7 個蘋果KNOX轉錄因子基因克隆、表達和蛋白互作分析

盧苗 李佩 榮鈺瑩 張夢涵 賈鵬 欒好安 齊國輝 張雪梅 董慶龍

摘要：【目的】KNOTTED1 like homeobox（KNOX）蛋白在植物生長發(fā)育等多個生物學過程中發(fā)揮著重要作用。以紫弘富士為材料，分離了多個蘋果（Malus domestica）KONX基因，研究其結構域、進化分析、組織表達、非生物脅迫響應及其與MdOFP相互作用情況?！痉椒ā渴褂肦T-PCR技術克隆獲得7 個MdKNOX基因并進行生物信息學分析。利用Array 技術檢測MdKNOX基因在蘋果不同組織中的表達模式。使用RT-qPCR技術檢測MdKNOX基因在鹽脅迫和滲透脅迫下的表達模式。通過Y2H實驗檢測了MdKNOX蛋白與MdOFP蛋白的互作情況?！窘Y果】測序結果表明，獲得了7 個KNOX 轉錄因子cDNA：MdKNOX1、MdKNOX2、MdKNOX5、MdKNOX10、MdKNOX13、MdKNOX16 和Md-KNOX22（GenBank 登錄號：MG021644～MG021650）。結構域分析表明，獲得的7 個MdKNOX蛋白序列均含有MEINOX、HD和ELK 結構域。進化分析表明，MdKNOX1、MdKNOX2 和MdKNOX5 屬于KNOX Ⅱ亞組；MdKNOX10、MdKNOX13、MdKNOX16 和MdKNOX22 屬于KNOXⅠ亞組。啟動子順式作用元件分析結果表明，7 個MdKNOX基因啟動子上包含多個順式作用元件。Array 分析結果顯示，MdKNOX基因具有不同的組織表達模式。實時熒光定量PCR分析結果表明，鹽脅迫處理下，MdKNOX13 的相對表達水平上調，而MdKNOX1、MdKNOX2 和MdKNOX5 的相對表達水平下調；滲透脅迫處理下，MdKNOX2 的轉錄水平下調。酵母雙雜交結果顯示，MdKNOX1/22 蛋白能與MdOFP6 蛋白相互作用，MdKNOX5 蛋白能與多個MdOFP 蛋白相互作用，且MdKNOX5 蛋白與MdOFP 蛋白相互作用，HD區(qū)域是互作必需的。【結論】這些結果為蘋果KNOX轉錄因子在生長、發(fā)育和逆境下生物學功能的解析、調控網絡的構建提供了強有力的理論基礎和參考。

關鍵詞：蘋果；KNOX轉錄因子；基因克隆；表達分析；蛋白互作

中圖分類號：S661.1 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）05-0841-11

自從在玉米中發(fā)現knotted1（kn1）基因以來，已在多個植物中發(fā)現KNOX（KNOTTED1 like homeobox）基因[1]。KNOX 轉錄因子屬于TALE（threeamino-acid loop extension）基因家族中的亞家族，在植物中包含多個家族成員，其顯著的特征是含有同源異型盒結構域（homeodomain，HD），此外還含有KNOX1、KNOX2 和ELK 結構域[2]。其中HD 結構域參與蛋白互作的形成和與DNA 的結合[3]。KNOX1 和KNOX2 結構域被稱為MEINOX 結構域，對轉基因植株表型的變化起到重要作用[3]。

