核桃粕納豆發(fā)酵工藝優(yōu)化及其品質(zhì)分析

孫 娜，朱秀娟，何九軍，謝曉娟，何紅蕾

（1.隴南師范高等?？茖W校 農(nóng)林技術(shù)學院，甘肅 隴南 742500；2.隴南特色農(nóng)業(yè)生物資源研究開發(fā)中心，甘肅 隴南 742500）

納豆（Natto）起源于中國古代，具有黏性，氣味較臭，味道微甜，富含納豆激酶、維生素、異黃酮和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等活性物質(zhì)，是一種具有良好營養(yǎng)保健功能的優(yōu)質(zhì)食品資源[1-2]。納豆激酶（Nattokinase，NK）是一種安全溶栓的天然物質(zhì)，具有抑制血小板凝固的作用，其半衰期長、特異性強、副作用小、可直接口服，在預(yù)防和治療心腦血管栓塞癥等方面起到積極作用[3-4]。我國現(xiàn)有心血管疾病患病人數(shù)約為3.3億人，其中血栓是引起心血管疾病人群死亡和致殘的首要原因[5-6]，因此開發(fā)以納豆激酶為核心的保健食品，擴大其臨床和商業(yè)的應(yīng)用是符合《國民營養(yǎng)計劃（2017—2030）》，為改善我國居民營養(yǎng)狀況、提高人群整體健康水平提供重要政策支撐和保障[7]。

低溫核桃粕是核桃油冷榨生產(chǎn)工藝過程中產(chǎn)生的一種副產(chǎn)物[8-9]，具有核桃清香味，是一種良好的植物蛋白資源，蛋白質(zhì)含量高達30%～40%，還富含礦物質(zhì)、膳食纖維及多酚等營養(yǎng)物質(zhì)[10]，可以為發(fā)酵菌株提供充足的氮源和碳源，因此在食品固態(tài)發(fā)酵研究中應(yīng)用廣泛。王宸軒等[11]以核桃粕為原料，研究了核桃粕固態(tài)發(fā)酵醬油的最佳工藝；高瑞雄等[12]以冷榨核桃粕為原料，研究了固態(tài)發(fā)酵制備納豆激酶的最佳工藝。但目前關(guān)于低溫核桃粕納豆發(fā)酵研究還鮮有報道。

本研究以核桃粕與黃豆為原料，采用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）發(fā)酵制備核桃粕納豆，采用單因素及響應(yīng)面試驗對固態(tài)發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，不僅有利于傳統(tǒng)納豆的風味改良和質(zhì)量提升，而且為核桃粕和黃豆深加工提供了新方向，對核桃粕和黃豆資源開發(fā)和利用十分有意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫核桃粕：甘肅隴小南電子商務(wù)有限公司；黃豆：市售；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）：隴南師專農(nóng)林技術(shù)學院實驗室；尿激酶（10 000 U/mg）、凝血酶（2 000 U/mg）、纖維蛋白原（牛血）等試劑：黑龍江迪龍制藥有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975C型氣質(zhì)聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）：美國安捷倫科技有限公司；UV2600紫外可見分光光度計：島津國際貿(mào)易（上海）有限公司；LS-35L立式壓力蒸汽滅菌機：山東創(chuàng)美機械科技有限公司；DH3600電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 核桃粕納豆加工工藝流程及操作要點

操作要點：選取粒徑約6 mm左右的小粒黃豆和完整低溫核桃餅粕，剔除有破損、霉變和蟲蛀的不完整豆粒和核桃粕，用流水沖洗附著在豆皮上和核桃粕上的雜質(zhì)，分別按質(zhì)量比1∶3加水浸泡過夜，瀝干水分。為了使核桃粕發(fā)酵充分，片狀或塊狀核桃粕還需粉碎，過100目篩。將上述處理過的黃豆和核桃粕，分別放入發(fā)酵瓶中，于121 ℃蒸煮30 min。將枯草芽孢桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，放置于37 ℃、170 r/min搖床培養(yǎng)24 h，即得發(fā)酵菌液。按照一定比例將蒸煮好的核桃粕均勻平鋪于培養(yǎng)皿底部，上面以黃豆覆蓋，冷卻至40 ℃左右，接入發(fā)酵菌液，晃動培養(yǎng)皿使黃豆和核桃粕均勻的裹上菌液。放入培養(yǎng)箱發(fā)酵24 h，取出置于冰箱后熟18 h，即得成品核桃粕納豆。

