桃熱激轉(zhuǎn)錄因子PpHSF18 基因的克隆及功能分析

李天豪 張杰 高紅珠 魏鵬程 鄭先波 連曉東 王小貝 張海朋 程鈞 王偉 譚彬 馮建燦

摘要：【目的】克隆桃熱激轉(zhuǎn)錄因子PpHSF18 基因，分析其在2 種樹型桃中的表達(dá)，探究其在分枝角度形成中的功能?！痉椒ā繙y定一年生普通型桃大久保和柱型桃灑紅龍柱枝條不同生長時(shí)期分枝角度，并分析11 個(gè)桃PpHSFAs 基因在2 種樹型中的表達(dá)；克隆PpHSF18 基因，構(gòu)建PpHSF18 基因的過表達(dá)載體，并進(jìn)行擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化，探究其對擬南芥株型和分枝角度的影響?！窘Y(jié)果】柱型桃品種灑紅龍柱枝條分枝角度顯著小于普通型桃大久保，大久保桃分枝角度隨著枝條生長逐漸增大，而灑紅龍柱桃分枝角度變化不明顯；11 個(gè)桃A類HSF轉(zhuǎn)錄因子家族基因在2 種樹型桃莖尖中的表達(dá)呈3 種趨勢，其中PpHSF18 與PpLAZY1 呈相同表達(dá)趨勢，即在柱型桃中表達(dá)量顯著高于普通型桃，且與水稻OsHSFA2D同源性最高；PpHSF18 三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系分枝角度均小于野生型擬南芥分枝角度，表明PpHSF18 參與植物分枝角度的形成?！窘Y(jié)論】過表達(dá)PpHSF18 導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥分枝角度變小，為進(jìn)一步解析PpHSF18 在桃分枝角度形成中的作用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：桃；熱激轉(zhuǎn)錄因子；分枝角度；柱型

中圖分類號(hào)：S662.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2023）05-0852-09

分枝（蘗）角度是形成“理想樹（株）型”的重要組成部分，其與產(chǎn)量形成、環(huán)境適應(yīng)和競爭能力密切相關(guān)。遺傳因素、植物激素、重力向地性和環(huán)境因素等在植物分枝（蘗）角度形成中發(fā)揮重要作用[1]。

熱激轉(zhuǎn)錄因子（heat shock transcription factor，HSFs）是植物中研究最廣泛的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的差異，植物HSFs 可分為A、B、C三類[2]，其中只有A類HSFs 成員C末端含有具有轉(zhuǎn)錄激活功能的AHA基序，因此現(xiàn)有的對植物熱激轉(zhuǎn)錄因子的研究主要集中在A類，B類和C類研究相對較少[3]。A類熱激轉(zhuǎn)錄因子作為熱脅迫的重要調(diào)控因子，通過調(diào)控?zé)峒さ鞍祝╤eat shock protein，HSPs）等多種類型基因的表達(dá)來參與植物熱脅迫響應(yīng)[4-5]；此外，A類熱激轉(zhuǎn)錄因子還參與了干旱、鹽等非生物脅迫[6-7]。近年來對A類熱激轉(zhuǎn)錄因子的研究發(fā)現(xiàn)其在植物樹（株）型相關(guān)性狀的形成中也發(fā)揮了重要的作用。Zhang 等[8]研究發(fā)現(xiàn)水稻hsfa2d 突變體植株表現(xiàn)分蘗角度增大，hsfa2d/lazy1 雙突變體表現(xiàn)出比二者單突變體更大的分蘗角度，且OsLAZY1基因過表達(dá)能夠挽救hsfa2d 突變體表型，而LAZY1基因?qū)儆贗GT 基因家族，在分蘗（枝）角度形成中具有非常重要的作用。過表達(dá)AtHsfA3、AtHsfA2 和OsHsfA2e 的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株均出現(xiàn)（極）矮化表型[9-10]；過表達(dá)苣苔（Boea hygrometrica）A類BhHsf1的轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草植株生長受阻，均表現(xiàn)矮化表型，同時(shí)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的葉片、花序、果莢均變小[11]。

