基于非靶向代謝組學(xué)分析不同陳化時(shí)間老鷹茶代謝產(chǎn)物的差異

唐佳代，冉光耀，陳 諾，王芙蓉，趙騰飛，冷 枝，王 怡，王士超*

（1.茅臺(tái)學(xué)院 釀酒工程系，貴州 遵義 564500；2.貴州茅臺(tái)酒股份有限公司，貴州 遵義 564500）

老鷹茶（Hawk tea），以樟科毛豹皮樟（Litsea coreanaLevl.var.lanuginosa）的枝葉為原料，通過(guò)殺青、揉捻、渥堆和干燥等工藝制成的一種發(fā)酵茶[1]，其富含茶多酚、多糖、氨基酸和Al、Zn、Fe等微量元素，具有較高的營(yíng)養(yǎng)和保健功能，例如抗氧化、降膽固醇、酒精性肝損傷保護(hù)等[2-4]。目前，有關(guān)老鷹茶的研究多集中于靶向檢測(cè)單一特定物質(zhì)的含量、香氣化合物檢測(cè)和提取，缺乏對(duì)茶葉中所含代謝物系統(tǒng)的研究[5-7]。老鷹茶的品質(zhì)與茶原料品種、加工方式等因素相關(guān)[8]，成品老鷹茶陳化時(shí)長(zhǎng)也是影響其品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一，在民間有老鷹茶越陳品質(zhì)越好的說(shuō)法。

非靶向代謝組學(xué)借助色譜、質(zhì)譜等儀器對(duì)生物系統(tǒng)中小分子代謝物進(jìn)行系統(tǒng)的定性定量分析，通過(guò)數(shù)據(jù)處理和分析準(zhǔn)確找出樣本間差異性代謝物[9]，有助于解析生物樣本中代謝物的重要信息[10]。代謝組學(xué)檢測(cè)技術(shù)主要有高效液相色譜-質(zhì)譜（high performance liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS）聯(lián)用[11]、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用以及核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）光譜等[12]?；贚C-MS聯(lián)用的非靶向代謝組學(xué)主要應(yīng)用于檢測(cè)樣本中分子質(zhì)量＜1 000 Da的氨基酸、糖、酮和有機(jī)酸等非揮發(fā)性相對(duì)小分子代謝物[13]。代謝組學(xué)技術(shù)已應(yīng)用于探究茶葉加工[14]、發(fā)酵[15]、凋萎[16]、茶葉種質(zhì)[17]及其沖泡茶湯[18]中代謝物的特征差異及種質(zhì)鑒別[19-20]，所分析的差異代謝物集中于紅茶、白茶等茶葉中的黃酮、兒茶素、有機(jī)酸、氨基酸和核苷酸類(lèi)化合物。目前，尚未見(jiàn)基于非靶向代謝組學(xué)探究老鷹茶中代謝產(chǎn)物影響的研究報(bào)道。

本研究以產(chǎn)自貴州省正安縣未陳化、陳化1年、2年和3年的老鷹茶為研究對(duì)象，通過(guò)超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（ultraperformanceliquidchromatography-quadrupoletime-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）技術(shù)分析老鷹茶中非揮發(fā)代謝物組成，利用主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）篩選差異性代謝物，旨在探究陳化對(duì)老鷹茶代謝物的影響，為老鷹茶代謝物資源挖掘與利用奠定理論基礎(chǔ)，助力貴州老鷹茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

老鷹茶A（未陳化，HTa）、老鷹茶B（陳化1年，HTb）、老鷹茶C（陳化2年，HTc）、老鷹茶D（陳化3年，HTd）：均購(gòu)于貴州省正安縣，在溫度為20～25 ℃條件下進(jìn)行陳化。

甲醇、乙腈（均為色譜純）：德國(guó)Merck公司；L-2-氯苯丙氨酸（色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲酸（色譜純）：印度HCL公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC Acquity I-Class PLUS超高效液相色譜、Acquity UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、Waters UPLCXevoG2-XSQTOF高分辨質(zhì)譜（配有電噴霧離子（electric spray ion，ESI）源）：美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 老鷹茶代謝物的提取

將老鷹茶樣研磨成粉，稱(chēng)取50 mg，加入1 000 μL甲醇∶乙腈∶水=2∶2∶1（V/V），渦旋30 s。研磨儀45 Hz研磨10 min后置于冰水浴中超聲10 min。-20 ℃條件下靜置1 h后，于4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min，取500 μL上清液真空濃縮干燥。干燥后的代謝物加入160 μL乙腈水提取液乙腈∶水=1∶1（V/V）復(fù)溶，渦旋30 s后置于冰水浴中超聲10 min。將樣本在4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min；取120 μL上清液于進(jìn)樣瓶中上機(jī)檢測(cè)，每個(gè)樣本各取10 μL混合成質(zhì)量控制樣本（quality control，QC）上機(jī)檢測(cè)。