ELK結構域編碼核定位信號，在與其他蛋白互作和轉錄抑制過程中也起到一定作用[3]。多項研究表明，KNOX 蛋白能與BLH 蛋白相互作用形成不同組合的異質二聚體，某些異質二聚體還可與MADS-box 或者OVATE family proteins（OFP）轉錄因子相互作用形成功能復合體，調控植物的生長和發(fā)育過程[4]?；贙NOX 基因的序列相似性、結構特征、系統(tǒng)進化關系以及表達模式，可將KNOX蛋白分為2 個亞家族：Class Ⅰ（KNOX Ⅰ）和Class Ⅱ（KNOX Ⅱ）[2，5-8]。進一步的研究表明，在蒺藜苜蓿（Medicago truncatula L.）、番茄（Solanum lycopersicumL.）和擬南芥（Arabidopsis thaliana L. Heynh.）中鑒定到一個新的KNOX蛋白亞家族KNOXM，與KNOX Ⅰ和KNOX Ⅱ亞家族不同的是其本身缺少ELK 和HD結構域[9-11]。KNOX Ⅰ能夠進一步分為3 個亞組：STM-like、KNAT2/6- like 和KNAT1/BPlike，而KNOX Ⅱ 分為2 個亞組：KNAT7- like 和KANT3/4/5-like[1]。通過擬南芥突變體研究發(fā)現，KNOX基因不僅調控植物細胞增殖和組織分化，還參與調節(jié)細胞分裂素和赤霉素信號途徑[1，7，12]。擬南芥KNOX Ⅰ亞組包含4 個基因：SHOOTMERISTMELESS（STM）以及KNAT1/2/6。其中，STM 基因在莖頂端分生組織（shoot apical meristem，SAM）早期胚胎發(fā)生期間表達，對SAM 形成的起始起到重要作用[12]。KNAT1 和KNAT6 在SAM 功能的形成和花序發(fā)育過程中扮演著重要角色[13-14]。KNAT2對花模型的調控起到重要作用[15]。相比KNOX Ⅰ的廣泛研究，KNOX Ⅱ已知突變體缺乏表型，研究相對較少，在擬南芥中發(fā)現KNAT7 基因在調控次級細胞壁合成轉錄網絡中起到一定作用[16-17]。最近研究表明，KNAT3/4/5 這3 個基因與KNOX Ⅰ成員起到相反的作用，功能冗余地促進結瘤器官的分化[8]。此外，MtKNAT3/4/5-like 基因參與共生根瘤的發(fā)育，并可調節(jié)豆科植物根瘤細胞分裂素生物合成[18]。在蘋果（Malus domestica Borkh.）中發(fā)現Md-KNOX15 可通過調節(jié)赤霉素水平調控蘋果株高和開花[19]。MdKNOX19 能夠靶向ABI5 調節(jié)ABA 敏感性和種子萌發(fā)[20]。

Jia 等[21]通過對蘋果基因組數據庫序列比對，發(fā)現蘋果基因組中含有22 個MdKNOX基因。去除已克隆的MdKNOX15 和MdKNOX19 基因，筆者獲得了7 個蘋果MdKNOX基因，進一步對它們進行了生物信息學、組織器官表達、鹽和滲透脅迫表達以及蛋白相互作用分析，為蘋果KNOX轉錄因子在生長、發(fā)育和逆境下生物學功能的解析、調控網絡的構建提供了強有力的理論基礎和參考。

1 材料和方法

1.1 植物材料與處理方法

鹽和滲透脅迫表達分析供試材料為嘎拉組培苗。嘎拉組培苗培養(yǎng)條件和處理方法參照李慧峰等[22]的文獻描述進行操作。將嘎拉組培苗放在液氮中速凍以備提取RNA。

1.2 MdKNOX基因克隆

MdKNOX 基因克隆所采用的模板為完全展開的紫弘富士蘋果葉片，采用改良熱硼酸法進行RNA的提取。嘎拉組培苗RNA的提取采用QIAGEN 公司的RNA提取試劑盒RNeasy Plant Mini Kit （貨號：74903）。cDNA 的合成采用TaRaKa 公司的反轉錄試劑盒PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit（貨號：6110A）。依據蘋果MdKNOX核苷酸序列使用Primer 3 在線軟件（https：//primer3.ut.ee/）設計Md-KNOX 基因特異性引物（表1）進行RT-PCR 擴增。PCR 反應條件參照Dong 等[23]文獻描述進行操作。對PCR反應液進行膠回收后，將目的基因克隆片段導入到pMD18-T 克隆載體上轉化Escherichia coli DH5α 感受態(tài)細胞，涂板后篩選陽性克隆，把搖菌送到公司進行測序。

1.3 蘋果KNOX轉錄因子蛋白序列、進化關系和順式作用元件分析

使用蘋果、擬南芥和水稻全長KNOX氨基酸序列，采用MEGA 6 軟件（http：//www.megasoftware.net）進行進化樹分析。軟件具體參數：NJ方法、pairwisedeletion、Poission correction 和bootstrap（1000repeat）[24]。利用序列分析軟件DNAMAN 6.0.3.99 分析蘋果KNOX全長蛋白序列。MdKNOX基因啟動子上含有的順式作用元件利用PlantCARE 網站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進行分析。

