氧化應激在放射性肺纖維化中的作用及中藥防治研究進展

李展鴻 徐?？?陳 威 辛佳蕓 王金鑫 田賽賽 祖先鵬 王淑美

1.廣東藥科大學藥學院，廣東廣州 510640；2.海軍軍醫(yī)大學藥學院，上海 200433；3.山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東濟南 250355

放療是臨床治療腫瘤的主要手段之一，但在有效抑制腫瘤細胞生長的同時，卻伴隨著一系列副作用。胸部腫瘤患者需經歷多次放療，當其接受的電離輻射超過引發(fā)特定生物效應閾值劑量時，正常肺組織會產生放射性損傷，引發(fā)肺泡上皮細胞的異常修復，導致肺泡逐漸被結締組織替代，最終演變?yōu)榉派湫苑卫w維化（radiation-induced lung fibrosis，RILF），使患者呼吸衰竭而死亡[1]。氧化應激是RILF 的一個重要發(fā)病因素，本文對氧化應激在RILF 中的作用及研究進展進行綜述，并討論中藥通過抗氧化途徑治療RILF 的潛力，為治療RILF 的藥物開發(fā)提供新思路。

1 RILF 的發(fā)病機制

RILF 的發(fā)病機制復雜，至今仍無明確定論。目前主流的病因假說有“靶細胞學說”[2]和“細胞因子學說”[3]。靶細胞學說認為，電離輻射通過損傷肺泡上皮細胞、肺血管內皮細胞、肺泡巨噬細胞等靶細胞，激活靶細胞的損傷修復機制，引發(fā)肺上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）導致RILF。細胞因子學說與靶細胞學說互為補充，認為細胞因子介導靶細胞間的相互作用，包括參與局部損傷與炎癥反應的腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）和促進組織修復及器官纖維化的轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）等。因此，RILF 是多種細胞和細胞因子共同參與的級聯反應過程。電離輻射可誘導活性氧（reactive oxygen species，ROS）產生，進而損傷DNA，使肺泡上皮細胞和肺血管內皮細胞死亡及脫落，淋巴細胞、中性粒細胞等炎癥細胞被聚集到損傷區(qū)域，分泌IL-1β、TNF-α 等炎癥因子，引發(fā)持續(xù)的炎癥反應。其中，由巨噬細胞分泌的TGF-β1 介導受損的肺泡Ⅱ型上皮細胞發(fā)生EMT 轉化為肌成纖維細胞，使正常肺組織被結締組織替代。肌成纖維細胞合成大量的細胞外基質（extracellular matrix，ECM），如膠原纖維等，造成ECM 沉積，最終形成肺纖維化。

2 氧化應激在RILF 中的作用

ROS 涵蓋由氧化還原及所有次級反應產生的初始產物，包超氧陰離子、過氧化氫、羥基自由基和一氧化氮等。低濃度的ROS 參與細胞信號傳導和免疫應答反應，而高濃度的ROS 則導致蛋白質、脂質和DNA損傷。ROS 濃度和細胞抗氧化能力之間的不平衡導致氧化還原信號中斷或分子損傷被稱為氧化應激[4]。輻射會誘導機體氧化還原系統(tǒng)失衡，使靶細胞線粒體活性增加和抗氧化酶活性降低，產生高濃度ROS，導致DNA 損傷、細胞凋亡等，加快肺纖維化的進程。已有多項研究發(fā)現肺纖維化患者氧化應激增加的證據，Daniil 等[5]發(fā)現，肺纖維化患者血漿中過氧化氫的濃度顯著升高，且過氧化氫的濃度與呼吸困難的嚴重程度呈正相關，與肺活量和一氧化碳擴散能力呈負相關。谷胱甘肽作為人體重要的還原劑，參與體內多種氧化還原反應，肺纖維化患者血液中谷胱甘肽濃度比健康人群低50%[6]。羰基蛋白是蛋白質氧化的產物，肺纖維化患者支氣管肺泡灌洗液中羰基蛋白濃度是健康者的2.4 倍，且羰基蛋白濃度與嗜酸性粒細胞、中性粒細胞的數量及TNF-α、IL-1β 的含量呈正相關[7]。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是人體抗氧化酶的重要組成成員，研究發(fā)現肺組織纖維化區(qū)域的SOD 含量明顯低于非纖維化區(qū)域[8]。這些證據表明氧化應激與RILF 關系密切，是RILF 發(fā)病過程的重要環(huán)節(jié)。

