經(jīng)方化裁射麻湯煮散工藝優(yōu)化與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

劉金花 寧帶連 傅 靜 李曉霞 馬家寶 唐愛存

廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023

哮喘是屬于中醫(yī)“哮病”的范疇，最早收載于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，屬于小兒呼吸系統(tǒng)常見病[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國14歲以下兒童哮喘的發(fā)病率正處于上升態(tài)勢，患病率已達(dá)3.02%，全國每年治療哮喘的費(fèi)用高達(dá)數(shù)十億[2]。目前西醫(yī)用解除氣道痙攣、消除炎癥等治療，用藥主要以支氣管擴(kuò)張劑、糖皮質(zhì)激素等為主，但副作用大，影響患兒肺功能的恢復(fù)，會反復(fù)性發(fā)作[3]。中醫(yī)藥治療哮喘有著獨(dú)特的療效。射干麻黃湯經(jīng)方收載于張仲景的《金匱要略》，主治寒痰郁肺、痰飲喘咳證，癥見“咳而上氣，喉中痰鳴像水雞之聲”，臨床上常用于治療兒童哮喘屬寒性哮喘者[4]。小青龍湯經(jīng)方收載于張仲景的《傷寒論》中，主治外寒內(nèi)飲證，是治療風(fēng)寒水飲而致咳喘之驗(yàn)方[5]。實(shí)驗(yàn)中射麻湯煮散是由經(jīng)典名方“射干麻黃湯”和“小青龍湯”聯(lián)合加減化裁而成，由射干、蜜麻黃、干姜、細(xì)辛、款冬花、法半夏、化橘紅、炒紫蘇子、炒芥子、炙甘草等組成。臨床基于小兒哮喘以風(fēng)寒為主的理論，組方以疏風(fēng)化痰、降氣平喘為出發(fā)點(diǎn)，選藥簡短精煉，安全有效。

中藥煮散是指將中藥飲片粉碎成粗顆粒再與水一同煎煮，去掉藥渣留取藥汁制成的液體藥劑。煮散類似于湯劑，又兼具散劑特點(diǎn)，方便包裝調(diào)劑，可節(jié)約1/3～1/2的藥源[6-7]。煮散具有藥效起效快、吸收好的特征，可隨證加減，從而降低成本[8]，易于醫(yī)患雙方接受。射麻湯煮散是采用中藥煮散機(jī)理，經(jīng)粉碎、干燥等工序制成的一種能夠高效煎出有效成分的新制劑，具有可開發(fā)性。前期實(shí)驗(yàn)將臨床應(yīng)用多年的射麻湯，按照散劑這一傳統(tǒng)劑型的傳統(tǒng)制備方法制成煮散劑，但配制工藝未進(jìn)行優(yōu)選且該制劑尚無控制其質(zhì)量的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。本研究通過正交試驗(yàn)，對射麻湯煮散工藝條件進(jìn)一步優(yōu)化，并初步建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，從而創(chuàng)新性地研制開發(fā)出療效好、質(zhì)量可控的新制劑品種，為其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀；Mili-Q型多功能超純水機(jī)(默克化工技術(shù)上海有限公司)；2000T高速多功能粉碎機(jī)(永康市鉑歐五金制品有限公司)；KQ5200B型超聲波清洗器(昆明市超聲儀有限公司)；XSR205十萬分之一分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；JJ500型電子天平(常熟市雙杰測試儀器廠)；H1650型離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；YOKO-CS紫外線透射反射成像儀(武漢藥科新技術(shù)開發(fā)有限公司)等。

1.2 試劑與試藥 實(shí)驗(yàn)所用中藥飲片均購自廣西仙茱中藥有限公司，符合《中國藥典》2020年版一部標(biāo)準(zhǔn)，鹽酸麻黃堿(ephedrine hydrochloride，批號：171241-201809)、鹽酸偽麻黃堿(pseudoephedrine hydrochloride，批號：171237-201510)、射干對照藥材(批號：120944-201206)均來自中國食品藥品檢定研究院；射麻湯煮散(批號：20220218、20220223、20220225)和各陰性樣品來自廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室中心；甲醇、乙腈(色譜純，賽默飛世爾科技有限公司)；其余試劑均為分析純；硅膠GF254薄層板和1%NaOH溶液制備的硅膠G薄層板，購于青島海洋化工廠。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)法優(yōu)化射麻湯煮散工藝 煎煮工藝優(yōu)選：評價指標(biāo)(鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿含量)，工藝粉碎度(A)、煎煮時間(B)、加水量(C)為影響因素，按處方比例稱取10味藥材粉末，共9份。工藝方案設(shè)計(jì)見表1，L9(34)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2，結(jié)果分析見表3、表4。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表2 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果表

