體外條件下不同乳酸菌對旅行者腹瀉的干預機制

李思童，賈曉蒙，路江浩，郭紅敏，劉明月，孫 策，任 磊，楊 玲*

（河北一然生物科技股份有限公司 研發(fā)中心，河北 石家莊 050000）

旅行者腹瀉（traveler's diarrhea，TD）指在旅行期間或旅行后，每天有3次及以上未成形便，同時伴隨腹痛、惡心、嘔吐、發(fā)熱或血便、粘液便的急性腸道傳染病，全球TD發(fā)病率為30%～50%。調查發(fā)現，80%～90%的TD由細菌感染，其中40%～70%病原菌為產腸毒素大腸桿菌（enterotoxigenicEscherichia coli，ETEC）[1-2]。青壯年由于接觸范圍廣為旅行者腹瀉易感人群，另外老人、小孩、孕婦等免疫力低下者感染后癥狀較嚴重，可能引起心血管疾病、低血糖或脫水等癥狀[3]。ETEC感染后在黏附素作用下黏附、定殖于腸道上皮細胞，通過釋放腸毒素引起細胞過度凋亡，破壞上皮細胞正常生理功能，導致腸道通透性和滲透性增加，造成腸道屏障受損，從而引起炎癥和腹瀉。同時，腸道屏障的損傷更有利于ETEC的定殖和腸毒素分泌入胞內，使其致病性增強，加劇腸道炎癥與腹瀉癥狀[4-5]。

益生菌是指足量攝入時能夠對宿主產生健康益處的活性微生物，能夠定植于腸道發(fā)揮多種益生功能[6-7]。其中，乳酸菌的特定菌株可以通過調節(jié)腸道微生態(tài)平衡、增強腸道屏障、改善機體免疫功能等多種機制改善腸道健康，是公認的有益菌[8-9]。大量研究表明，乳酸菌對腹瀉具有緩解作用。臧凱麗等[10]研究發(fā)現，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）能夠改善便秘和腹瀉人群的腸道菌群結構及相關癥狀。?UKASIK J等[11-12]研究發(fā)現，植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）、副干酪乳桿菌（Lacticaseibacillus paracasei）、乳雙歧桿菌（Bifidobacterium lactis）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）等乳酸菌能夠降低兒童抗生素腹瀉發(fā)病風險，并恢復營養(yǎng)不良嬰兒的腸道菌群結構減少腹瀉的發(fā)生。另外，OKSANEN P等[13-14]研究發(fā)現，服用乳酸桿菌和鼠李糖乳桿菌GG（Lactobacillus rhamnosusGG，LGG）能夠顯著降低TD發(fā)病率。但不同種屬乳酸菌對旅行者腹瀉的緩解效果具有差異性，其具體調控機制尚不明確。

因此，本研究采用腸道體外發(fā)酵模擬系統(tǒng)，通過考察不同種屬乳酸菌對ETEC抑制效果，調節(jié)水通道蛋白-3（aquaporin-3，AQP-3）表達和免疫因子分泌能力，以及拮抗ETEC造成的腸道屏障損傷方面的作用效果，進一步探明不同種屬乳酸菌對TD的干預機制及效果差異。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與細胞

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）LP45、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）La28、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）LR519、乳雙歧桿菌（Bifidobacterium lactis）BAL531、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）S131、S709、S869、產腸毒素大腸桿菌（ETEC）、人體結腸癌細胞系HT-29細胞株：河北一然生物科技股份有限公司。

1.1.2 化學試劑

胎牛血清、胰蛋白酶細胞消化液（0.25%，含乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA），不含酚紅）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）：武漢普諾賽生命科技有限公司；細胞/細菌總核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）提取試劑盒、FastKing互補脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）第一鏈合成試劑盒、SuperReal 熒光定量預混試劑增強版（SYBR Green）試劑盒：天根生化科技有限公司；IL-8酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒：北京四正柏生物科技有限公司；0.25%胰蛋白酶溶液（含乙二胺四乙酸（EDTA），溶于磷酸鹽緩沖液PBS）：武漢普諾賽生命科技有限公司；細胞計數試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

