焦化污染場(chǎng)地中萘降解菌的分離及降解特性

楊靜，李博，李文軍，劉曉娜，湯劉元，劉月，錢天偉

（1 太原理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太原 030024；2 山西交控生態(tài)環(huán)境股份有限公司，山西 太原 030006）

多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是由兩個(gè)或兩個(gè)以上的苯環(huán)組成的一類持久性環(huán)境污染物，主要來自于化石燃料的加工和燃燒（如煉焦、燃煤）以及生物質(zhì)和有機(jī)物的不完全燃燒[1]。PAHs 疏水性強(qiáng)、毒性大、難降解及易致癌[2]，被很多國家列為優(yōu)先控制的對(duì)象。PAHs可在環(huán)境中四處擴(kuò)散，最初以氣態(tài)形式存在于空氣中，經(jīng)過沉降作用最終進(jìn)入土壤或水體中[3]。吸附在土壤顆粒中的PAHs可經(jīng)農(nóng)作物富集進(jìn)入食物鏈，對(duì)人類健康構(gòu)成了巨大的威脅[4]。此外，土壤中的PAHs 還可再次進(jìn)入大氣和水體，造成二次污染。PAHs 污染的一個(gè)重要來源是焦化工業(yè)[5]，近年來，隨著我國產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的變動(dòng)，大量焦化工業(yè)搬遷帶來的場(chǎng)地殘留污染問題日益突出[6]。因此，對(duì)焦化污染土壤中的PAHs進(jìn)行治理尤為重要。

土壤PAHs 污染的修復(fù)方法主要有物理修復(fù)（如熱解吸、溶劑萃取等）、化學(xué)修復(fù)（如光催化、高級(jí)氧化等）和生物修復(fù)（如微生物修復(fù)、植物修復(fù)等）[7]，但傳統(tǒng)的物化方法具有成本高、污染物去除不徹底且易造成二次污染等弊端[8]。近年來，生物修復(fù)尤其是微生物修復(fù)因其具有成本低、無二次污染并且可原位修復(fù)等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為降解PAHs 污染的重要手段[9]。通過微生物的生長代謝，把PAHs 同化成自身機(jī)體的組成部分或者異化成CO2和H2O，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)PAHs 的降解。在降解過程中，功能菌群的篩選是微生物降解PAHs 的關(guān)鍵所在。眾多研究人員分離篩選了PAHs 可降解菌，如假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、諾卡氏菌屬（Nocardia）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）和產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）等細(xì)菌[10-15]，并進(jìn)一步研究了其對(duì)PAHs 的降解特性。黃海英等[16]報(bào)道了使用假單胞菌菌株在48h 內(nèi)，對(duì)800mg/L 萘的最大降解率為77%；Lyu 等[17]分離出來的降解菌株Novophingobium pentaromativoransUS6.1 能夠降解菲、芘、苯并芘，且菌株對(duì)菲的降解在24h 可達(dá)86.62%；王巖[18]從近海的沉積物中分離得到可以高效降解菲、蒽、芘的菌群，降解率可達(dá)到91.7%。大量研究表明，從不同污染水體、土壤中分離篩選到的降解菌株有各自不同的特點(diǎn)。環(huán)境中污染物的降解與降解微生物的生態(tài)位情況密切相關(guān)，從污染區(qū)域中分離出的微生物更能有效利用相應(yīng)的污染物，對(duì)污染物的轉(zhuǎn)化效率明顯高于其他來源的微生物[19]。

本研究基于對(duì)焦化污染場(chǎng)地中PAHs 污染的原位微生物修復(fù)需求，從該焦化污染場(chǎng)地中分離出一株高效萘降解菌株AO-4，并對(duì)其進(jìn)行了鑒定，研究了菌株AO-4對(duì)萘的降解性能，評(píng)估了環(huán)境條件（溫度、pH、萘初始濃度和菌量）對(duì)菌株降解萘的影響，探討了降解機(jī)理，進(jìn)一步考察了菌株對(duì)其他PAHs 芴、菲、蒽、芘在單一和混合體系中的降解能力，以期為焦化污染場(chǎng)地中PAHs的生物修復(fù)和治理提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

1.1.1 土壤樣品的采集

供試土壤采集于山西省某煤焦化工污染場(chǎng)地，隨機(jī)采集多個(gè)取樣點(diǎn)的表層（0～10cm）土壤，將采集到的土壤樣品用2mm 土壤篩進(jìn)行篩分，剔除雜質(zhì)。充分混勻后，于4℃冰箱中保存。