桃（Prunus persica L.）是世界最重要的果樹之一，原產(chǎn)中國，種質(zhì)資源豐富。依據(jù)樹高和分枝角度的不同，桃樹型可分為普通型、矮化型、半矮化型、柱型、直立型、垂枝型和曲枝型[12-13]。目前桃生產(chǎn)上主栽品種主要為普通型，其樹型開張，分枝角度過大，隨著結(jié)果年限延長，樹冠內(nèi)枝葉密集，中下部透光差，是限制桃園產(chǎn)量的主要因素，也在一定程度上影響了果實(shí)品質(zhì)提升。柱型桃是桃資源中的一類特異種質(zhì)，與普通型桃相比，柱型桃樹冠較小，具有分枝角度小、側(cè)枝數(shù)量少等特點(diǎn)[14-15]。發(fā)掘控制桃分枝角度相關(guān)基因，通過分子育種手段對現(xiàn)有主栽桃品種樹型進(jìn)行改良具有重要意義。筆者在本研究中以普通型桃大久保和柱型桃灑紅龍柱為試驗(yàn)材料，分析2 個(gè)品種一年生植株分枝角度差異，通過2 個(gè)品種莖尖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出與水稻中調(diào)控分蘗角度的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子OsHSFA2D 基因[8]的同源基因桃A 類HSF轉(zhuǎn)錄因子PpHSF18，克隆PpHSF18 基因并對其功能進(jìn)行研究，為后續(xù)桃分枝角度分子機(jī)制研究提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

一年生普通型桃大久保（Okubo，O）和柱型桃灑紅龍柱（Sahonglongzhu，S）于2019 年12 月栽植于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)三區(qū)果樹試驗(yàn)站，采取莖尖進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，采取嫩葉用于RNA的提取和后續(xù)基因克隆等試驗(yàn)，所有樣品采集后迅速置于液氮中速凍，帶回實(shí)驗(yàn)室后放于-80 ℃超低溫冰箱保存；并以大久保和灑紅龍柱一年生植株為試材進(jìn)行分枝角度測定。采用一年生大久保和灑紅龍柱分枝連接處進(jìn)行PpHSFA18 基因相對表達(dá)量測定。采用野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana ecotype Columbia）進(jìn)行PpHSFA18基因功能驗(yàn)證。

1.2 一年生桃植株分枝角度測量

從5 月5 日開始到5 月30 日，每隔5 d 用SC-K1原位活體植物分枝角自動(dòng)測量儀系統(tǒng)（杭州萬深）分別測量大久保和灑紅龍柱一年生枝條的基角（一年生枝與主干的夾角），每處理選取3 棵長勢一致的植株，從每棵植株隨機(jī)選取3 個(gè)枝條測定其分枝角度并記錄，3 次重復(fù)。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測序和表達(dá)分析

大久保（O）和灑紅龍柱（S）莖尖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)參考譚彬等[16]的研究，基于轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析桃中11個(gè)HSF家族A類基因[17（] 包含PpHSF18基因）、PpLAZY1 基因和PpTAC1 基因在大久保和灑紅龍柱莖尖中的表達(dá)量，并利用TBtools v0.6733 軟件[18]繪制表達(dá)量熱圖。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析候選基因PpHSF18 在大久保和灑紅龍柱一年生枝條分枝連接處的表達(dá)量。

1.4 PpHSF18 基因克隆及過表達(dá)載體構(gòu)建

利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)PpHSF18基因CDS（Coding sequence，編碼區(qū)）全長引物PpHSF18-F1 和PpHSF18-R1（引物序列見表1），以普通型桃大久保葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序、PCR產(chǎn)物回收、連接及轉(zhuǎn)化大腸桿菌步驟參照譚彬等[19]的方法進(jìn)行。將PCR檢測呈陽性的單菌落活化后送至武漢擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序，使用MEGA7.0軟件將測序結(jié)果與參考序列進(jìn)行比對。

利用Primer premier 5.0設(shè)計(jì)含Hind Ⅲ和Xba Ⅰ酶切位點(diǎn)的引物PpHSF18-F2 和PpHSF18-R2（引物序列見表1），PCR擴(kuò)增和載體構(gòu)建參照譚彬等[19]的方法進(jìn)行。

1.5 PpHSF18 遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥及其鑒定分析

將構(gòu)建好的pSAK277-35S：：PpHSF18 過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101 菌株，使用蘸花法侵染擬南芥[20]，待果莢成熟時(shí)收取T0代種子。T0代擬南芥植株培養(yǎng)、葉片DNA和RNA提取、PCR擴(kuò)增和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法參照譚彬等[19]的方法進(jìn)行，以擬南芥AtUBC 基因?yàn)閮?nèi)參基因，引物序列見表1。對T2代陽性擬南芥植株分枝角度進(jìn)行測定，每株系選取3 株，每株選取3 個(gè)枝條，3 次重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用SPSS 17.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，采用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種樹型桃枝條不同發(fā)育期分枝角度變化

對一年生普通型桃大久保和柱型桃灑紅龍柱植株枝條不同發(fā)育階段分枝角度進(jìn)行測量（圖1-A）。普通型桃大久保分枝角度顯著大于柱型桃品種灑紅龍柱分枝角度（圖1-B）。隨著枝條發(fā)育，大久保桃分枝角度逐漸增加，從62°顯著增加到76°，而灑紅龍柱桃枝條分枝角度在整個(gè)發(fā)育時(shí)期沒有顯著變化（31°～34°），但是均顯著低于大久保各個(gè)時(shí)期分枝角度。綜上分析，2 個(gè)品種間分枝角度及其分枝角度變化規(guī)律均存在差異。