表3 鹽酸麻黃堿方差分析結(jié)果表

表4 鹽酸偽麻黃堿方差分析結(jié)果表

由正交試驗(yàn)直觀分析可知，工藝粉碎度(A)對評價指標(biāo)影響最大，其次是加水量(C)，最后是煎煮時間(B)，各水平因素對評價指標(biāo)的影響大小依次是A3>A1>A2，B1>B2>B3，C3>C2>C1。通過方差分析結(jié)果可知，工藝粉碎度對評價指標(biāo)(鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿含量)有顯著性差異，考察因素加水量和煎煮時間無顯著性。最終確定，射麻湯煮散最佳煎煮工藝為A3B1C3，即粉碎度為40目，12倍加水量，煎煮時長5 min。

2.2 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

2.2.1 定性鑒別

2.2.1.1 麻黃 取煮散粉末5 g，加水60 mL，煎煮5 min，移取上清液蒸干，加甲醇20 mL，超聲10 min，過濾，蒸干，用1 mL甲醇溶解，得供試品溶液。稱取1 mg鹽酸麻黃堿對照品，用1 mL甲醇溶解，得對照品溶液。取麻黃陰性樣品，同供試品溶液制備方法，得陰性對照。依次吸取陰性對照、供試品各5 μL，對照品2 μL，點(diǎn)在同一個硅膠G板上，在展開缸中加入三氯甲烷-甲醇-濃氨(20∶3.5∶0.5)的混合液飽和，將硅膠板放入，展開至溶劑前沿，拿出，晾干，茚三酮試液均勻噴在硅膠板上，置烘箱105 ℃進(jìn)行加熱，斑點(diǎn)清晰顯現(xiàn)，日光下檢視。結(jié)果供試品與對照品色譜相對應(yīng)位置上，顯同樣紅色的斑點(diǎn)，陰性無此斑點(diǎn)。如圖1所示。

1：陰性對照品；2～4：供試品；5：對照品圖1 麻黃的TLC鑒別圖

2.2.1.2 射干 取煮散粉末5 g，加水60 mL，煎煮5 min，移取上清液蒸至近干，加甲醇30 mL，超聲30 min，取出，濾過，蒸干，用25 mL水溶解，用三氯甲烷萃取2次，每次25 mL，棄去三氯甲烷，然后用乙酸乙酯萃取2次，每次25 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，用1 mL甲醇溶解，得供試品溶液。取射干對照藥材1 g，加水60 mL，煎煮10 min，離心取上清液，用三氯甲烷萃取，同供試品溶液制備方法，得對照藥材溶液。另取射干的陰性樣品，同供試品溶液制備方法，得陰性對照。依次吸取陰性對照、供試品各5 μL，對照藥材溶液2 μL，點(diǎn)在同一個硅膠GF254薄層板，在展開缸中加入乙酸乙酯-甲醇-水(10∶1∶0.5)的混合液飽和，將硅膠GF254板放入，展開至溶劑前沿，拿出，晾干，在紫外燈(245 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無此斑點(diǎn)。如圖2所示。

1：陰性對照品；2～4：供試品；5：對照藥材溶液圖2 射干的TLC鑒別圖

2.2.2 含量測定

2.2.2.1 色譜條件 色譜柱：Venusil XBP Phenyl-hexyl(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.2%磷酸(B)等度洗脫(0～25 min，4%A～96%B)；流速1 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：210 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2.2 混合對照品溶液的配制 取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對照品，精密稱定，加甲醇，分別配制成濃度為1.077 mg/mL、1.019 mg/mL的對照品溶液。分別從上述兩種對照品液精密移取2 mL、1 mL于25 mL容量瓶，加甲醇，定容至刻度，混勻，制得了濃度為0.0862 mg/mL、0.0408 mg/g的混合對照品液，備用。

2.2.2.3 溶液制備 供試品溶液：按優(yōu)化煮散工藝制備，即稱取過40目篩的煮散粉末20 g，加12倍水煎煮5 min，藥液趁熱用紗布過濾，轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，定容至刻度。精密移取5 mL至10 mL容量瓶，加甲醇，定容至刻度，離心，留取上清溶液，經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)，濾過，備用。陰性對照溶液：稱取麻黃陰性樣品，同供試品制備方法制成陰性對照液。

2.2.2.4 專屬性試驗(yàn) 取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照液、空白對照溶液按照色譜條件分別進(jìn)樣，結(jié)果顯示，1號峰和2號峰歸屬于麻黃，且陰性無干擾。如圖3所示。

A.混合對照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性對照溶液；D.空白對照溶液；1.鹽酸麻黃堿；2.鹽酸偽麻黃堿圖3 HPLC 色譜圖

2.2.2.5 線性關(guān)系考察 取上述混合對照品溶液，依次吸取1 μL、3 μL、5 μL、6 μL、8 μL、10 μL進(jìn)樣，分別記錄峰面積，以橫坐標(biāo)(進(jìn)樣量)，縱坐標(biāo)(峰面積)作線性回歸。結(jié)果如圖4所示、見表5。