1.1.2 化學(xué)試劑

本研究所使用的主要藥品：萘、芴、菲等PAHs（純度大于97%，美國Aladdin公司）；甲醇、乙酸乙酯等有機(jī)試劑（色譜純，美國Fisher Chemical 公司）；蛋白胨等非有機(jī)試劑（分析純，上海生工生物工程公司化學(xué)試劑）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

BCV-1FD 超凈工作臺(tái)（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、LRH生化培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）、Agilent 1260型高效液相色譜儀（安捷倫科技（中國）有限公司）、THZ-C恒溫振蕩培養(yǎng)箱（蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、LS-50H立式壓力蒸汽滅菌鍋（江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司）、UV8000S 紫外分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）、KH20R高速冷凍離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）、Nikon YS100生物顯微鏡[奧林巴斯（中國）有限公司]、SC850 全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)（上海山富科學(xué)儀器有限公司）、veriti96 PCR儀（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試劑配置

實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基包括LB培養(yǎng)基和MSM無機(jī)鹽培養(yǎng)基，配方如下。

LB 養(yǎng)基：蛋白胨10.00g/L，酵母膏10.00g/L，NaCl 5.00g/L，pH=7.2。

MSM 無機(jī)鹽培養(yǎng)基：K2HPO4·3H2O 4.25g/L，NaH2PO4·H2O 1.00g/L，NH4Cl 2.00g/L，MgSO4·7H2O 0.20g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.012g/L，MnSO4·H2O 0.003g/L，ZnSO4·7H2O 0.003g/L，CoSO4·7H2O 0.001g/L，pH=7.0～7.2。

配置時(shí)按以上濃度稱量，用蒸餾水定容至1000mL，固體培養(yǎng)基配方在此基礎(chǔ)上加15g/L 瓊脂，在121℃、0.103MPa條件下滅菌20min。

PAHs 的配置：用丙酮作為溶劑配制萘（濃度為100g/L）、芴、菲、蒽、芘（濃度分別為5g/L）的溶液，通過無菌有機(jī)濾頭（孔徑0.22μm）過濾除菌，按所需濃度添加到降解體系中后，待丙酮揮發(fā)完畢使用。

1.2.2 萘降解菌的篩選

取10g 污染土壤加入到90mL 無菌水中，于溫度30℃、轉(zhuǎn)速130r/min 條件下浸取5h，靜置30min后，取5mL 上清液加入到45mL 以萘（100mg/L）為唯一碳源的萘選擇性液體MSM 培養(yǎng)基中，在30℃、130r/min 的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)7d，然后再次轉(zhuǎn)接到新鮮的萘（150mg/L）選擇性液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，如此重復(fù)。經(jīng)7個(gè)周期馴化培養(yǎng)，逐步將萘的濃度提升至400mg/L后，取適量富集培養(yǎng)液，梯度稀釋后涂布在含萘（400mg/L）的選擇性固體培養(yǎng)基平板上，置于30℃生化培養(yǎng)箱中；待菌落長出后，挑取菌落大小及形態(tài)顯著的單個(gè)菌落在含萘選擇性固體培養(yǎng)基上進(jìn)一步純化，直至得到形態(tài)單一的純菌種。

1.2.3 萘降解菌的鑒定

1.2.3.1 革蘭氏染色鑒定

取少量活化后的菌液，滴加在干凈的載玻片上干燥固定后，滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液染色2min，立即傾去染料，用細(xì)流蒸餾水沖洗直到流水為無色。再在涂菌區(qū)域滴加適量的革蘭氏碘液，作用1min 后傾去多余的碘液，最后用水流沖至流出液為無色。用吸水紙吸去載玻片上多余的水分，滴加體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇脫色30s 左右至流出液為無色，接著用蒸餾水沖去乙醇后吸干，番紅復(fù)染3min，水洗并使之干燥。在顯微鏡下用100倍油鏡觀察經(jīng)染色的菌落顏色。

1.2.3.2 16S rDNA擴(kuò)增及測(cè)序鑒定

將純化的單菌落接種到LB 液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，取新鮮菌液用細(xì)菌基因組提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取基因組DNA。用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) 和1492R(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)擴(kuò)增其16S rDNA 基因序列。PCR 體系為：Super Mix 20μL、ddH2O 12μL、通用引物27F(10μmol/L) 1μL、通用引物1492R(10μmol/L) 1μL、模板DNA 6μL。擴(kuò)增條件為：94℃、30s，55℃、30s，72℃、90s，35個(gè)循環(huán)。將PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI 的Genbank 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列同源性比對(duì)，用MEGA 7.0 進(jìn)行同源性分析，依據(jù)鄰接法（neighbor joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定萘降解菌AO-4 的種屬。