2.2 PpHSFAs在2種不同樹型桃中的表達(dá)分析

PpTAC1 和PpLAZY1 是同屬于IGT 家族的一對作用相反的控制植物分枝角度的關(guān)鍵基因[21]。對普通型桃大久保和灑紅龍柱莖尖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中HSF家族中11 個(gè)A類基因、PpTAC1 和PpLAZY1 表達(dá)趨勢進(jìn)行分析（圖2-A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PpTAC1 和PpLAZY1表達(dá)趨勢相反，PpTAC1 在大久保中表達(dá)量高于灑紅龍柱中表達(dá)量，而PpLAZY1 則相反。PpHSF16在2 種樹型中均不表達(dá)，其余PpHSFs 基因呈現(xiàn)2 種表達(dá)趨勢，PpHSF2、PpHSF3、PpHSF10、PpHSF11 和PpHSF14 與PpTAC1 表達(dá)趨勢一致，表現(xiàn)為在大久保中表達(dá)量高于灑紅龍柱（圖2-A）；而PpHSF1、PpHSF4、PpHSF7、PpHSF9、PpHSF18 與PpLAZY1 表達(dá)趨勢一致，表現(xiàn)為在灑紅龍柱中表達(dá)量高于大久保（圖2-A），其中，PpHSF18 與水稻OsHSFA2D高度同源（E-value = 1e-120）（圖2-B），OsHSFA2D是Os-LAZY1 上游正調(diào)節(jié)因子[8]，故推測PpHSF18 可能參與調(diào)控桃分枝角度。

為進(jìn)一步明確PpHSF18 基因的表達(dá)模式，以一年生大久保和灑紅龍柱的分枝連接處（O 和S），分枝連接處上（O-Upper 和S-Upper）和分枝連接處下（O-Lower 和S-Lower）為材料檢測PpHSF18的相對表達(dá)量，分析發(fā)現(xiàn)PpHSF18 基因在灑紅龍柱分枝連接處及分枝連接處上下部相對表達(dá)量均顯著高于大久保。PpHSF18 基因相對表達(dá)量與2 種樹型桃枝條分枝角度大小呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（圖3）。

2.3 PpHSF18 基因克隆與過表達(dá)載體構(gòu)建

以大久保嫩葉cDNA為模板進(jìn)行PpHSF18 基因CDS 區(qū)全長（1080 bp）擴(kuò)增，結(jié)果顯示，PpHSF18 基因CDS 區(qū)大小為1000 bp 左右（圖4-A）；測序結(jié)果顯示，PpHSF18 基因CDS 區(qū)序列與參考基因組無差異，編碼359 個(gè)氨基酸，與OsHSFA2D蛋白序列比對顯示，均包含HSF家族基因保守結(jié)構(gòu)域（圖2-B）。將PpHSF18 基因CDS區(qū)序列與酶切后的pSAK277 過表達(dá)載體進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化（圖4-B），挑取單菌落進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，結(jié)果顯示，PCR 產(chǎn)物條帶位于1000 bp 左右的位置，說明目的基因成功連接至pSAK277 載體，PpHSF18 基因過表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥篩選與鑒定

用包含pSAK277-35S：：PpHSF18 過表達(dá)載體的農(nóng)桿菌進(jìn)行擬南芥侵染，在含有卡那霉素的抗性培養(yǎng)基上篩選擬南芥種子，獲得4 株T0代抗性苗。進(jìn)一步通過PCR 驗(yàn)證，4 株T0代抗性苗均能擴(kuò)出目的基因條帶（圖5-A），說明4 株抗性苗均為PpHSF18轉(zhuǎn)基因陽性苗。

利用qRT-PCR 檢測PpHSF18 基因在4 個(gè)T0 代轉(zhuǎn)基因植株中的相對表達(dá)量，結(jié)果（圖5-B）顯示，相較于WT植株，L1～L4 四個(gè)轉(zhuǎn)基因植株中PpHSF18表達(dá)量均顯著高于WT植株，其中L1 表達(dá)量最高，L4 次之，L2 和L3 之間沒有明顯差異，表明PpHSF18基因已成功整合到4 個(gè)轉(zhuǎn)基因植株的基因組中并發(fā)揮作用。

2.5 過表達(dá)PpHSF18 轉(zhuǎn)基因擬南芥表型觀察與分析

對3 個(gè)T2代陽性轉(zhuǎn)基因擬南芥株系進(jìn)行分枝角度觀測和統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，與WT 植株相比，PpHSF18 過表達(dá)株系的分枝角度顯著減?。▓D6-A），且WT擬南芥的“冠層”顯著大于3 個(gè)PpHSF18轉(zhuǎn)基因株系（圖6-B）。對WT和過表達(dá)株系分枝角度進(jìn)行測量，WT植株分枝角度在60°左右；而過表達(dá)株系的分枝角度為40°左右。進(jìn)一步的方差分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)株系植株分枝角度極顯著低于WT（p＜0.01）（圖6-C），表明過表達(dá)PpHSF18 基因?qū)е聰M南芥分枝角度變小。