1.3.2 核桃粕納豆發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗設(shè)計

通過單因素試驗設(shè)計，以綜合評價分為考察指標，分別考察核桃粕添加量（16%、18%、20%、22%、24%）、枯草芽孢桿菌接種量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、發(fā)酵溫度（31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃、43 ℃）、發(fā)酵時間（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h）和后熟時間（12 h、16 h、20 h、24 h、28 h）對核桃粕納豆品質(zhì)的影響。

1.3.3 核桃粕納豆發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計法，以核桃粕添加量（A）、接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）和發(fā)酵時間（D）為4個考察因素，以綜合評價分（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計4因素3水平響應(yīng)面試驗，優(yōu)化核桃粕納豆發(fā)酵工藝。響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。

表1 核桃粕納豆發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation process optimization of walnut meal natto

1.3.4 測定方法

感官評價：由10名感官培訓人員組成評價小組，對核桃粕納豆從拉絲、氣味、色澤和口感四個方面進行感官評價，并取其平均值。核桃粕納豆感官評價標準見表2（滿分100分）。

綜合評價：參照付文靜[13]的綜合評價法，感官評分和納豆激酶酶活兩指標各占50%權(quán)重。其計算公式如下：

感官指標分析：參照SB/T 10528—2009《納豆》[14]和T/CNLIC 0036—2021《納豆》[15]對核桃粕納豆進行感官分析。

核桃粕納豆水分、蛋白質(zhì)、氨基酸態(tài)氮和納豆激酶活力的測定：參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》[16]、GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì)的測定》[17]、GB 5009.235—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸態(tài)氮的測定》[18]及分光光度法[13]。

揮發(fā)性物質(zhì)測定：

樣品預(yù)處理：稱取均勻研碎的核桃粕納豆樣品3.00 g于15 mL頂空瓶中，加入1 g NaCl和6 mL超純水，插入已老化的固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）纖維頭，在溫度50 ℃，轉(zhuǎn)速500 r/min的條件下預(yù)熱樣品15 min，將萃取頭插入進樣口于250 ℃解吸3 min。

GC條件：載氣為氦氣（He），流速1.0 mL/min，不分流進樣；氣化室溫度250 ℃；傳輸線溫度280 ℃；升溫程序：初始溫度40 ℃，恒溫2 min，以5 ℃/min的升溫速率升高到150 ℃，再以10 ℃/min的速度升至260 ℃，保持5 min[19-20]。

定性定量方法：對檢測出的成分采用美國國家標準技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）11數(shù)據(jù)庫自動檢索化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，參考標準光譜圖進行定性分析；采用面積歸一化法定量。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft office Excel 2016軟件和Design Expert 10軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理，每組試驗平行測定3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃粕納豆發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗結(jié)果

2.1.1 核桃粕添加量對納豆品質(zhì)的影響

由圖1可知，隨低溫核桃粕添加量的增加，核桃粕納豆綜合評價分呈先升高后降低的趨勢。當核桃粕添加量為20%時，綜合評價達到最大值，為81.3分。這可能是因為隨著核桃粕添加量的不斷增加，核桃粕特有的清香味，在一定程度上提升了納豆的感官品質(zhì)；但當核桃粕添加量過高時，因其顆粒度較小，會附著在黃豆表面，減少枯草芽孢桿菌與黃豆的直接接觸，導致納豆激酶活力降低。因此，選擇最佳核桃粕添加量為20%。

圖1 核桃粕添加量對核桃粕納豆品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of walnut meal addition on the quality of walnut meal natto

2.1.2 枯草芽孢桿菌接種量對納豆品質(zhì)的影響

由圖2可知，隨枯草芽孢桿菌接種量的增加，核桃粕納豆綜合評價分呈先升高后緩慢降低的趨勢。當接種量＜1%時，核桃粕納豆表面附著的白膜少、拉絲短，納豆激酶酶活低，這可能是因為接種量不足導致底物發(fā)酵不徹底造成的；當接種量為1%時，納豆表面附著的白膜增多、拉絲變長，納豆激酶酶活也顯著增高，綜合評價達到最大值，為80.3分；當接種量＞1%時，隨著接種量的增加，納豆表面附著的白膜不再增多，拉絲不再變長，且納豆表面失水出現(xiàn)褶皺現(xiàn)象，導致納豆感官品質(zhì)下降，這可能是因為接種量越高，枯草芽孢桿菌繁殖越快，底物消耗力度大，發(fā)酵時間就會縮短，枯草芽孢桿菌生長到一定階段，菌體原生質(zhì)失水形成橢圓形倒柱狀的內(nèi)生孢子，出現(xiàn)褶皺現(xiàn)象。因此，選擇最佳枯草芽孢桿菌接種量為1%。