1.2.4 萘降解途徑中的部分關(guān)鍵酶基因的PCR擴(kuò)增

選取萘降解途徑中的關(guān)鍵酶萘雙加氧酶的鐵硫蛋白大亞基基因nahAC[20]、水楊醛脫氫酶基因nahF[21]、水楊酸羥化酶基因nahG[22]及鄰苯二酚2,3-雙加氧酶基因nahH[23]進(jìn)行PCR 擴(kuò)增與鑒定。引物序列如下。

1.2.5 萘降解菌對(duì)PAHs（萘、芴、菲、蒽、芘）的降解體系

將處于對(duì)數(shù)生長期的AO-4菌液（OD600=1）按一定體積接種至含特定濃度的萘、芴、菲、蒽、芘MSM培養(yǎng)基中，于溫度30℃、轉(zhuǎn)速130r/min條件下?lián)u床避光培養(yǎng)，定時(shí)取樣，按需測(cè)定菌體濃度OD600、培養(yǎng)液中PAHs含量及菌體脫氫酶活性，實(shí)驗(yàn)設(shè)置三組平行試樣，并設(shè)置無菌組作為空白對(duì)照。

1.2.6 環(huán)境單因素對(duì)萘降解的影響

本研究以降解率作為考察指標(biāo)，研究環(huán)境因素包括溫度、pH、萘初始濃度和菌種接種量對(duì)萘降解的影響，培養(yǎng)條件均在30℃、130r/min的搖床避光培養(yǎng)。

設(shè)置體系的不同溫度分別為10℃、20℃、30℃、40℃，將處于對(duì)數(shù)生長期的菌液按2%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接種至含有20mg/L 萘的無機(jī)鹽培養(yǎng)基（pH=7.0）中，定時(shí)取樣測(cè)定不同溫度下菌株AO-4對(duì)萘的降解率。

調(diào)整體系的初始pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，將處于對(duì)數(shù)生長期的菌液按2%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接種至含有20mg/L 萘的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，定時(shí)取樣測(cè)定不同初始pH 下菌株AO-4對(duì)萘的降解率。

選取小于萘在水中溶解度的濃度（1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L），將處于對(duì)數(shù)生長期的菌液按2%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種至含有以上濃度的萘的無機(jī)鹽培養(yǎng)基（pH=7.0）中，定時(shí)取樣測(cè)定菌株AO-4對(duì)不同濃度的萘的降解率。

將處于對(duì)數(shù)生長期的菌液分別按0、1%、2%、5%的接種量（體積分?jǐn)?shù)）接種至含有20mg/L萘的無機(jī)鹽培養(yǎng)基（pH=7.0）中，定時(shí)取樣測(cè)定不同接種量下菌株AO-4對(duì)萘的降解率。

1.2.7 PAHs濃度的測(cè)定及降解率計(jì)算

試樣用等體積的乙酸乙酯萃取，在振蕩器上通過1500r/min 轉(zhuǎn)速振蕩5min 后超聲萃取10min，再經(jīng)10000r/min 轉(zhuǎn)速離心5min 后可分離有機(jī)相和水相，用0.22μm 孔徑的有機(jī)濾膜過濾乙酸乙酯萃取液后，利用高效液相色譜儀（HPLC）測(cè)定各PAHs的濃度，HPLC 測(cè)試條件：ZORBAX Eclipse PAHs色譜柱，紫外檢測(cè)器，柱溫30℃，流動(dòng)相為甲醇和水，流速1mL/min，進(jìn)樣量20μL，檢測(cè)波長220nm。

降解率η的計(jì)算依據(jù)式(1)。

式中，C0為PAHs 的初始濃度，mg/L；Ct為反應(yīng)t時(shí)間后PAHs的濃度，mg/L。

1.2.8 脫氫酶活性的測(cè)定

通過測(cè)定微生物的脫氫酶活性可以了解微生物對(duì)有機(jī)污染物的氧化分解能力，按照文獻(xiàn)[24]方法：在具塞試管中，加入降解后的培養(yǎng)液、Tris-HCl 緩沖溶液（pH=8.5、0.05mol/L）、葡萄糖溶液（0.10mol/L）、TTC（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%）各2mL，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中避光反應(yīng)。反應(yīng)4h后，加入400μL濃硫酸中止反應(yīng)，并加入5mL 甲苯，1500r/min振蕩10min 進(jìn)行萃取。待反應(yīng)生成的紅色三苯基甲臜（TF）被完全萃取到有機(jī)相時(shí)，將有機(jī)相在4000r/min 下離心5min，過濾后測(cè)定濾液于486nm處的吸光度（OD486），以此表征萘降解菌的脫氫酶活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 萘降解菌的篩選及鑒定

