞置于37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 天更新一次培養(yǎng)基。取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，加入0.25%胰蛋白酶EDTA 溶液（25200-056，Gibco，美國(guó)）進(jìn)行細(xì)胞增殖研究。

1.7 細(xì)胞增殖

將支架樣品切成小片（10mm2×2mm），放入24孔板并進(jìn)行紫外線（UV）滅菌24h。收集對(duì)數(shù)期的MC3T3-E1細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，鋪板使待測(cè)細(xì)胞為1×104個(gè)/孔，然后在5%CO2、37℃條件下，支架材料和細(xì)胞孵育24h、72h和120h。到達(dá)預(yù)定時(shí)間點(diǎn)，吸走原有培養(yǎng)基，PBS洗細(xì)胞2 次，加500μL 含10% CCK8 的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2h，然后將液體吸入96 孔板中，用酶標(biāo)儀（EPOCH2，Biotek，USA）在450nm 處檢測(cè)光密度（OD 值）。所得值與每孔中黏附的細(xì)胞數(shù)成正比，每個(gè)樣品平行測(cè)試3次，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。

1.8 載藥仿生復(fù)合支架的血液相容性

采用溶血率和血小板黏附評(píng)價(jià)PLA/CS/GO/ASA 載藥仿生復(fù)合支架的血液相容性。根據(jù)ISO 10993-4∶177，從健康志愿者中采集靜脈血，加入檸檬酸三鈉（9%）作為抗凝劑，形成新鮮抗凝人血[32]。

溶血率是通過(guò)測(cè)量暴露在實(shí)驗(yàn)材料下的全血中紅細(xì)胞釋放到溶液中的血紅蛋白的相對(duì)數(shù)量來(lái)評(píng)估的[33]。用10mL 0.9%的NaCl溶液將8mL新鮮抗凝人血稀釋成稀釋血。將待測(cè)支架樣品（1cm2×0.1cm）置于試管中，加入0.9%的氯化鈉溶液10mL，在37℃恒溫30min，再加入稀釋血0.2mL，混勻后繼續(xù)恒溫60min。陽(yáng)性對(duì)照用去離子水10mL 加入稀釋血0.2mL，陰性對(duì)照用10mL 0.9%的氯化鈉溶液加入稀釋血0.2mL，以2000r/min 的離心速度離心10min。取上層清液移入比色皿，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)540nm 處的吸光度，按式(1)計(jì)算溶血率[34]。

式中，HR表示溶血率；Xts表示支架的吸光度；Xnc和Xpc分別表示陰性和陽(yáng)性對(duì)照的吸光度值。

將1cm2×0.05cm 大小的支架樣品分別放入盛有一定量生理鹽水的燒杯中，在37℃中恒溫浸泡2h。將新鮮抗凝人血離心20min，離心速度為3000r/min，獲得血小板血漿。將0.2mL血小板血漿滴到浸泡過(guò)生理鹽水的支架樣品上，于37℃恒溫水浴中一起振蕩培養(yǎng)2h。然后用生理鹽水將培養(yǎng)后的樣品輕漂3次，用2.5%戊二醛固定液在4℃固定1h，再用PBS 溶液沖洗2 次，每次10min，最后依次在50%、60%、80%、90%、100%乙醇-水梯度溶液中浸泡30min，逐級(jí)脫水，叔丁醇置換，并在4℃冰箱放置24h，然后真空干燥，最后用掃描電鏡觀察血小板黏附情況，每個(gè)樣品平行測(cè)定3個(gè)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。

1.9 ASA的體外釋放

配制濃度為0.25～400μg/mL 的ASA 標(biāo)準(zhǔn)溶液，并用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-1100，上海美普達(dá)儀器有限公司）測(cè)定ASA 在270nm 處的吸光度，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，所得曲線的R2=0.9998。支架的體外釋放過(guò)程如下，將約30mg 支架樣品浸入25mL PBS （pH=7.35） 溶液中，持續(xù)恒溫振蕩（100r/min，37℃）。在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)取出3mL 緩釋溶液并測(cè)定270nm處的吸光度，同時(shí)補(bǔ)充3mL新鮮PBS溶液。利用所測(cè)的吸光度對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算累計(jì)釋放的ASA質(zhì)量分?jǐn)?shù)。計(jì)算公式如式(2)。