2.1 RILF 中ROS 的上調

ROS 在細胞增殖、分化和凋亡過程中發(fā)揮重要作用。電離輻射一方面與肺組織中的水分子作用產生大量ROS，另一方面可誘導線粒體內源性ROS 產生，進一步加重輻射導致的氧化應激。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，Nox）是內源性ROS 的主要來源，具有Nox1、2、4 等亞型。通過Nox1 特異性抑制劑抑制內皮細胞的纖維化可有效減輕RILF[9]。肺泡巨噬細胞是RILF 肺組織中的主要炎癥細胞，產生高濃度的ROS 會誘導肌成纖維細胞活化，促進ECM 沉積，在這一過程中Nox2 和Nox4 的上調可能與輻射誘導的旁觀者效應和非靶向效應有關，導致鄰近的未受輻射細胞或遠處器官產生ROS[10]。綜上，電離輻射可通過多種方式誘導ROS 生成，觸發(fā)肺組織氧化應激效應，使炎癥反應加重且持續(xù)，促進RILF 的發(fā)展。

2.2 ROS 促進RILF 發(fā)展

2.2.1 ROS 與DNA 損傷 電離輻射可通過產生ROS 間接損傷DNA，使單鏈或雙鏈斷裂、堿基氧化等。轉錄因子p53 通過調控多種抗氧化酶的轉錄，維持氧化還原系統(tǒng)平衡。當DNA 被ROS 嚴重氧化損傷且無法修復時，p53 被激活并調控Bcl 蛋白家族觸發(fā)細胞凋亡[11]。研究表明，DNA 氧化損傷標志物8-羥基-2’-脫氧鳥苷在輻射小鼠中的含量顯著增加，揭示由輻射產生的ROS 可造成DNA 氧化損傷，促進RILF 的發(fā)展[12]。新型藥物PM014 可降低輻射小鼠ROS 和8-羥基-2’-脫氧鳥苷含量，減輕DNA 的損傷程度，改善RILF[13]。

2.2.2 ROS 與TGF-β TGF-β 是公認的最關鍵的促纖維化細胞因子[14]，其可通過激活成纖維細胞增殖分化，刺激肺泡上皮和內皮細胞凋亡，誘導EMT 過程，刺激肌成纖維細胞合成ECM 及抑制ECM 降解等多種途徑促進RILF。ROS 可直接氧化潛伏相關肽，或激活基質金屬蛋白酶酶解潛伏相關肽，釋放出活性TGF-β1。TGF-β1 可激活線粒體或氧化酶誘導內源性ROS 的產生，觸發(fā)氧化應激效應，形成惡性循環(huán)。通過沉默Nox4 的表達可抑制ROS 的產生并阻斷TGF-β1激活肌成纖維細胞，表明TGF-β1 依賴ROS 激活成纖維細胞增殖分化介導纖維化[15]。此外，ROS 還參與TGF-β1 上調ECM 相關基因的表達及抑制ECM 的降解過程。TGF-β1 增加細胞過氧化氫的產生并誘導膠原纖維合成，使用氧化氫酶降低過氧化氫含量后，膠原纖維合成被抑制[16]。TGF-β1 通過激活組織金屬蛋白酶抑制劑和纖溶酶原激活物抑制劑-1，抑制基質金屬蛋白酶和纖溶酶原激活劑，阻礙ECM 降解[17]。GSH抑制JNK 和p38 信號通路阻斷TGF-β 激活纖溶酶原激活物抑制劑-1，恢復組織型纖溶酶原激活劑活性和膠原蛋白降解能力，減少纖維化[18]，表明抗氧化劑可有效抑制TGF-β 介導的EMT、ECM 沉積。