1.3.2 超高效液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)條件

超高效液相色譜條件：Acquity UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；液相色譜的流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈（含0.1%甲酸）。進(jìn)樣體積1 μL，流速為400 μL/min。梯度洗脫程序?yàn)?～0.25 min，2%流動(dòng)相B；10 ～13 min，98%流動(dòng)相B；13.1 min 時(shí)，2%流動(dòng)相B。

質(zhì)譜條件：采用ESI源正、負(fù)離子模式檢測(cè)，正離子模式毛細(xì)管電壓2 500 V，負(fù)離子模式毛細(xì)管電壓-2 000 V，錐孔電壓30 V；離子源溫度100 ℃，脫溶劑氣溫度500 ℃；反吹氣流速50 L/h，脫溶劑氣流速800 L/h；質(zhì)核比50～1 200 m/z。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

使用MassLynx V4.2采集的原始數(shù)據(jù)，通過(guò)Progenesis QI軟件做峰提取、峰對(duì)齊等數(shù)據(jù)處理操作，基于自建庫(kù)開(kāi)展化合物注釋、識(shí)別。數(shù)據(jù)進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析，采用Prcomp 3.6.1進(jìn)行主成分分析，ropls1.6.2進(jìn)行正交偏最小二乘-判別分析。根據(jù)老鷹茶樣品變量投影重要度（variable importance in project，VIP）和T檢驗(yàn)計(jì)算各化合物的差異顯著性P值，以O(shè)PLS-DA模型P＜0.05和VIP＞1相結(jié)合的方法篩選差異代謝物。并使用Origin 2021軟件繪制差異性代謝物熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 QC樣本檢測(cè)

QC樣本相關(guān)性越接近于1，說(shuō)明整個(gè)檢測(cè)過(guò)程穩(wěn)定性越好[21]。QC樣本相關(guān)性均＞0.977，說(shuō)明質(zhì)譜檢測(cè)的樣品的均一度較好。

2.2 不同陳化時(shí)間老鷹茶代謝物的主成分分析

不同陳化時(shí)間的老鷹茶樣本中共注釋到4 530個(gè)代謝物，為反映不同陳化時(shí)間的老鷹茶樣本間代謝物的差異大小，分別在正離子模式和負(fù)離子模式下對(duì)老鷹茶代謝物進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，正離子模式下第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）方差貢獻(xiàn)率分別為31.86%和19.96%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為51.82%，負(fù)離子模式下第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）方差貢獻(xiàn)率分別為33.82%和17.12%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為50.94%，包含樣本中大部分代謝物信息。主成分分析得分圖中單個(gè)散點(diǎn)代表一個(gè)QC樣本點(diǎn)，樣本點(diǎn)間的距離越大代表樣本間代謝物的組成和含量差異越大，樣本點(diǎn)間的距離越小代表樣本間代謝物組成和含量差異越小[22]。在正離子模式和負(fù)離子模式下，未經(jīng)陳化的老鷹茶樣本（HTa）點(diǎn)與陳化的老鷹茶樣本（HTb、HTc、HTd）點(diǎn)間距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明經(jīng)過(guò)陳化后老鷹茶中代謝物有明顯變化。經(jīng)過(guò)陳化的三個(gè)老鷹茶（HTb、HTc、HTd）樣本點(diǎn)在PC1上較為靠近，說(shuō)明陳化1年、2年和3年的老鷹茶樣本代謝物的種類(lèi)和含量差異較小。

圖1 正離子模式（A）和負(fù)離子模式（B）下老鷹茶代謝物主成分分析得分圖Fig.1 Score plots of principal component analysis of Hawk tea metabolites under positive ion (A) and negative ion (B) mode

2.3 不同陳化時(shí)間老鷹茶代謝物的正交偏最小二乘-判別分析

OPLS-DA模型得分圖中橫坐標(biāo)（t1）代表組間差異分量，樣本點(diǎn)橫向距離大小與組間差異成正比?？v坐標(biāo)（to1）代表組內(nèi)差異分量，樣本點(diǎn)縱向距離大小與組內(nèi)差異成正比。括號(hào)中的百分比代表該分量在總方差中的占比[23]。指標(biāo)Q2Y是評(píng)價(jià)模型的預(yù)測(cè)參數(shù)之一，表示模型的預(yù)測(cè)能力即所建模型能否通過(guò)代謝表達(dá)量區(qū)分正確的樣本分組，Q2Y越接近于1時(shí)表示模型越穩(wěn)定可靠，即可以用此模型篩選差異代謝物[24]。不同陳化時(shí)間的老鷹茶代謝物的OPLS-DA得分圖見(jiàn)圖2。由圖2可知，Q2Y均＞0.887，表明所建立的OPLS-DA模型有效。兩兩樣本間橫向距離較大且均處于95%置信區(qū)間，表明不同陳化時(shí)間老鷹茶樣本的代謝物具有顯著差異（P＜0.05）。