3 討論

桃樹型是影響果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)形成、栽培管理措施確定的基礎(chǔ)[13]。高而窄的樹型是適于目前果樹生產(chǎn)提出的“寬行密植”栽培理念的理想樹型，不僅有利于行間作業(yè)，通過逐步實(shí)現(xiàn)機(jī)械化，可以大大降低勞動(dòng)強(qiáng)度和勞動(dòng)力支出，而且改善了果園群體的通風(fēng)透光條件，對減少病蟲發(fā)生、提升果實(shí)品質(zhì)均具有重要意義[22]。前人研究發(fā)現(xiàn)柱型桃枝條接近直立，而普通型桃分枝角度大、鮮有近直立枝，且柱型桃的花梗與枝條夾角也顯著小于普通型桃[21，23]。筆者在本試驗(yàn)中分析了一年生普通型桃大久保和柱型桃灑紅龍柱生長季枝條分枝角度的變化，發(fā)現(xiàn)柱型桃枝條在整個(gè)5 月份變化不大，且顯著低于普通型桃，研究結(jié)果與前人一致。

熱激轉(zhuǎn)錄因子HSFs 在植物的生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用[2]。Wang 等[24]利用水稻幼苗響應(yīng)重力誘導(dǎo)試驗(yàn)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出一個(gè)具有時(shí)空特異性表達(dá)模式的差異表達(dá)基因OsHSFA2D，OsHSFA2D 基因響應(yīng)重力信號(hào)后表達(dá)量升高并激活OsLAZY1 的表達(dá)，進(jìn)而引發(fā)了生長素的不對稱分布導(dǎo)致水稻分蘗角度變小。LAZY1 是目前研究較多的一個(gè)控制植物分枝（蘗）角度的重要基因[24-27]，筆者團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)PpLAZY1 基因的異位表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草分枝角度（葉角）變??；Dardick 等[21]研究發(fā)現(xiàn)與PpLAZY1 同屬于IGT 家族的作用相反的PpTAC1 基因的突變是柱型桃Crimson Rocket 分枝角度小的主要原因?；赑pLAZY1 基因和PpTAC1 基因的表達(dá)模式，筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)11 個(gè)PpHSFAs 基因在普通型桃大久保和柱型桃灑紅龍柱莖尖中呈現(xiàn)3 種表達(dá)模式，即普通型桃中表達(dá)量高于柱型桃、低于柱型桃和在兩種樹型中無差異。其中的PpHSF18 基因在2 種樹型中的表達(dá)模式與PpLAZY1 相同，這與水稻中OsHSFA2D 和OsLAZY1 的表達(dá)模式一致[8]，且PpHSF18 與水稻中的OsHSFA2D 高度同源（50.13%），推測PpHSF18 可能參與調(diào)控桃分枝角度形成。

過表達(dá)PpHSF18 基因的3 個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的分枝角度顯著小于野生型擬南芥。前人研究發(fā)現(xiàn)柱型桃側(cè)枝中和腋芽中生長素的含量明顯高于普通型桃[28]。水稻hsfs2d 突變體植株分蘗角度顯著大于野生型植株，OsHSFA2D和OsLAZY1 過表達(dá)均可恢復(fù)hsfa2d 突變體表型，推測OsHSFA2D 是OsLAZY1上游正調(diào)節(jié)因子，通過激活OsLAZY1 的表達(dá)調(diào)節(jié)生長素的不對稱分布進(jìn)而影響水稻分蘗角度[8]。本試驗(yàn)研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致。探究桃中PpHSF18 轉(zhuǎn)錄因子在2 種樹型桃中的表達(dá)特性及功能，可為HSF家族在桃樹型相關(guān)性狀形成中的作用研究奠定基礎(chǔ)。筆者在本研究中也發(fā)現(xiàn)PpLAZY1基因與PpHSF18 具有相同的表達(dá)趨勢，但二者之間的關(guān)系還需要進(jìn)一步明確，研究與分枝角度形成的關(guān)鍵基因并開發(fā)標(biāo)記基因，為利用分子育種手段進(jìn)行桃樹型遺傳改良提供參考。

4 結(jié)論

筆者在本研究中成功克隆了桃熱激轉(zhuǎn)錄因子PpHSF18 基因，該基因在普通型桃一年生植株莖尖中表達(dá)量明顯低于柱型桃；異源轉(zhuǎn)化擬南芥后導(dǎo)致擬南芥分枝角度明顯變小，其調(diào)控的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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