1.4 MdKNOX的表達分析

根據NCBI 網站中GEO數據庫GSE42873 生成蘋果MdKNOX 組織器官表達數據。該轉錄譜（Array）包含10 個不同蘋果基因型的16 個器官組織數據。通過TIGR MeV v4.8.1 軟件進行表達熱圖的繪制。MdKNOX 基因在鹽和滲透脅迫下的表達分析采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）進行檢測，使用MdMDH基因作為蘋果內參基因，相對表達水平結果采用2–ΔΔCT法進行計算[25]。RT-qPCR 反應體系和程序參照李慧峰等[22]的文獻描述進行操作。Md-KNOX基因的熒光定量引物見表1。

1.5 酵母雙雜交（Y2H）實驗

Y2H方法參照Clontech 公司公布的方法進行操作。將MdKNOX1、MdKNOX5 和MdKNOX22全長編碼框、MdKNOX5 刪除MEINOX 結構域片段和Md-KNOX5 刪除HD 結構域片段插入到pGAD424（GAL4 activation domain，AD）捕獲載體中；將MdOFP1/4/5/6/11/13/14/16/19/20 全長編碼框克隆到pGBT9（GAL4 DNA-binding domain，BD）誘餌載體中[26]。將不同融合載體以AD和BT配對形式分別轉化酵母菌株Y2HGold，然后涂布在二缺培養(yǎng)基SD/-Trp/-Leu和四缺培養(yǎng)基SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade+X-α-Gal 中進行培養(yǎng)，通過觀察菌體是否變藍判斷蛋白是否存在相互作用。采用pGBT9-MdOFP 和pGBT9-MdWKRY52 融合載體與pGAD424 空載體質粒共轉化的酵母菌作為陰性對照；采用pGBT9-Md-WRKY52 和pGAD424-MdVQ10 融合載體共轉化的酵母菌作為陽性對照[23]。

1.6 數據分析

MdKNOX 基因在鹽和滲透脅迫處理下的表達水平采用IBM SPSS Statistics v.20 軟件中One-wayANOVA 方法及Duncan 檢驗（p＜0.05）進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 蘋果MdKNOX基因的克隆

使用紫弘富士葉片的cDNA 作為PCR 反應模板，進行RT-PCR擴增。測序結果顯示，7 個蘋果Md-KNOX基因克隆成功。根據前人對MdKNOX基因家族鑒定的研究結果，對7 個蘋果MdKNOX基因進行命名，各個基因的GenBank 登錄號、基因組ID 號、染色體定位、開放閱讀框、分子質量以及等電點信息詳見表2。DNAMAN 軟件分析結果顯示，7 個Md-KNOX轉錄因子含有典型的KNOX1、KNOX2、ELK和HD結構域（圖1）。

2.2 蘋果KNOX轉錄因子的進化分析

利用進化樹分析軟件MEGA6 對9 個蘋果Md-KNOX（7 個本文克隆的MdKNOX、MdKNOX15 和MdKNOX19）、9 個擬南芥KNOX和11 個水稻（Oryzasativa L.）KNOX 全長蛋白序列進行進化分析。圖2 結果顯示，KNOX成員被清楚地分為3 個亞家族（KNOX Ⅰ、KNOX Ⅱ和KNOX M），其中KNOX Ⅰ中可進一步分為3 個亞組（STM-like、KNAT2/6-like和KNAT1/BP- like），KNOX Ⅱ 分為2 個亞組（KNAT7-like 和KANT3/4/5-like）。STM-like 亞組中包含MdKNOX10 和MdKNOX22；KNAT2/6- like 亞組中包含MdKNOX13、MdKNOX15 和Md-KNOX16；KNAT7- like 亞組中包含MdKNOX2 和MdKNOX5；KNAT3/4/5-like 亞組中包含MdKNOX1和MdKNOX19。

2.3 蘋果MdKNOX啟動子序列分析

下載已克隆MdKNOX 基因翻譯起始位點上游1500 bp 序列，獲得了7 個MdKNOX基因的啟動子序列。通過PlantCARE數據庫分析啟動子序列上的順式作用元件，除了光響應元件，還有多個逆境和激素響應元件（圖3）。在7 個MdKNOX基因的啟動子上總共存在13 種不同類型的順式作用元件，分別是對響應逆境的低氧、低溫、熱、干旱、機械創(chuàng)傷、病原菌和激素響應的茉莉酸甲酯、水楊酸、生長素、赤霉素、乙烯和ABA 等順式作用元件（圖3）。這些結果表明，MdKNOX啟動子上的順式作用元件可能在蘋果生長和發(fā)育以及逆境脅迫響應中起到重要的作用。