式中，mn是支架PLA/CS/GO/ASA 在t時(shí)間點(diǎn)累計(jì)釋放的ASA 總量；M是支架中ASA 的理論負(fù)載量。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

本文中所有的體外實(shí)驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行，數(shù)據(jù)以所得值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。使用Graphpad Prism 軟件（7.0）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組間的P值采用Student-t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 SEM分析

仿生細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）結(jié)構(gòu)的納米纖維支架已被證明對(duì)細(xì)胞的黏附、增殖、分化及遷移等功能具有良好作用[1-2,35]，同時(shí)納米材料在藥物緩釋系統(tǒng)中也有良好的應(yīng)用[15]。圖1顯示了相分離方法制備的不同ASA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0、5%、10%、15%、30%和50%）的PLA/CS/GO/ASA 復(fù)合支架的形貌變化。圖1(a)顯示PSGA0復(fù)合支架主要由生長(zhǎng)不完全的重疊球晶構(gòu)成，球晶由微、納米纖維聚集而成。隨著ASA的添加，復(fù)合支架的基體結(jié)構(gòu)逐漸改變，原本不完善的球晶結(jié)構(gòu)進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷傻募{米纖維束，纖維聚集程度降低，孔隙數(shù)量增加。但隨著ASA含量的增加，纖維直徑?jīng)]有太大的變化，平均直徑分別為（262.4±91.0）nm、（216.6±99.9）nm、（194.0±69.9）nm、（330.8±115.7）nm、（233.6±107.3）nm、（282.2±196.3）nm。因此，不同ASA含量的PLA/CS/GO/ASA 復(fù)合支架均具有納米纖維的仿生結(jié)構(gòu)。另外，從圖上還可以看出，在支架的基體結(jié)構(gòu)上除了纖維結(jié)構(gòu)之外還有一些額外的二維（2D）薄片結(jié)構(gòu)，這與本文作者課題組之前報(bào)道的PLA/GO 復(fù)合支架表現(xiàn)出的形態(tài)結(jié)構(gòu)一致，應(yīng)該都是GO析出所致[26]。從總體上來(lái)看，當(dāng)ASA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于30%時(shí)，PLA的球晶結(jié)構(gòu)完全被破壞，這可能是因?yàn)榇罅緼SA 的添加對(duì)PLA 球晶的生長(zhǎng)起到阻礙作用。但實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，ASA的添加不影響復(fù)合支架的仿生納米纖維結(jié)構(gòu)的形成。

圖1 不同ASA含量的PLA/CS/GO/ASA載藥仿生復(fù)合支架的電鏡圖

2.2 XRD分析

圖2 為PLA/CS/GO/ASA 載藥仿生復(fù)合支架的XRD 圖譜。在所有復(fù)合支架試樣中均可觀察到PLA在17°和19°的特征衍射峰[26]。隨著ASA含量的增加，PLA的特征衍射峰位沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明復(fù)合體系中PLA 的晶體形貌沒(méi)有受到ASA 的影響。同時(shí)，隨著ASA 含量的增加，復(fù)合支架中ASA 的特征衍射峰逐漸出現(xiàn)并增強(qiáng)。這些結(jié)果表明相分離方法可以有效地將不同含量的ASA加載到PLA/CS/GO 復(fù)合支架上，并且對(duì)支架的化學(xué)性質(zhì)和仿生微納米纖維結(jié)構(gòu)的影響較小，這對(duì)支架的仿生具有重要作用。