圖4 鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿標(biāo)準(zhǔn)曲線

表5 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述混合對照品溶液10 μL，按色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針，計(jì)算鹽酸麻黃堿峰面積RSD值為1.87%，鹽酸偽麻黃堿峰面積RSD值為1.76%，說明儀器的精密度良好。

2.2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，按色譜條件分別在0 h、2 h、4 h、6 h、10 h、14 h、18 h、24 h進(jìn)樣測定，計(jì)算鹽酸麻黃堿峰面積RSD值為0.99%，鹽酸偽麻黃堿峰面積RSD值為2.65%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)均穩(wěn)定。

2.2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取同一批次煎煮液6份，每份5 mL，同“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液方法配制供試品液，并按色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算鹽酸麻黃堿含量RSD值為2.51%，鹽酸偽麻黃堿含量RSD值為2.85%，說明方法的重復(fù)性良好。

2.2.2.9 加樣回收試驗(yàn) 精密吸取已知含量的射麻湯煎煮液樣品6份，每份2.5 mL，分別加入一定量的鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對照品，同“2.2.2”項(xiàng)下配制供試品溶液方法制備供試品，并按色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算鹽酸麻黃堿平均加樣回收率為101.19% (RSD=2.50%)和鹽酸麻黃堿平均加樣回收率為100.39%(RSD=2.59%)，說明方法的準(zhǔn)確度高。結(jié)果見表6。

表6 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

表7 射麻湯煮散含量測定結(jié)果

2.2.2.10 射麻湯煮散含量測定 根據(jù)上述建立的色譜方法，檢測3批射麻湯煮散含量，同“2.2.2”項(xiàng)下的方法配制供試品溶液，采用上述色譜條件，測得鹽酸麻黃堿平均含量為4.1698 mg/g，鹽酸偽麻黃堿平均含量為1.8964 mg/g。綜上說明，射麻湯煮散工藝穩(wěn)定、可靠，定性鑒別和含量測定方法準(zhǔn)確度高，操作簡便，適于射麻湯煮散的質(zhì)量控制。

3 討論

3.1 工藝優(yōu)化評價指標(biāo)的選擇 在優(yōu)選射麻湯煮散工藝研究中，評價指標(biāo)選擇了鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿。該煮散以麻黃為君藥，主要發(fā)揮宣肺平喘之效，起到治療作用的主要成分是鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿[9]，鹽酸麻黃堿的平喘作用顯著[10-11]，麻黃堿與偽麻黃堿自身也具有平喘之功，β2受體激動劑又是從麻黃堿中提取得到治療支氣管哮喘急性發(fā)作的基礎(chǔ)藥物。射麻湯煮散成分復(fù)雜，已知成分更是有限，故在優(yōu)選射麻湯煮散工藝的正交試驗(yàn)中，選擇治療咳喘癥狀可能發(fā)揮主要平喘效果的化學(xué)成分作為試驗(yàn)測定的目標(biāo)成分。在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的定性鑒別與含量測定研究中，同樣以鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿作為主要目標(biāo)成分進(jìn)行質(zhì)量控制，以保證射麻湯煮散的質(zhì)量。

3.2 正交試驗(yàn)影響因素的考察 通過對射麻湯煮散飲片進(jìn)行粉碎，將工藝粉碎度、煎煮時長、加水量作為影響因素進(jìn)行考察，進(jìn)行正交試驗(yàn)，方差分析表明粉碎度對目標(biāo)成分鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿含量影響顯著，而影響煮散有效成分煎出率的因素主要是煮散粉末粒徑[12-14]，最佳粉末粒徑可使煮散最大限度地溶出目標(biāo)成分。由于處方中蜜麻黃、干姜、炙甘草具較強(qiáng)的纖維性，在選擇煮散粒徑時不僅滿足有效成分煎出率，還要考慮其實(shí)際生產(chǎn)，選擇較寬的粉碎度范圍(10～40目)，生產(chǎn)煮散時，收粉率較高，節(jié)省藥材資源。試驗(yàn)結(jié)果顯示煎煮時間對煮散有效成分的含量影響最小，節(jié)約煎煮時間且方便調(diào)劑是煮散自身優(yōu)勢，臨床上更具可行性。

本研究優(yōu)化的射麻湯煮散工藝條件合理穩(wěn)定，質(zhì)量控制方法簡單，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，可有效提高射麻湯煮散的質(zhì)量可控性，將值得對其開展更全面完善的研究，填補(bǔ)中藥煮散在臨床應(yīng)用中的空缺，同時為傳統(tǒng)中藥民族藥制劑應(yīng)用形式的創(chuàng)新提供了新思路，值得推廣應(yīng)用。