通過增加環(huán)境選擇的壓力，逐步提高萘的濃度對(duì)菌種進(jìn)行馴化、篩選，分離到一株萘的高效降解菌株AO-4。菌株在萘選擇性培養(yǎng)基中的生長良好，驗(yàn)證了其以萘作為唯一碳源生長的能力，表明其可用于含萘污染物的生物修復(fù)。

AO-4菌株在含萘的MSM固體培養(yǎng)基上菌落呈乳白色，扁平狀，邊緣不整齊，大小不一，平均直徑約為2.0～3.0mm[圖1(a)]。顯微鏡下可見菌體為桿菌，長約1.5～3.0μm，寬約0.5～0.8μm，革蘭氏染色后呈紅色，為革蘭氏陰性細(xì)菌[圖1(b)]。桿狀細(xì)菌在污染物的微生物降解中非常常見[25-27]，因?yàn)樵诟患囵B(yǎng)過程中，桿菌比球菌能更好地適應(yīng)環(huán)境，可高效利用一些致密顆粒（如PAHs），比球菌分裂更快而成為優(yōu)勢(shì)菌群[28]。

圖1 菌株AO-4的菌落形態(tài)(a)及革蘭氏染色后細(xì)胞形態(tài)(b)

通過16S rDNA 測(cè)序及Genbank 數(shù)據(jù)庫序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株AO-4與銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的同源性最高，序列相似度達(dá)到99.9%。采用鄰域連接法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），顯示菌株AO-4 與多株銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）具有高度同源性。已有眾多研究證明，銅綠假單胞菌對(duì)多種PAHs 具有較強(qiáng)的降解能力[29-30]，如Patowary 等[31]發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌在35℃和pH=7條件下，對(duì)0.3%的萘降解率可達(dá)89.2%。

圖2 基于菌株AO-4的16S rDNA基因片段序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

綜上，依據(jù)菌株AO-4 的形態(tài)特征以及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，將菌株AO-4 鑒定為銅綠假單胞菌，此菌株16S rDNA 序列已提交到國家微生物科學(xué)數(shù)據(jù)中心（DOI：http://dx.doi.org/10.12210/sequence.NMDCN00011F3）。

2.2 萘降解途徑關(guān)鍵酶的基因檢測(cè)

假單胞菌對(duì)萘的降解通常是通過水楊酸途徑完成的[32]。萘經(jīng)萘雙加氧酶催化開環(huán)形成順-萘雙氫二醇后，在脫氫酶的催化下形成1,2-二羥基萘，再經(jīng)過一系列反應(yīng)生成水楊醛，隨后經(jīng)水楊醛脫氫酶作用形成水楊酸，水楊酸在水楊酸羥化酶催化下形成鄰苯二酚，通過鄰苯二酚2,3-雙加氧酶開環(huán)后被轉(zhuǎn)化為乙醛和丙酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)，最終被降解為H2O和CO2[33]。

選取了萘經(jīng)水楊酸代謝途徑降解的關(guān)鍵酶基因：萘雙加氧酶的鐵硫蛋白大亞基（nahAC）、水楊醛脫氫酶（nahF）、水楊酸羥化酶（nahG）和鄰苯二酚2,3-雙加氧酶（nahH）分析菌株對(duì)萘可能的降解途徑。以菌株AO-4染色體為模板進(jìn)行上述四種基因的特異性擴(kuò)增，凝膠電泳圖（圖3）上可見nahAC和nahH在750～1000bp 位置均出現(xiàn)明顯條帶，與文獻(xiàn)中假單胞菌的nahAC[20]（1009bp）、nahH[23]（923bp）基因大小基本一致，可基本判斷AO-4 的基因組中含有nahAC、nahH兩個(gè)基因。在AO-4 的基因組中未檢測(cè)到基因nahF和nahG，一方面這可能是由于該菌株對(duì)污染物萘的降解有別于已知的降解途徑；另一方面有研究表明[34]，PAHs的部分降解基因位于菌株的質(zhì)粒上，此處未對(duì)菌株的質(zhì)粒DNA進(jìn)行擴(kuò)增，這可能是nahF和nahG這兩個(gè)基因未被檢出的原因。