圖2 不同ASA含量的PLA/CS/GO/ASA載藥仿生復(fù)合支架的XRD圖

2.3 FTIR分析

圖3是不同ASA含量的PLA/CS/GO/ASA載藥仿生復(fù)合支架和純ASA 的FTIR 光譜。如圖3 所示，所有的復(fù)合支架在1753cm-1、1454cm-1、1359cm-1、1181cm-1和1054cm-1處均出現(xiàn)PLA 相關(guān)的特征吸收峰，且隨ASA 含量的增加，其特征吸收峰（1677cm-1、1603cm-1、910cm-1處）對(duì)應(yīng)的峰和強(qiáng)度都有所增強(qiáng)，這些特征吸收峰都?xì)w屬于ASA 的環(huán)狀締合物[31]。FTIR 結(jié)果證實(shí)了ASA 在復(fù)合材料中的存在，同時(shí)也表明PLA/CS/GO復(fù)合支架與ASA之間沒(méi)有化學(xué)相互作用，這可能不利于復(fù)合支架的藥物緩釋。

圖3 不同ASA含量的PLA/CS/GO/ASA載藥仿生復(fù)合支架的紅外光譜圖

2.4 孔隙率分析

圖4顯示了不同ASA含量下PLA/CS/GO/ASA載藥仿生復(fù)合支架的孔隙率。高孔隙率是復(fù)合材料作為骨組織工程支架材料的必備條件。通過(guò)孔隙可促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸及廢棄物的排泄，有利于骨組織的再生，促進(jìn)新骨的生長(zhǎng)。研究表明，80%以上的孔隙率可以滿足組織工程對(duì)孔隙率的要求[2]。從圖4 可以看出，復(fù)合支架的孔隙率從未添加ASA 的86.20%±0.39%下降到添加15% ASA 時(shí)的80.54%±1.24%。而當(dāng)ASA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到30%以上時(shí)，孔隙率又呈上升趨勢(shì)，達(dá)到86.06%±0.66%。這可能與ASA 和PLA 基體相容性差有關(guān)。當(dāng)混合體系發(fā)生相分離時(shí)，ASA析出形成ASA單相，填充PLA基體結(jié)構(gòu)中的孔隙，導(dǎo)致孔隙率降低。而當(dāng)ASA質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到30%時(shí)孔隙率又增加，這可能是因?yàn)榇罅緼SA 的添加破壞了PLA 球晶的生長(zhǎng)，從而形成高孔隙率的多孔結(jié)構(gòu)，這一結(jié)論與電鏡圖的結(jié)果相互印證。

圖4 不同ASA含量的PLA/CS/GO/ASA載藥仿生復(fù)合支架的孔隙率

2.5 接觸角分析

圖5為PLA/CS/GO/ASA載藥仿生復(fù)合支架的接觸角。通過(guò)分析復(fù)合材料的接觸角可以評(píng)估材料的親水性。親水性的提高不僅有利于細(xì)胞的黏附、增殖和生長(zhǎng)[1]，而且有利于藥物從載藥支架中釋放。如圖5 所示，隨著ASA 的加入，接觸角呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明ASA 的加入有利于提高支架的親水性，但作用不是太明顯，這可能跟ASA 本身微溶于水的特性有關(guān)。

圖5 不同ASA含量的PLA/CS/GO/ASA載藥仿生復(fù)合支架的接觸角

2.6 血液相容性

理想的骨組織工程支架在與血液接觸時(shí)必須具有良好的血液相容性。根據(jù)美國(guó)材料與實(shí)驗(yàn)學(xué)會(huì)（ASTM，756-00，2000）規(guī)定，材料的溶血特性可分為三類：非溶血（溶血率低于2%）、輕度溶血（溶血率在2%～5%）和溶血（溶血率超過(guò)5%）[36]。因此，本研究采用人紅細(xì)胞來(lái)測(cè)定PLA/CS/GO/ASA復(fù)合支架的血液相容性。圖6顯示，本文所制備的不同ASA含量的載藥支架的溶血率分別為：PSGA0 0.27%±0.04%； PSGA5 0.58%±0.24%； PSGA10 1.95%±0.31%； PSGA15 1.71%±0.35%； PSGA30 2.14%±0.24%；PSGA50 3.10%±0.21%。因此，根據(jù)ASTM的規(guī)定，PSGA0和PSGA5復(fù)合支架的溶血率均小于2%，為非溶血材料；而PSGA10 和PSGA15則處于輕度溶血和非溶血的界限；PSGA30和PSGA50的溶血率雖有所增加，但仍然小于5%，屬于輕度溶血材料。這一結(jié)果與PLGA/ASA[37]、瓊脂糖/CS/GO[38]等相關(guān)支架材料的溶血結(jié)果一致。