2.4 蘋果MdKNOX基因的表達分析

利用NCBI 網站的GEO 數據庫下載蘋果16 個不同組織的轉錄譜（GSE42873），檢測MdKNOX 在不同組織中的表達情況（圖4）。結果顯示，Md-KNOX基因在被檢測的組織中均有表達。其中，Md-KNOX1、MdKNOX2 和MdKNOX5 在被檢測的組織中有相對較高的表達水平；在葉_M49（Leaf M49）、花_M74（Flower M74）、果實_M20 花后100 d [FruitM20（100DAM）] 和果實_M20 收獲期[Fruit M20（harvest）] 組織中，MdKNOX10 、MdKNOX13、Md-KNOX16 和MdKNOX22 基因有相對較高的表達水平（圖4）。

進一步利用熒光實時定量PCR分析鹽和甘露醇處理下嘎拉組培苗中MdKNOX基因的表達情況，結果顯示，在正常條件下，MdKNOX的相對表達水平無明顯變化（圖5-A）；在NaCl處理條件下，MdKNOX13與對照相比，相對表達水平升高，在處理48 h后相對表達水平達到對照的1.96 倍，MdKNOX1、MdKNOX2和MdKNOX5 的相對表達量與對照相比下降，Md-KNOX1 在處理24 h 后相對表達水平為對照的0.28倍；MdKNOX2 和MdKNOX5 在處理48 h 后，相對表達水平分別是對照的0.32和0.29倍（圖5-B）；在甘露醇處理條件下，MdKNOX2 與對照相比，表達水平降低，在48 h時為對照的0.47倍（圖5-C）。

2.5 MdKNOX蛋白與MdOFP蛋白相互作用

筆者前期研究發(fā)現蘋果基因組中存在26 個MdOFP 基因家族成員，并且成功克隆了10 個MdOFP 基因（MdOFP1/4/5/6/11/13/14/16/19/20）[26]。本研究利用酵母雙雜交試驗，檢測了MdKNOX 蛋白與這10 個MdOFP 蛋白的相互作用情況。3 個MdKNOX 全長cDNA 序列也融合到AD 捕獲載體上，同時10 個MdOFP全長cDNA序列融合到BD誘餌載體中[26]。將AD-MdKNOX 和BD-MdOFP 融合載體共轉化到酵母細胞，通過觀察β-galactosidase 活性來測試LacZ 報告基因的表達。如圖6-A所示，作為陰性對照，10 個BD-MdOFP 融合誘餌載體與空AD捕獲載體在四缺培養(yǎng)基上不變藍，說明這10 個MdOFP 蛋白沒有轉錄自激活活性。MdKNOX1 和MdKNOX22 蛋白能與MdOFP6 蛋白相互作用，MdKNOX5 蛋白能與MdOFP1、MdOFP4、MdOFP14和MdOFP16 蛋白相互作用（圖6-A）。為了檢測MdKNOX 蛋白哪一段區(qū)域對于MdOFP 蛋白相互作用是必需的，構建了MdKNOX10 刪除MEINOX結構域捕獲載體（AD-MdKNOX10△MEINOX）和MdKNOX10 刪除HD 結構域捕獲載體（AD-Md-KNOX10△HD）（圖6-B）。如圖6-C 所示，作為陽性對照，MdVQ10 蛋白和MdWRKY52 蛋白相互作用變藍[23]。MdKNOX5 △ MEINOX 與MdOFP1、MdOFP4、MdOFP14 和MdOFP16 蛋白相互作用，而MdKNOX5△HD與這些蛋白失去相互作用能力，說明MdKNOX5 與MdOFP1、MdOFP4、MdOFP14 和MdOFP16 相互作用，HD區(qū)域是互作必需的。

3 討論

根據植物KNOX 蛋白的高度保守結構域和蘋果基因組數據庫公布的數據，Jia 等[22]對蘋果KNOX基因進行了基因組范圍內的家族鑒定，篩選出了22個MdKNOX 基因，隨后對MdKNOX15 和Md-KNOX19轉錄因子進行了功能鑒定[19-20]。本研究根據前人研究結果，克隆了7個MdKNOX基因，對結構域、進化分類和啟動子順式作用元件進行了分析，檢測了組織器官表達、非生物脅迫應答以及與MdOFP蛋白互作模式，表明這些MdKNOX基因在蘋果調控生長、發(fā)育以及應對非生物脅迫過程中起到不同的作用。