圖3 萘降解途徑中的部分關(guān)鍵酶基因nahG、nahF、nahAC和nahH的PCR擴(kuò)增結(jié)果

先前研究表明所有的萘降解菌都含有nahAC基因[35]，通過對(duì)萘降解途徑中的關(guān)鍵酶基因（nahAC、nahH、nahF和nahG等）進(jìn)行檢測(cè)，可以初步篩選萘降解菌株、判斷菌株的萘降解途徑[32]，但對(duì)降解途徑的進(jìn)一步探究還需對(duì)中間產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

2.3 菌株AO-4對(duì)萘的降解性能

研究考察了菌株AO-4在液體中對(duì)萘的降解能力，萘濃度為菌株馴化的最高濃度400mg/L，體系的pH為7.0，接種菌量為2%（體積分?jǐn)?shù)）。在降解過程中監(jiān)測(cè)了菌株AO-4的生長曲線、萘的降解率和菌體脫氫酶活性隨時(shí)間的變化，結(jié)果如圖4所示。

圖4 菌株AO-4對(duì)萘的降解特性

從菌株生長曲線[圖4(a)]可以發(fā)現(xiàn)，菌體濃度隨時(shí)間變化逐漸增大，在24h OD600達(dá)到0.325 后增長速度減緩，菌株生長經(jīng)歷了適應(yīng)期、對(duì)數(shù)期后將進(jìn)入穩(wěn)定期。菌株AO-4在以萘為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)液的生長再次驗(yàn)證了菌株AO-4 代謝萘的能力。

菌株AO-4對(duì)萘的降解率[圖4(b)]在反應(yīng)開始的8h內(nèi)略有增長，在8～24h之間400mg/L的萘近乎被完全降解，24h 時(shí)萘的降解率達(dá)到97.67%，48h 降解完全。這與菌株生長曲線變化趨勢(shì)相近，8～24h期間，菌株迅速生長，降解率快速攀升；24h后菌株處于穩(wěn)定期，代謝過程緩慢。高秀榮等[36]在研究玫瑰色紅球菌對(duì)芘降解特性時(shí)，也有類似現(xiàn)象，菌株在8d 降解率達(dá)到47%后，8～16d 時(shí)菌株處于穩(wěn)定期或衰亡期，降解率無明顯變化。

脫氫酶活性[圖4(c)]在前8h 升高比較緩慢，8～24h 迅速升高，在24h 后仍有緩慢增長的趨勢(shì)。PAHs 的降解是基于PAHs 的氧化，降解過程中脫氫酶可以使PAHs的氫原子活化并轉(zhuǎn)移至特定的受氫體，使PAHs 被氧化[37]。脫氫酶活性可在一定程度上反應(yīng)微生物對(duì)有機(jī)污染物的氧化降解能力。以上結(jié)果表明菌株AO-4 可有效利用400mg/L 萘作為碳源生長，菌體的脫氫酶活性，菌株生長情況與萘的降解率表現(xiàn)出正相關(guān)。

2.4 菌株AO-4降解萘的影響因素

污染物的微生物降解是基于菌體生長代謝的活性來消耗利用底物，與菌體的生長情況密切相關(guān)。此實(shí)驗(yàn)探討了菌株培養(yǎng)條件：溫度、pH、萘的初始濃度和接種量對(duì)萘降解效果的影響。

2.4.1 溫度對(duì)菌株AO-4降解萘的影響

溫度是影響微生物體內(nèi)物質(zhì)代謝過程的一個(gè)重要環(huán)境因素。溫度可以通過影響微生物酶的活性來調(diào)節(jié)體內(nèi)酶促反應(yīng)的速率，溫度還會(huì)影響底物的生物利用性能。在適宜的溫度范圍內(nèi)，生物體的代謝速率較快，可迅速地降解外源物質(zhì)。溫度單因素對(duì)AO-4降解萘的影響如圖5所示，菌株AO-4對(duì)萘的降解隨溫度升高而加快。反應(yīng)開始的10h 時(shí)內(nèi)，10℃條件下菌株AO-4 對(duì)萘的降解率僅為19.01%，隨著溫度升高降解率在30℃達(dá)到最高為97.89%；在溫度達(dá)到40℃時(shí)略有降低，降解率為93.92%。這可能由于在一定溫度范圍內(nèi)，微生物的酶活性隨著溫度的升高而增大，加速了萘的降解。菌株最適降解溫度為30℃，而40℃超過了菌株的最適生長溫度導(dǎo)致降解略有減緩之勢(shì)。反應(yīng)24h 后，10～40℃條件下萘近乎完全被降解，說明菌株AO-4可以較好的適應(yīng)10～40℃的溫度，能有效降解萘污染物。在實(shí)際污染場(chǎng)地土壤生物修復(fù)應(yīng)用中可適應(yīng)冬夏季的溫度差異，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