為檢查OPLS-DA模型的可靠性，進(jìn)行置換檢驗(yàn)，按置換分組進(jìn)行OPLS-DA建模計(jì)算其R2Y和Q2Y，將建模結(jié)果繪制成散點(diǎn)圖，圖中x軸表示置換分組與原模型分組的相關(guān)性，y軸表示R2Y或者Q2Y的取值（其中在x軸取1的R2Y和Q2Y為原模型的值），藍(lán)點(diǎn)和紅點(diǎn)分別代表置換后模型的R2Y和Q2Y，兩條虛線為R2Y和Q2Y擬合的回歸線。若Q2Y擬合回歸線斜率為正則說(shuō)明模型有意義，藍(lán)點(diǎn)普遍位于紅點(diǎn)上方代表其檢測(cè)值都低于真實(shí)值，說(shuō)明建模訓(xùn)練集和測(cè)試集的獨(dú)立性較好[25]。為驗(yàn)證模型是否過(guò)擬合設(shè)置假設(shè)檢驗(yàn)的次數(shù)為200，繪制不同陳化時(shí)間的老鷹茶代謝物的OPLS-DA置換檢驗(yàn)圖見(jiàn)圖3。由圖3可知，不同陳化時(shí)間的老鷹茶兩兩樣本組的Q2Y擬合回歸線斜率均＞1，檢測(cè)值都低于真實(shí)值，Q2Y的回歸線截距小于0.5，證明所建立的OPLS-DA模型沒(méi)有過(guò)擬合[26]。

圖3 不同陳化時(shí)間老鷹茶代謝物的正交偏最小二乘-判別分析置換檢驗(yàn)圖Fig.3 Permutation test diagram of orthogonal partial least squares-discriminant analysis of Hawk tea metabolites with different aging time

2.4 不同陳化時(shí)間老鷹茶差異顯著代謝物篩選及分析

基于OPLS-DA結(jié)果，根據(jù)OPLS-DA模型的VIP≥1且P＜0.05的代謝物篩選老鷹茶組間差異顯著代謝物。隨著陳化時(shí)間的增加，老鷹茶樣本中差異顯著代謝物數(shù)量逐漸上升。未陳化老鷹茶樣本與陳化1年老鷹茶樣本差異顯著代謝物數(shù)為832個(gè)，其中上調(diào)的差異顯著代謝物為448個(gè)（占比53.85%），下調(diào)差異顯著代謝物為384個(gè)（占比46.15%）。未陳化老鷹茶樣本與陳化2年老鷹茶樣本差異顯著代謝物數(shù)為925個(gè)，其中上調(diào)的差異顯著代謝物498個(gè)（占比53.84%），下調(diào)差異顯著代謝物為427個(gè)（占比46.16%）。未陳化老鷹茶樣本與陳化3年老鷹茶樣本差異顯著代謝物數(shù)為1 071個(gè)，其中上調(diào)的差異顯著代謝物為644個(gè)（占比60.13%），下調(diào)差異顯著代謝物為427個(gè)（占比39.87%）。結(jié)果表明，陳化3年老鷹茶樣本差異顯著代謝物數(shù)最多。

通過(guò)比對(duì)不同陳化時(shí)間的老鷹茶中氨基酸類(lèi)、多酚類(lèi)、嘌呤類(lèi)化合物等影響發(fā)酵茶滋味的主要物質(zhì)差異[27]，分析陳化時(shí)間對(duì)老鷹茶滋味成分的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同陳化時(shí)間的老鷹茶顯著差異代謝物熱圖Fig.4 Heat map of significant difference metabolites of Hawk tea with different aging time