圖6 不同ASA含量的PLA/CS/GO/ASA載藥仿生復(fù)合支架的溶血率

圖7是不同ASA含量的復(fù)合支架的血小板黏附實(shí)驗(yàn)的SEM 圖。如圖7 所示，PSGA0、PSGA5、PSGA10、PSGA15 和PSGA30 的復(fù)合支架表面黏附著零星的血小板（箭頭所示），PSGA50 的樣品則未發(fā)現(xiàn)[圖7(f)]。復(fù)合支架的表面性質(zhì)、親水性和組成都可能對(duì)血小板黏附起作用。Milleret 等[39]研究了靜電紡絲纖維直徑和血管移植物表面的粗糙度對(duì)血液活化的影響，即對(duì)血小板活化和黏附的影響，結(jié)果顯示，支架的形貌結(jié)構(gòu)比聚合物的化學(xué)組分具有更大的影響。他們還發(fā)現(xiàn)，由細(xì)纖維（直徑<1μm）組成的支架幾乎沒(méi)有血小板黏附，而那些纖維較寬（2～3μm）的支架的血小板黏附增加。此外，他們還認(rèn)為纖維直徑越小支架的疏水性越強(qiáng)。另有研究也證實(shí)涂層的超疏水特性抑制血小板黏附在材料表面[40]。因此，本研究制備的仿生微、納米纖維支架具有抑制血小板黏附的特性是由于親水性較差及本身的仿生微納米纖維結(jié)構(gòu)造成的。另外，ASA本身也是一種抗凝藥物，可用來(lái)增加血液的流動(dòng)性，減小血小板的活性。Lee 等[37]和Aslani等[41]的研究小組都報(bào)道了一種負(fù)載有ASA的可生物降解納米纖維復(fù)合支架可以有效抑制血小板的黏附。在本研究中，復(fù)合支架抑制血小板黏附可能是多種因素綜合作用的結(jié)果。因此，綜合溶血實(shí)驗(yàn)和血小板黏附實(shí)驗(yàn)可證明所制備的復(fù)合支架具有良好的血液相容性。