研究表明，KNOX蛋白能夠與BLH形成異質二聚體或者與OFP轉錄因子相互作用或者它們3 者形成功能復合體參與調控植物生長和發(fā)育[12，16，27]。例如，KANT3 與BLH1 形成異質二聚體，AtOFP5 介導它們活性的抑制參與到胚囊的正常發(fā)育以及細胞命運的決定[28]；KNAT7 與OFP4 相互作用，增強KNAT7的轉錄抑制活性調控次生細胞壁的形成[29]。此外，KNAT7 蛋白還可與BLH6 蛋白相互作用，通過抑制homeodomain-leucine zipper transcription factor REVOLUTA/INTERFASCICULAR FIBERLESS1 （REV/IFL1）的表達，進而調控次生細胞壁的形成[16]。進一步研究表明，KNAT7-BLH6 異質二聚體還可與AtOFP1 和AtOFP4 相互作用形成功能復合體，參與到次生細胞壁的形成[30]；水稻OsKNAT7 可與Os-OFP2、BLH6-like 和BLH-like2 相互作用調控維管發(fā)育[31]。水稻KNOX 蛋白OSH15 與BEL-like home-odomain 蛋白SH5 相互作用形成二聚體，通過抑制木質素生物合成基因改善落粒性[32]；玉米（Zea maysL.）KNOTTED1 與BLH12 和BLH14 相互作用，在莖中的脈管和節(jié)間結構中起到重要作用[27]。此外，KNAT7 可與MYB75 相互作用在莖和種皮中對細胞壁的形成起到重要的調控作用[33-34]。在本文中，通過酵母雙雜交實驗，發(fā)現MdKNOX1 和MdKNOX22蛋白能與MdOFP6 蛋白相互作用，MdKNOX5 蛋白能與多個MdOFP蛋白相互作用。MdKNOX蛋白與MdOFP 之間的這種不同的相互作用可能影響到蘋果可能的BLH-KNOX異質二聚體的活性，從而改變它們所調控靶基因的表達水平，進而調控蘋果的生長和發(fā)育，但還需進一步的試驗來分析這種潛在的相關分子機制。

盡管KNOX蛋白能夠調控植物生長和發(fā)育等多個方面，但其對非生物和生物脅迫的響應機制還研究甚少。最近研究表明，在干旱、鹽和冷處理條件下，鷹嘴豆（Cicer arietinum Linn.）根和莖中部分KNOX 基因響應脅迫處理應答[35]。在干旱處理下，大豆少數KNOX基因受脅迫響應；在病原菌侵染下，大豆KNOX 基因Glyma17g14180、Glyma04g06810、Glyma09g01000 和Glyma14gg37550 受到不同的響應[35]。在本文中，MdKNOX13 受鹽脅迫誘導；Md-KNOX1、MdKNOX2 和MdKNOX5 受鹽脅迫下調；MdKNOX2 受甘露醇脅迫下調，并且這些MdKNOX基因啟動子上含有多個逆境脅迫順式作用元件，表明MdKNOX蛋白可能在應對蘋果非生物脅迫中起到一定的作用。相信隨著關于KNOX基因研究的深入，其在非生物脅迫中作用和機制也會日益清晰。

4 結論

本研究克隆獲得了蘋果中7 個MdKNOX基因，發(fā)現均含有保守的KNOX1、KNOX2、ELK和HD結構域。通過進化分析表明7 個MdKNOX轉錄因子分別屬于KNOX Ⅰ亞組和KNOX Ⅱ亞組。Array 結果發(fā)現，MdKNOX基因在16 個組織中均有不同的表達水平。RT-qPCR 結果表明，MdKNOX13 的相對表達水平受到鹽脅迫誘導，而MdKNOX1、MdKNOX2和MdKNOX5 的相對表達水平下調；MdKNOX2 的轉錄水平在滲透脅迫處理下下調表達。酵母雙雜交分析表明，MdKNOX蛋白能夠與多個MdOFP 蛋白相互作用，且HD區(qū)域是互作必需的。這些結果為蘋果KNOX轉錄因子在生長、發(fā)育和逆境下生物學功能的解析、調控網絡的構建提供了強有力的理論基礎和參考。

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