HT-29細胞完全培養(yǎng)基、McCoy's 5A培養(yǎng)基：武漢普諾賽生命科技有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、哥倫比亞血平板：北京陸橋技術股份有限公司。

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基：參考文獻[15]配制，調節(jié)pH至6.5，然后厭氧條件下在10 mL的西林瓶中分裝5 mL培養(yǎng)基，密封后于115 ℃高壓滅菌25 min。

1.2 儀器與設備

Mini細胞計數儀：美國Nexcelom公司；Multiskan Sky酶標儀、Fresco21型高速離心機：賽默飛世爾科技公司；CKX41倒置顯微鏡：日本奧林巴斯公司；DH-160HI二氧化碳培養(yǎng)箱、LRH-250F生化培養(yǎng)箱：昆山一恒儀器有限公司；9700型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀：杭州博日科技有限公司；LM2 012實時熒光定量PCR（realtime fluorescent quantitative PCR，RT-fqPCR）分析儀：上海復星醫(yī)學檢測設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸菌、ETEC及HT-29細胞的培養(yǎng)

菌株活化：植物乳桿菌LP45、嗜酸乳桿菌La28、鼠李糖乳桿菌LR519、乳雙歧桿菌BAL531、嗜熱鏈球菌S131、S709、S869以3%（V/V）的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，連續(xù)傳代3次；ETEC以3%（V/V）的接種量接種于LB培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，連續(xù)傳代3次。

菌懸液濃度調整：取第3代培養(yǎng)18 h以恢復菌種活力后的各菌株調整菌液濃度。3代菌種4 ℃、5 000 r/min離心5 min，收集菌體用PBS洗滌2次4 ℃、5 000 r/min離心5 min后，去除上清，用MyCoy's 5A培養(yǎng)基重懸，利用細胞計數儀調整菌株LP45、La28、LR519、BAL531、S131、S709、S869 及ETEC菌體濃度均為108CFU/mL，備用。

細胞培養(yǎng)：將在-80 ℃超低溫冰箱中保存的細胞HT-29取出，37 ℃恒溫水浴迅速解凍復蘇，培養(yǎng)瓶中加入一定量的HT-29細胞完全培養(yǎng)基，5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h至細胞長滿培養(yǎng)瓶底面積80%后，加入1 mL胰蛋白酶細胞消化液消化處理1 min至細胞懸浮后加入2mL HT-29細胞完全培養(yǎng)基終止消化，細胞懸液于12 000 r/min離心2 min后收集細胞并轉移至75 mL中號培養(yǎng)瓶中補充HT-29細胞完全培養(yǎng)基至15 mL，重復上述操作傳代3次進行后續(xù)實驗。

1.3.2 體外發(fā)酵實驗分組及發(fā)酵液的制備

取正常人新鮮糞便用生理鹽水按照1∶10（g∶mL）比例稀釋過濾得到糞便接種液，取500 μL糞便接種液接種到基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中，按照表1分組及接種ETEC與各乳酸菌菌懸液，于37 ℃培養(yǎng)24 h后得到發(fā)酵液，將發(fā)酵液于9 000 r/min離心3 min，上清液經0.22 μm膜過濾后備用。

表1 體外發(fā)酵實驗分組及接種Table 1 Grouping and inoculation of fermentation experiments in vitro

1.3.3 發(fā)酵液與HT-29細胞共培養(yǎng)

將1.3.1節(jié)中活化HT-29細胞濃度調整為2×105個/mL，每孔2 mL細胞液接于24孔板中，培養(yǎng)16～20 h細胞貼壁后，更換2 mL新鮮培養(yǎng)液。對照組、ETEC組及治療組分別每孔接種1.3.2節(jié)中各分組發(fā)酵上清液200 μL于24孔板，接種200 μL HT-29細胞培養(yǎng)液為空白組，置于5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)12 h后每孔加入100 μL胰蛋白酶消化處理1 min至細胞懸浮，加入200 μL HT-29細胞完全培養(yǎng)基終止消化，收集細胞懸液于12 000 r/min離心2 min后分別收集細胞及上清液，-80 ℃貯藏待用。