紅軍在雪山草地籌糧過程中，先后采取了一系列的措施。一、號召節(jié)約糧食，嚴格擬定糧食分配計劃；加緊糧食宣傳工作，動員群眾將自己的糧食和食物支援紅軍。二、繳獲戰(zhàn)利品。三、通過蘇維埃政府沒收劣紳、地主的糧食。四、向商人和當?shù)厝罕娰徺I糧食。五、運走藏匿在老百姓家的糧食和窖藏，留下銀元或欠條，收割地里成熟的青稞、小麥等，插上木板借條。

圖2 枯草芽孢桿菌接種量對核桃粕納豆品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of Bacillus subtilis inoculum on the quality of walnut meal natto

2.1.3 發(fā)酵溫度對納豆品質(zhì)的影響

由圖3可知，隨發(fā)酵溫度的升高，核桃粕納豆綜合評價分呈先升高后降低的趨勢。隨著發(fā)酵溫度的不斷提高，納豆表面附著的白膜逐漸增多，納豆激酶活力不斷升高；當發(fā)酵溫度達到40 ℃時，綜合評價分達到最大值，為96.0分；繼續(xù)升高發(fā)酵溫度，納豆表面附著的白膜不再增多反而減少，納豆激酶活力也開始下降。這可能是因為在適宜的溫度條件下，枯草芽孢桿菌生長旺盛，利于納豆發(fā)酵。當發(fā)酵溫度過低或過高時，都會影響枯草芽孢桿菌的生長繁殖[22]。因此，選擇最佳發(fā)酵溫度為40 ℃。

圖3 發(fā)酵溫度對核桃粕納豆品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on the quality of walnut meal natto

2.1.4 發(fā)酵時間對納豆品質(zhì)的影響

由圖4可知，隨著發(fā)酵時間的延長，核桃粕納豆綜合評價分呈先升高后降低的趨勢。當發(fā)酵時間為24 h時，綜合評價分達到最大值，為96.0分。當發(fā)酵時間較短時，枯草芽孢桿菌活菌數(shù)不足，納豆表面白膜較少，納豆激酶活力低，發(fā)酵不充分；當發(fā)酵時間過長時，營養(yǎng)物質(zhì)減少，環(huán)境的載菌量不足以承受較多的芽孢，枯草芽孢桿菌菌體逐漸進入衰亡期，亦不利于發(fā)酵[23]。因此，選擇最佳發(fā)酵時間為24 h。

圖4 發(fā)酵時間對核桃粕納豆品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the quality of walnut meal natto

2.1.5 后熟時間對納豆品質(zhì)的影響

由圖5可知，隨著后熟時間的延長，核桃粕納豆綜合評價分呈先上升后緩慢下降的趨勢。當后熟時間為20 h時，綜合評價分達到最大值，為90.5分。這可能是因為納豆激酶極不穩(wěn)定，會隨著后熟時間的延長發(fā)生轉(zhuǎn)化或降解；亦或是后熟過程中產(chǎn)生了特殊的活性物質(zhì)，對納豆激酶的活性產(chǎn)生了抑制作用所致[24]。因此，選擇最佳后熟時間為20 h。

圖5 后熟時間對核桃粕納豆品質(zhì)的影響Fig.5 Effect of post ripening time on the quality of walnut meal natto

2.2 核桃粕納豆發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果分析，運用Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化方法，對表3試驗數(shù)據(jù)進行多元非線性擬合，擬合回歸方程為：

表3 核桃粕納豆發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of response surface tests for fermentation process optimization of walnut meal natto

2.2.2 回歸模型方差分析

由表4可知，模型F值為23.35，P值＜0.000 1，模型極顯著，失擬項（P=0.075 1＞0.05）不顯著，說明模型選擇準確。決定系數(shù)R2=0.958 9，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.917 9，說明此模型和實際實驗擬合較好。預(yù)測的核桃粕納豆最佳發(fā)酵工藝為核桃粕添加量20.5%、接種量1.2%、發(fā)酵溫度40.9 ℃、發(fā)酵時間27 h和后熟時間20 h。此條件下的核桃粕納豆綜合評價預(yù)測值為95.0分。在此條件下進行3次平行驗證試驗，試驗測得綜合評價實際值為94.3分，二者數(shù)值接近，說明模型預(yù)測所得最佳發(fā)酵工藝可用于核桃粕納豆實際生產(chǎn)。