由圖4可知，經(jīng)過(guò)陳化的老鷹茶中氨基酸、肽和類(lèi)似物顯著差異代謝產(chǎn)物有12種，其中含量隨陳化時(shí)間增加的物質(zhì)有泛酰巰基乙胺4'-磷酸、L-天冬氨酸、肌酸、精氨?；?lài)氨酸、高甲硫氨酸、2-氨基-6-半醛，在陳化過(guò)程中隨著茶葉蛋白質(zhì)分解，氨基酸類(lèi)物質(zhì)含量明顯提高。含量隨陳化時(shí)間降低的物質(zhì)有L-苯丙氨酸、L-多巴色素、4-磷酸-L-天冬氨酸、谷胱甘肽、番杏多巴黃素和環(huán)絲氨酸。氨基酸是貢獻(xiàn)茶湯香氣和滋味的主要物質(zhì)，對(duì)茶葉品質(zhì)的形成有重要作用[28]。L-天冬氨酸屬于鮮味氨基酸，是茶湯鮮爽味的主要來(lái)源之一[29]。肌酸存在于骨骼肌中，是合成磷酸肌酸的原料，磷酸肌酸可促進(jìn)人體腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的合成，為機(jī)體運(yùn)動(dòng)提供能量[30]。L-苯丙氨酸是茶葉中苦味物質(zhì)和重要的香氣成分，其是合成茶葉香氣物質(zhì)揮發(fā)性苯丙酸/苯類(lèi)化合物的前體物質(zhì)[31]，伴隨著茶葉香氣化合物的合成，其含量有所減少。在陳化中與氧氣長(zhǎng)期接觸，茶葉中其含量有所減少。

在不同陳化時(shí)間老鷹茶的差異代謝物中黃酮醇類(lèi)有表兒茶素和（-）-表兒茶素、黃杉素和紫鉚黃酮4種物質(zhì)。其中表兒茶素和（-）-表兒茶素相對(duì)含量較高，但隨著陳化時(shí)間延長(zhǎng)，其含量均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。不同陳化時(shí)間老鷹茶樣本中差異代謝物中黃酮糖苷類(lèi)化合物有11種，其中，野漆樹(shù)苷、槲皮素3-O-（6-O-丙二?；?β-D-葡萄糖苷、山奈苷、水仙苷、芹菜素7-O-新橘皮糖苷、曲克蘆丁的含量隨陳化時(shí)間延長(zhǎng)呈增加趨勢(shì)。茶葉中的多酚類(lèi)物質(zhì)主要包括兒茶素、黃酮及其糖苷等，是茶葉中主要的水溶性成分，兒茶素類(lèi)是茶葉中重要的多酚類(lèi)物質(zhì)，其化合性質(zhì)活潑，在常溫常壓下能夠緩慢氧化，氧化產(chǎn)生多酚類(lèi)物質(zhì)經(jīng)一系列化學(xué)反應(yīng)，生成一些對(duì)茶葉的滋味產(chǎn)生影響的物質(zhì)[32]。

嘌呤類(lèi)化合物與茶葉的苦澀味相關(guān)，且對(duì)茶葉適制性有重要影響。不同陳化時(shí)間老鷹茶樣本中嘌呤和嘌呤衍生物為次黃嘌呤和7-甲基黃嘌呤，兩者均為嘌呤生物堿，是茶葉苦味的主要來(lái)源[33]。隨陳化時(shí)間延長(zhǎng)，其含量均降低，陳化能夠一定程度的降低茶葉中的苦味成分。

綜上，老鷹茶陳化過(guò)程中，老鷹茶中鮮味成分含量增加、苦澀味相關(guān)成分物質(zhì)含量降低，抗氧化成分及其他保健功能性成分增加。故認(rèn)為老鷹茶的滋味和營(yíng)養(yǎng)成分能夠通過(guò)陳化改善，即陳化將增加老鷹茶及其茶湯的滋味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

3 結(jié)論

基于UPLC-QTOF-MS非靶向代謝組學(xué)技術(shù)分析未陳化、陳化1年、2年和3年的老鷹茶代謝物，結(jié)合主成分分析（PCA）及正交偏最小二乘-判別分析（OPLS-DA）法對(duì)代謝物進(jìn)行分析。結(jié)果表明，共注釋到4 530個(gè)代謝物，以VIP≥1且P＜0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)篩選差異顯著代謝物，隨著陳化老鷹茶樣本中差異顯著代謝物數(shù)量逐漸上升，且上調(diào)代謝物在數(shù)目占優(yōu)勢(shì)。陳化在一定程度上會(huì)提高老鷹茶滋味，經(jīng)過(guò)陳化的老鷹茶中與鮮味相關(guān)的L-天冬氨酸含量顯著提高，苦味物質(zhì)次黃嘌呤和7-甲基黃嘌呤顯著降低，具有抗氧化作用、降血糖潛力、抗腫瘤功效的黃酮類(lèi)化合物顯著增加。綜合來(lái)看，老鷹茶陳化過(guò)程中鮮味成分含量增加、苦澀味相關(guān)成分物質(zhì)降低，抗氧化及其他保健功能性成分增加。本研究為進(jìn)一步為解析老鷹茶陳化過(guò)程中代謝機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。