2.2.3 ROS 與炎癥 免疫系統(tǒng)調節(jié)失衡是RILF 發(fā)生的主要原因之一，當肺泡上皮或內皮細胞被輻射損傷及脫落時，單核細胞、中性粒細胞等炎癥細胞被招募并聚集在肺組織損傷部位，參與傷口愈合和組織再生的修復程序。該程序中巨噬細胞扮演著重要角色，主要分為促炎的M1 型巨噬細胞和促纖維化的M2 型巨噬細胞，而ROS 是M1/M2 型巨噬細胞的重要調節(jié)因子。M1 型巨噬細胞被γ 干擾素激活，釋放TNF-α、IL-1β等炎癥因子介導炎癥反應，同時激活一氧化氮合酶和Nox2 產生高濃度的ROS，促進病原體和凋亡細胞的吞噬[19]。M2 型巨噬細胞由TGF-β1、IL-10 等激活[20]，分泌TGF-β1 和血小板衍生生長因子等促纖維化因子，激活成纖維細胞合成膠原蛋白，促進組織金屬蛋白酶抑制物的合成抑制ECM 降解。人為敲除內質網應激特異性的C/EBP 同源蛋白可抑制STAT6/PPAR-γ通路減弱M2 型巨噬細胞的極化，改善肺纖維化[21]。由此可見，氧化應激與炎癥的作用是相互的，氧化應激導致細胞和組織損傷，觸發(fā)炎癥反應產生ROS，體內氧化與抗氧化平衡遭到破壞，過量的ROS 不及時清除可能導致組織病變。

2.2.4 ROS 與自噬 適度的自噬有利于應對各種疾病和應激反應，是細胞的一種自我保護機制。自噬與氧化應激在肺纖維化中的相互作用是復雜的。過量ROS激活PDGFR/PI3K/Akt 通路，抑制線粒體自噬并促進肌成纖維細胞分化，導致ECM 沉積[22]。p62 作為調控自噬的重要細胞因子，可激活核因子E2 相關因子2 與抗氧化反應元件結合，促進多種抗氧化酶的表達，提高細胞抗氧化能力改善氧化應激帶來的有害影響[23]。

3 中藥治療RILF

中醫(yī)認為，放射線屬外來“熱毒”，為陽邪，易耗氣血津液，基于RILF 的病機辨證分析將其歸屬于“咳嗽”“喘證”“肺萎”等范疇，主要采用益氣養(yǎng)陰、清熱解毒、活血化瘀等方法治療。輻射誘導的氧化應激是RILF 發(fā)病的重要原因，能夠增強細胞抗氧化能力，消除過量ROS，維持體內氧化還原平衡，提高機體自身防御能力可能是防治RILF 的有效策略，這與中醫(yī)倡導“激活機體生機活力，陰陽調和”理念不謀而合。中藥及其有效成分具有多靶點、副作用小等優(yōu)點，顯示出抗氧化、抗感染、抗纖維化等多種藥理活性，有望從中尋找治療RILF 的潛在藥物。