表4 Box-Benhnken試驗結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of Box-Benhnken tests results

2.2.3 響應(yīng)面分析

對核桃粕添加量（A）、接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）和發(fā)酵時間（D）4個因素兩兩作交互作用分析，對其作響應(yīng)曲面及等高線，結(jié)果見圖6。響應(yīng)曲面越陡峭，說明影響越顯著；曲面越平坦，說明影響越小[25-27]。由圖6可知，核桃粕添加量與發(fā)酵溫度之間（AC）、發(fā)酵溫度與發(fā)酵時間（CD）之間的交互作用強，響應(yīng)曲面呈凸形，拋物面更陡峭。

圖6 各因素間交互作用對核桃粕納豆綜合品質(zhì)影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on the comprehensive quality of walnut meal natto

2.3 產(chǎn)品品質(zhì)分析

2.3.1 感官指標分析

依據(jù)SB/T 10528—2009《納豆》和T/CNLIC 0036—2021《納豆》感官要求對產(chǎn)品進行檢驗，結(jié)果表明核桃粕納豆色澤呈茶褐色，表面均勻覆蓋一層白色菌膜，具有納豆特有氣味，攪拌時有黏性強，拉絲長，且豆粒完整，軟硬適當。

2.3.2 理化指標分析

由表5可知，各項理化指標均符合納豆商業(yè)標準要求。

表5 核桃粕納豆理化指標檢測結(jié)果Table 5 Physicochemical indexes determination results of walnut meal natto

2.3.3 揮發(fā)性物質(zhì)測定

由表6可知，核桃粕納豆由HS-SPME-GC-MS分析鑒定出的揮發(fā)性物質(zhì)主要有烴類22種（24.8%）、醇類9種（36.0%）、酯類8種（36.0%）、醚類1種（1.9%）、酮類1種（0.7%）、雜環(huán)化合物2種（0.6%）。上述揮發(fā)性物質(zhì)共同構(gòu)成了核桃粕納豆獨特的風味。核桃粕納豆中主要的揮發(fā)性風味物質(zhì)有2-氨基苯甲酸-3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇酯（31.3%）、芳樟醇（19.5%）、4-萜烯醇（9.1%）、石竹烯（4.4%）等。2-氨基苯甲酸-3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇酯屬于酯類化合物，具有花椒油的氣味[28]；芳樟醇屬于鏈狀萜烯醇類，具有鈴蘭特征的花香氣味[29]；4-萜烯醇屬于天然單萜類化合物，具有較淡的泥土香和陳腐的木材氣味[30]；石竹烯屬于雙環(huán)倍半萜類化合物，具有辛香、木香、柑橘香、樟腦香及溫和的丁香香氣[31]。與傳統(tǒng)納豆風味相比，川芎嗪（0.34%）等具有特殊異臭味的揮發(fā)性物質(zhì)相對減少[32]，核桃粕與黃豆共發(fā)酵起到了改善不良風味的作用，這可能是因為核桃粕原料本身或二者共發(fā)酵相互作用所致。

表6 核桃粕納豆揮發(fā)性物質(zhì)分析Table 6 Analysis of volatile substances in walnut meal natto

3 結(jié)論

以核桃粕和黃豆為原料，選取枯草芽孢桿菌為發(fā)酵菌種制備核桃粕納豆。采用單因素和Box-Behnken試驗得到最佳發(fā)酵工藝條件為核桃粕添加量20.5%、接種量1.2%、發(fā)酵溫度40.9 ℃、發(fā)酵時間27 h和后熟時間20 h。在此條件下，發(fā)酵所得納豆呈茶褐色，拉絲長，氨味低，納豆激酶活力高。通過HS-SPME-GC-MS分析核桃粕納豆揮發(fā)性物質(zhì)成分，結(jié)果表明，核桃粕納豆主要成分為2-氨基苯甲酸-3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇酯（31.3%）、芳樟醇（19.5%）、4-萜烯醇（9.1%）、石竹烯（4.4%）等，這些化合物共同賦予核桃粕納豆獨特風味，與傳統(tǒng)納豆風味相比，川芎嗪（0.34%）等具有特殊異臭味的揮發(fā)性物質(zhì)也相對減少。本研究在保留納豆營養(yǎng)價值的基礎(chǔ)上，降低了氨臭味，對核桃粕納豆的工業(yè)化生產(chǎn)可以提供一定的參考依據(jù)。