圖5 菌株AO-4在不同溫度條件下對(duì)萘降解的影響

2.4.2 pH對(duì)菌株AO-4降解萘的影響

微生物在一定pH 范圍內(nèi)可以正常生長代謝消耗底物。為使體系中的萘更好地被菌株降解，選取了5個(gè)pH，研究了pH對(duì)該菌降解萘的影響。實(shí)驗(yàn)選取了低于萘溶解度（34mg/L）的20mg/L 的萘濃度進(jìn)行影響因素的測(cè)試。圖6(a)為培養(yǎng)24h時(shí)AO-4對(duì)萘的降解結(jié)果，可以看出，在pH在4.0～9.0的范圍內(nèi)，菌株AO-4對(duì)萘均有不同程度的降解，該菌株對(duì)pH 環(huán)境具有良好的適應(yīng)性。培養(yǎng)24h時(shí)，pH為5.0～7.0 的降解率可達(dá)到98%以上，pH 在4.0 和9.0 的降解率相對(duì)較低，分別為74.78%、73.63%。菌株AO-4在pH為5.0到7.0范圍內(nèi)降解效果較好，過高或過低的pH 會(huì)導(dǎo)致降解率下降。這可能是因?yàn)樵谒嵝曰驂A性條件下細(xì)胞膜上的電荷發(fā)生變化，會(huì)影響菌株對(duì)底物的吸收轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致微生物生長代謝速度減慢，同時(shí)pH會(huì)影響微生物酶的空間構(gòu)象，使酶變性失活，影響菌體代謝[38]。有研究表明[39]施氏假單胞菌YC-YH1在中性pH范圍對(duì)萘的降解率接近100%，而在pH5.0和9.0時(shí)的降解率僅為20%左右。在pH 為5.0～7.0 范圍內(nèi)，由圖6(b)可以看出，萘的降解率均隨反應(yīng)時(shí)間延長逐漸提升，在24h時(shí)對(duì)萘的降解近乎完全。

圖6 菌株AO-4在不同pH條件下對(duì)萘降解的影響

2.4.3 萘初始濃度對(duì)菌株AO-4降解萘的影響

在以萘為唯一碳源的培養(yǎng)基中，萘的濃度會(huì)影響菌體的生長，進(jìn)而影響其生物降解效果[40]。萘濃度過低會(huì)因碳源不足延緩菌體的生長，而萘作為一種含有苯環(huán)的有機(jī)化合物，濃度過高會(huì)對(duì)菌體產(chǎn)生毒害作用[41]。在溫度為30℃，菌量投加量為2%，pH=7.0的條件下，研究了菌AO-4對(duì)不同萘濃度的降解效果，以明確污染物初始濃度對(duì)菌株AO-4降解萘的影響。為了排除萘溶解過程的干擾因素，實(shí)驗(yàn)選取了低于萘溶解度（31mg/L）的濃度1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖7 所示，在5mg/L、10mg/L、20mg/L萘濃度下，萘的降解率隨時(shí)間變化在8h內(nèi)迅速增長后逐漸趨于平穩(wěn)。67h時(shí)萘濃度為1mg/L、5mg/L、10mg/L和20mg/L的降解率分別為57.01%、83.76%、84.75%和96.77%。由此可見，在該體系中萘作為菌株生長的唯一碳源，1mg/L的萘濃度會(huì)延緩菌體的生長，因菌體生物量不足而使降解率偏低。而萘濃度的升高可促進(jìn)萘向細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)散，提高其生物利用度，有助于萘的轉(zhuǎn)化降解。