1.3.4 不同種屬乳酸菌抑制ETEC能力測定

采用牛津杯雙層平板法，按照1.3.1將調整濃度后的ETEC涂布到哥倫比亞血平板上，立即放入牛津杯，加入菌體濃度均為108CFU/mL的各乳酸菌菌懸液100 μL，以生理鹽水為對照，37 ℃培養(yǎng)18 h，采用游標卡尺測量抑菌圈直徑，當抑菌圈直徑＞8 mm表示有抑菌作用[16]。

1.3.5 HT-29細胞免疫因子質量濃度的測定

使用1.3.3節(jié)中所收集的細胞上清液再次于12 000 r/min離心2 min，取上清分裝至無酶PE管中，按照ELISA試劑盒說明書測定各樣品細胞因子質量濃度，細胞培養(yǎng)基作為空白孔。

1.3.6 實時熒光定量PCR分析

按照RNA Easy Fast動物組織/細胞RNA提取試劑盒操作說明提取1.3.3節(jié)中共培養(yǎng)后HT-29細胞RNA，并通過Fast King cDNA第一鏈合成試劑盒操作說明反轉錄為cDNA，并在-80 ℃保存。使用Super Real 熒光定量預混試劑增強版（SYBR Green）試劑盒進行RT-fqPCR，分析黏蛋白（mucin，MUC）（MUC2、MUC5AC）、水通道蛋白-3（aquaporin-3，AQP-3）基因與緊密連接蛋白基因，包括閉合小環(huán)蛋白-1/2（zonula occluden-1/2，ZO-1/2）及咬合蛋白（occludin）相對表達水平，RT-fqPCR引物序列見表2。

表2 RT-fqPCR引物序列Table 2 Primer sequences of RT-fqPCR

參照SYBR Green試劑盒說明書要求進行加樣。加樣后進行RT-fqPCR擴增，擴增體系、擴增參數參考張秋月等[17]的研究并加以修改：95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，循環(huán)45次。溶解曲線分析步驟為65～95 ℃，每步升0.5 ℃，保持5 s。以β-actin基因為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算各實驗組相對于對照組各基因的相對表達倍數。

1.3.7 細胞增殖能力測定

將活化HT-29細胞濃度調整為2×105個/mL，每孔100 μL細胞液接于96孔板中，于5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)16～20 h細胞貼壁后，更換新鮮培養(yǎng)液，每孔接種分組發(fā)酵上清液10 μL于96孔板，接種10 μL細胞培養(yǎng)液為空白組，置于5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)12 h后參考CCK-8試劑盒說明書檢測細胞增殖情況：每孔內加入10 μL的CCK-8溶液，細胞培養(yǎng)箱內孵育1 h，在波長450 nm處測定吸光度值（OD450nm值。細胞相對增殖率計算公式如下：

式中：As表示實驗組OD450nm值，Ac表示空白對照組OD450nm值。

1.3.8 數據統(tǒng)計分析

所有實驗均設置3組平行，數據以“平均值±標準差”表示。采用Origin 9.5軟件繪圖，采用Excel 2016、SPSS 23.0軟件對數據進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 不同種屬乳酸菌對ETEC的抑制能力

由圖1可知，菌株LP45、La28、LR519、BAL531、S131、S709及S869抑菌圈直徑均＞8 mm，表現出明顯的抑制ETEC的作用，其中嗜熱鏈球菌S131抑菌圈直徑達到（18.00±0.59）mm，抑菌作用最顯著（P＜0.05）。表明不同種屬乳酸菌均具有良好的抑制致病菌、緩解TD的能力。相關研究表明[18-19]，乳酸菌通過分泌抑菌物質，如短鏈脂肪酸，降低環(huán)境pH從而抵抗致病菌，或與致病菌競爭營養(yǎng)物質及黏附位點等方式阻斷致病菌黏附與增殖。不同菌株生長過程中合成短鏈脂肪酸能力與黏附能力不盡相同，這可能是不同乳酸菌抑制致病菌能力存在差異的原因。