圖7 不同ASA含量的PLA/CS/GO/ASA載藥仿生復(fù)合支架的血小板黏附電鏡圖

2.7 細(xì)胞相容性

采用CCK-8 評(píng)估MC3T3-E1 細(xì)胞在不同ASA含量的復(fù)合支架上的增殖情況（圖8）。如圖8 所示，MC3T3-E1細(xì)胞在不同的支架上培養(yǎng)1～5d后均有細(xì)胞增殖，但增殖情況不同。樣品PSGA0隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，OD值也逐漸增加（P<0.0001），說(shuō)明支架具有良好的細(xì)胞相容性；PSGA5 的樣品具有相同的增殖趨勢(shì)。但對(duì)比這兩組支架可知，在支架培養(yǎng)的前3 天，ASA 的添加有利于細(xì)胞的增殖，具有較高的OD值（P<0.0001），而在第5天，細(xì)胞增殖的OD值則小于未添加ASA組。同樣，從圖中還可以看到，樣品PSGA50 的OD 值在整個(gè)培養(yǎng)周期中都小于樣品PSGA0 和PSGA5。說(shuō)明ASA 的添加對(duì)材料的細(xì)胞活性有一定的影響，特別是當(dāng)ASA含量（50%）較大時(shí)，支架的OD 值較小，說(shuō)明高濃度的ASA 對(duì)細(xì)胞具有一定的抑制作用。這與之前報(bào)道的細(xì)胞增殖結(jié)果一致[26]。另有研究報(bào)道也顯示ASA 對(duì)細(xì)胞增殖有不同的作用。Cao 等[42]的研究表明，低濃度的ASA 可促進(jìn)細(xì)胞增殖，而高濃度的ASA 則對(duì)細(xì)胞具有抑制作用。Niu 等[43]報(bào)道小劑量ASA并不能顯著促進(jìn)BMSC的增殖；大劑量ASA（5mmol/L）則會(huì)抑制BMSC增殖，可能是因?yàn)樗幬飳?duì)細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的酸化作用所致。Aslani 等[41]證明ASA 的摻入不會(huì)損害細(xì)胞活力和細(xì)胞增殖。此外，他們還報(bào)道了AM 裂解液涂層ASA-PLLA-aligned支架有利于沃頓氏膠源的間充質(zhì)干細(xì)胞的內(nèi)皮分化。負(fù)載ASA 的PLGA 納米纖維支架具有功能活性，可高效抑制血小板和單核細(xì)胞黏附，并促進(jìn)再內(nèi)皮化[37]。雖然ASA 對(duì)細(xì)胞增殖的作用尚有爭(zhēng)議，但有文獻(xiàn)表明，該藥物在促進(jìn)骨質(zhì)疏松癥骨再生，促進(jìn)骨修復(fù)方面具有重要作用。Ren 等[28]認(rèn)為載ASA的植入物顯示MC3T3-E1細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化程度更高且增殖率與純鈦植入物相當(dāng)。另外，Aslani 等[41]還表明，ASA 在合并移植術(shù)后部位的局部釋放有助于抑制血栓形成。因此，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，制備的PSGA0 支架比載ASA 支架具有更好的細(xì)胞相容性；但少量ASA 的加入對(duì)支架的增殖影響不大，大量ASA 的添加則對(duì)細(xì)胞的增殖具有抑制作用，但它們?nèi)匀槐憩F(xiàn)出一定程度的細(xì)胞相容性。

圖8 MC3T3-E1在不同ASA含量的PLA/CS/GO/ASA仿生復(fù)合載藥支架上的增殖

2.8 ASA的體外緩釋

圖9(a)是PSGA5載藥支架在PBS溶液中浸泡8d后的SEM 圖。對(duì)比圖1(b1)可發(fā)現(xiàn)支架在緩釋后表面出現(xiàn)明顯的孔隙結(jié)構(gòu)，這是由支架中的藥物ASA從支架中釋放形成的。從ASA 的緩釋累積釋放曲線圖[圖9(b)]上也可以證實(shí)這點(diǎn)。從累積釋放曲線上可以看出，支架在24h時(shí)累積釋放了30.25%，后期釋放速率趨緩，在釋放第6天達(dá)到最大累積釋放量（94.46%）。說(shuō)明該復(fù)合支架可以有效地緩釋ASA，這將對(duì)后期的骨移植及修復(fù)起到重要作用。

圖9 5% ASA含量的PLA/CS/GO/ASA載藥仿生復(fù)合支架緩釋8天后的電鏡圖(a)和阿司匹林在PLA/CS/GO/ASA載藥仿生復(fù)合支架上的累積釋放質(zhì)量分?jǐn)?shù)(b)

3 結(jié)論

采用相分離法制備了一系列不同ASA 含量的三維多孔PLA/CS/GO/ASA載藥仿生復(fù)合支架。ASA的添加破壞了PLA 球晶結(jié)構(gòu)的形成，增大了基體結(jié)構(gòu)的孔徑，但對(duì)仿生微、納米纖維結(jié)構(gòu)的影響不大；實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)隨ASA的增加, 載藥支架親水性能有所改善，但孔隙率呈先減后增的趨勢(shì)，但均大于80%；溶血率和血小板黏附實(shí)驗(yàn)表明，低含量的ASA載藥仿生復(fù)合支架具有良好的血液相容性；所制備的載藥復(fù)合支架具有細(xì)胞相容性，而高含量ASA 的加入對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞具有一定的抑制作用；藥物緩釋實(shí)驗(yàn)證明該復(fù)合支架具有良好的緩釋性能。綜上，該系列的載藥仿生支架有望應(yīng)用于臨床骨修復(fù)，但其降解性能和藥物釋放及對(duì)應(yīng)的力學(xué)性能有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。