圖7 菌株AO-4對(duì)不同初始萘濃度的降解

2.4.4 接種量對(duì)菌株AO-4降解萘的影響

降解菌的生物量是影響微生物對(duì)污染物降解的重要因素，較高的生物量可使得更多的降解菌參與污染物的降解，加快降解進(jìn)程[42]。本文研究了菌株接種量為0、1%、2%、5%（體積分?jǐn)?shù)）對(duì)萘降解的影響。如圖8(a)所示，在沒有接種菌的情況下，萘的降解率在1h達(dá)到34.49%后基本保持平穩(wěn)，這可能是由于萘的自然降解及揮發(fā)所導(dǎo)致，萘?xí)凑找欢ū壤蜃杂上鄶U(kuò)散，而所測(cè)定的萘均為溶解態(tài)的萘。在培養(yǎng)0.5h內(nèi)，接種菌量未對(duì)萘的降解造成明顯影響。因?yàn)榕囵B(yǎng)時(shí)間較短，菌體尚未進(jìn)入生長對(duì)數(shù)期。反應(yīng)1h 后，菌量因素對(duì)萘降解產(chǎn)生明顯影響。隨著接種量的增大，萘的降解率逐漸提高。培養(yǎng)3h 時(shí)，接種量為1%、2%、5%菌株對(duì)萘的降解率分別為46.02%、50.31%、54.5%。如圖8(b)所示，在12h 內(nèi)，接種量為1%、2%和5%的降解率依次為56.37%和64.90%和73.66%。24h 后，各組細(xì)菌降解率均達(dá)到96%以上，基本完成了對(duì)萘的降解。由此可見，在該體系中，加大降解菌接種量會(huì)在短期內(nèi)（12h）加速對(duì)萘的降解，經(jīng)過一定時(shí)間當(dāng)菌體繁殖達(dá)到一定菌量后，接種量對(duì)污染物降解的影響不明顯。因?yàn)榘凑瘴⑸镎ＩL曲線，菌體經(jīng)過對(duì)數(shù)期的迅速繁殖后將進(jìn)入平穩(wěn)期，菌體受限于環(huán)境及培養(yǎng)基不會(huì)無限繁殖，菌量將保持平穩(wěn)。

圖8 菌株AO-4在不同接種量條件下對(duì)萘降解的影響

2.5 菌株AO-4對(duì)PAHs降解的廣譜性

2.5.1 菌株AO-4對(duì)單一PAHs的降解

實(shí)際污染場(chǎng)地通常涉及多種PAHs 的污染，為探討菌株降解的廣譜性，進(jìn)一步測(cè)試了該降解菌AO-4對(duì)其他4種常見PAHs芴、菲、蒽和芘各自的降解能力。實(shí)驗(yàn)中5種污染物萘、芴、菲、蒽和芘的初始濃度各為50mg/L（各體系污染物濃度為50mg/L），體系pH 為7.0，菌量為5%（OD600=1）。菌株AO-4 對(duì)不同PAHs 的降解率見圖9，菌株對(duì)5 種污染物有不同程度的降解。萘的降解率在24h達(dá)到99.85%，菲、芴、芘和蒽的降解率分別為23.94%、18.16%、7.44%和2.47%，反應(yīng)至5d 時(shí)，萘、菲、芴、芘和蒽降解率分別達(dá)到100%、33.13%、24.70%、14.84%和7.30%，表明該菌可不同程度降解萘、菲、芴、芘和蒽。PAHs 的生物降解與污染物的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，萘含有2個(gè)苯環(huán)，芴和菲同屬于3環(huán)的PAHs，但芴的兩個(gè)苯環(huán)中間含一個(gè)5環(huán)的稠環(huán)芳烴[43]，難于降解，所以對(duì)萘的降解率高于菲，對(duì)芴的較低。高闖等[44]研究也發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌對(duì)菲的降解率高于芴，84h后對(duì)50mg/L的芴、菲的降解率分別為23.47%、34.83%。隨著苯環(huán)數(shù)量的增加，PAHs 的降解難度增大[45]。芘為4 環(huán)的PAHs，比3 環(huán)的PAHs 難降解。Zhang 等[46]研究了銅綠假單胞菌DQ8對(duì)PAHs 的降解特性，發(fā)現(xiàn)DQ8可有效降解3 環(huán)和4 環(huán)的PAHs，且4 環(huán)PAHs 比3 環(huán)PAHs 更難降解；且在四種PAHs（芴、菲、蒽、芘）混合體系中，菲和芴可在7d 內(nèi)被完全降解，但蒽和芘在12d 之內(nèi)分別只被降解了40.50%和34.50%。菌株AO-4對(duì)蒽的降解率較小，可能是因?yàn)檩煸谒械娜芙舛容^小，導(dǎo)致其生物利用度較低。