3.1 單味中藥活性成分

白藜蘆醇可通過清除自由基減弱氧化應激效應，改善Th1/Th2 失衡，并抑制TGF-β1/Smad3 通路逆轉EMT 過程減輕RILF[24]。黃芪多糖可降低輻射小鼠的TGF-β1 含量，上調SOD 水平提高抗氧化能力，減少肺泡中炎癥細胞浸潤[25]。黃芪甲苷通過激活核轉錄因子紅系2 相關因子2 促進多種抗氧化酶的表達，有效清除輻射產生的自由基，降低TGF-β1 和TNF-α 含量，從而抑制肺組織炎癥和纖維化[26]。黃芩苷通過抑制TGF-β1 和ERK/GSK3β 通路，阻斷輻射誘導Ⅱ型肺泡上皮細胞發(fā)生EMT 緩解RILF[27]。雷公藤甲素通過下調肺泡巨噬細胞中Nox2 和Nox4 的表達，降低ROS 含量，抑制肌成纖維細胞的激活與膠原蛋白的合成減輕RILF[10]。漢防己甲素能抑制膠原蛋白水解酶的活性，減少膠原蛋白的合成，并具備清除過量氧自由基，調節(jié)氧化還原平衡的能力，顯示出緩解RILF 的潛力[28]。丹參酮ⅡA 在多種器官中均顯示出良好的抗纖維化活性，可抑制TGF-β1/Smad 通路阻礙肺組織發(fā)生EMT，顯著改善RILF[29]。氧化苦參堿作為放療輔助藥物，可通過抑制TGF-β/Smad 及β-catentin 通路，改善放射性肺損傷模型小鼠的肺纖維化病變[30]。

3.2 中藥方劑

養(yǎng)陰清肺活血方（黃芪、麥冬、丹參等）通過抑制Notch1/Jagged1 通路和調節(jié)外周血Th17/Treg 的失衡，減少炎癥因子分泌和炎癥細胞浸潤，減少肺組織中的膠原纖維沉積，改善RILF[31-32]。痰熱清注射液（金銀花、黃芩、連翹等）抑制TGF-β、IL-6、血管緊張素轉換酶的分泌減輕放射性患者肺部炎癥，顯著降低肺纖維化的發(fā)病率，表明痰熱清注射液對RILF 具有一定的防治作用[33]。復方苦參注射液（苦參、白土苓等）具有抑制腫瘤細胞擴散、止痛、抗感染和升高白細胞等作用，通過抑制TGF-β1/Smad3 和Wnt/β-catenin 通路，有效阻止EMT 的發(fā)生，減輕肺間質病變，對肺組織起到一定的保護作用[34]，預防RILF 的發(fā)生。

4 小結與展望

RILF 是胸部腫瘤放療的常見并發(fā)癥，目前缺少切實有效的治療藥物，其發(fā)病機制復雜，涉及多種靶細胞與細胞因子，包括肺泡上皮/內皮細胞損傷及凋亡、炎癥細胞浸潤及炎癥反應持續(xù)、肌成纖維細胞的活化增殖、ECM 的沉積及其降解抑制等。電離輻射引發(fā)的氧化應激效應貫穿RILF 的整個發(fā)展過程，氧化應激產物ROS 可使DNA 堿基氧化，損傷肺上皮細胞，觸發(fā)細胞的修復程序，造成反復且持續(xù)的炎癥應答，破壞機體氧化與抗氧化平衡，影響細胞自噬，誘導EMT 和ECM 沉積等病理生理過程，促進RILF 的發(fā)生發(fā)展。以調節(jié)機體氧化與抗氧化能力穩(wěn)態(tài)為著手點切入，抑制炎癥、EMT 等病理過程，成為治療RILF 的一種新策略。中醫(yī)認為輻射損耗氣血津液導致機體陰陽失調，對RILF 的防治策略多以益氣養(yǎng)陰、活血化瘀為主。目前中藥及其有效成分主要從清除自由基維持氧化還原平衡以緩解輻射導致的氧化損傷、抑制炎癥因子的釋放維持免疫平衡、減少膠原纖維生成等途徑發(fā)揮治療作用，有效干預RILF 的發(fā)生發(fā)展過程，對防治RILF 具有重要的研究價值和廣闊的應用前景。隨著對RILF 發(fā)病機制的深入研究，中醫(yī)藥對RILF 的作用機制與治療靶點還需要進一步闡明，可聯合系統(tǒng)生物學、網絡藥理學及生物信息學等現代化技術深入探索，研發(fā)出國際認可、療效確切的抗RILF 藥物，使更多胸部腫瘤患者受益。