圖9 菌株AO-4對(duì)單一體系PAHs（萘、菲、芴、芘和蒽）的降解

2.5.2 菌株AO-4對(duì)混合PAHs的降解

環(huán)境介質(zhì)中的PAHs 多以混合形式存在，考察菌株對(duì)混合PAHs 的降解效果具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。菌株AO-4 對(duì)混合PAHs 的降解效果如圖10 所示。5種污染物萘、芴、菲、蒽和芘的初始濃度均為50mg/L（總體系污染物濃度為250mg/L），體系pH為7.0，菌量為5%（OD600=1）。由圖可知，菌株對(duì)混合的5種污染物有不同程度的降解。萘的降解率在1d達(dá)到99.54%后保持平穩(wěn)，芴、菲、蒽和芘的降解率分別為8.79%、5.14%、1.55%和0.06%；發(fā)現(xiàn)菌株AO-4優(yōu)先以萘為碳源，萘的降解主要發(fā)生在1d 內(nèi)，而其他PAHs 的降解率隨著PAHs 環(huán)數(shù)的增加而下降，說明菌株AO-4 優(yōu)先以低環(huán)PAHs為碳源。張娟琴等[47]研究菌株B5 降解混合PAHs（萘、蒽、芘）時(shí)也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，萘在混合體系中72h降解率可達(dá)99.13%，而對(duì)蒽和芘的降解率分別為87.25%、75.07%。反應(yīng)至5d時(shí)，芴、菲、蒽和芘降解率分別為20.95%、18.28%、4.75%和4.44%，均低于單一體系。這可能是因?yàn)镻AHs種類和濃度的增加顯著抑制了降解菌的活性。高秀榮等[36]也有類似發(fā)現(xiàn)，菌株Q3 對(duì)單一底物菲、芘和苯并[a]芘降解率可達(dá)到98%、47%和65%；而對(duì)混合PAHs中的菲、芘和苯并[a]芘降解率僅為57%、29%和33%。盧曉霞等[48]研究了單一菌株在16 種PAHs 混合物初始總量分別為17μg/mL 和166μg/mL 時(shí)的生長情況，發(fā)現(xiàn)菌株在低濃度的PAHs 中生長良好，能降解低環(huán)PAHs，而在高濃度的PAHs 中菌株的生長和活性受到了抑制。經(jīng)過5d 的降解，混合體系菌株AO-4 對(duì)5 種PAHs 降解能力大小順序?yàn)檩?芴>菲>蒽>芘，這可能與PAHs 在水中的溶解度相關(guān)，水溶性越好的PAHs更易被生物利用。萘為2環(huán)PAHs，芴為3環(huán)，25℃其在水中的溶解度分別為31mg/L、1.69mg/L。菲與蒽均為3 環(huán)PAHs，且為同分異構(gòu)體，但蒽為線性分子，菲是角性分子，一般來說角性分子比線性分子在水中的溶解度大，25℃時(shí)菲和蒽在水中的溶解度分別為1.15mg/L 和0.04mg/L[49]，導(dǎo)致在混合體系中菲比蒽更容易被利用。芘為4 環(huán)PAHs，隨著環(huán)數(shù)的增加，其疏水性和毒性比其他四種PAHs 更大。Sharma 等[50]也發(fā)現(xiàn)混合菌株在7d 對(duì)芴、菲、蒽和芘的降解率分別為75%、67.8%、52.2%和39.2%，隨著環(huán)數(shù)的增加，降解率也在降低。

圖10 菌株AO-4對(duì)混合體系PAHs（萘、芴、菲、蒽和芘）的降解

3 結(jié)論

（1）從焦化污染土壤中分離篩選得到1株萘高效降解菌AO-4，通過形態(tài)結(jié)合16S rDNA序列，將其鑒定為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。

（2）在菌株AO-4的染色體中可檢測(cè)到萘代謝途徑（水楊酸代謝途徑）中的關(guān)鍵酶基因，萘雙加氧酶基因（nahAC）和兒茶酚2,3-雙加氧酶基因（nahH）。推測(cè)AO-4對(duì)萘的降解是以水楊酸途徑進(jìn)行降解的，進(jìn)一步的判斷需要對(duì)其中間產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

（3）菌株AO-4 對(duì)400mg/L 萘的降解率在24h可達(dá)97.67%，降解過程中菌株的生長、脫氫酶活性與萘的降解率表現(xiàn)為正相關(guān)。

（4）菌株AO-4可降解從1～400mg/L濃度的萘，降解率受萘初始濃度、溫度、pH 和菌量的影響，最適降解溫度為30℃、pH 為5.0～7.0；在一定范圍內(nèi)，菌株降解能力隨著菌量（體積分?jǐn)?shù)1%～5%）和初始濃度（1～20mg/L）的增大而增強(qiáng)。

（5）菌株AO-4 對(duì)PAHs 的降解具有廣譜性，可有效降解萘、菲、芴、芘和蒽。在單一體系中，對(duì)萘、菲、芴、芘和蒽5d 的降解率分別為100%、33.13%、24.70%、14.84%和7.30%；混合體系中，對(duì)萘、芴、菲、蒽和芘5d 的降解率分別為100%、20.95%、18.28%、4.75%和4.44%。

致謝：感謝山西靖田會(huì)澤環(huán)境科技有限公司為本研究提供了部分資金支持！