圖1 不同種屬乳酸菌對產腸毒素大腸桿菌的抑制能力Fig.1 Inhibition ability of different species of lactic acid bacteria on enterotoxigenic Escherichia coli

2.2 不同種屬乳酸菌拮抗ETEC引起的HT-29細胞炎癥因子表達

細菌感染性腹瀉中，致病菌ETEC影響了腸道屏障，侵入腸壁固有層，破壞免疫穩(wěn)態(tài)，引發(fā)炎性病變，導致膿血滲出性腹瀉，損害腸道健康[20-21]。由圖2可知，ETEC組促炎因子白細胞介素-8（interleukin，IL-8）濃度相較于Control組顯著增加了（20.82±5.70）%（P＜0.05），表現出較高的促炎作用，可能引起炎癥病變。菌株LP45、La28、BAL531、S131、S709、S869的干預使得IL-8濃度相較于ETEC組分別下降了（24.46±2.51）%、（30.45±4.05）%、（6.13±1.56）%、（30.16±4.34）%、（12.99±2.75）%和（35.07±3.19）%，其中菌株S869抑制作用顯著（P＜0.05）。與該結果相似，YANG J等[22-23]研究發(fā)現，乳桿菌屬能夠有效抑制ETEC刺激HT-29細胞產生炎癥因子。大量動物實驗也表明，乳酸菌能夠降低仔豬或小鼠體內炎癥因子水平，從而降低炎癥反應[24-25]。結果表明，上述菌株能夠抑制ETEC刺激HT-29細胞產生的促炎因子IL-8，從而抑制炎癥發(fā)生、提高腸道免疫力，有效緩解ETEC感染造成的腸道炎癥及滲出性腹瀉。

圖2 不同種屬乳酸菌拮抗產腸毒素大腸桿菌引起的HT-29細胞炎癥因子表達Fig.2 Different species of lactic acid bacteria antagonized the expression of inflammatory factors in HT-29 cells induced by enterotoxigenic Escherichia coli

2.3 不同種屬乳酸菌對HT-29細胞AQP-3表達的影響

致病菌能夠直接侵入腸道上皮細胞，引起細胞功能障礙，同時破壞腸道微絨毛減少腸道吸收面積，造成吸收障礙，從而引起吸收障礙性或滲出性腹瀉[26-27]。水通道蛋白（aquaporins，AQPs）是位于細胞膜上的蛋白質，能夠調節(jié)水在細胞中的轉運，調節(jié)AQP-3表達能夠有效改善便秘或腹瀉癥狀[28-29]。由圖3可知，與Control相比，ETEC使HT-29細胞AQP-3 mRNA相對表達下調至（34±7）%。與ETEC相比，除菌株S869外，其余各乳酸菌的干預均可改善ETEC造成的AQP-3表達下調，其中菌株LP45及S709提升作用顯著，分別使AQP-3 mRNA相對表達顯著提升（2.77±0.60）倍、（2.39±0.14）倍（P＜0.05）。雖然ETEC引起腹瀉的水外流機制尚未明確，但其可能與AQP-3表達下調有關，各乳酸菌通過恢復AQP-3的表達、提高腸道吸水能力，降低糞便含水量，從而改善ETEC造成的腹瀉。該結果與IKARASHI N等[30-31]鼠李糖乳桿菌LB1改善ETEC引起仔豬腹瀉的機制相似。

圖3 不同種屬乳酸菌對HT-29細胞AQP-3表達的影響Fig.3 Effect of different species of lactic acid bacteria on AQP-3 expression in HT-29 cells

2.4 不同種屬乳酸菌對HT-29細胞黏蛋白表達的影響

腸道中的杯狀細胞能夠分泌黏蛋白形成一層黏液屏障，黏液屏障作為腸道機械屏障的重要組成之一，能夠保護腸道上皮細胞免受病原菌和有害物質的侵襲、一定程度上能夠阻止致病菌的黏附，同時對腸上皮細胞保護及腸道轉運過程至關重要[32-33]。由圖4可知，與Control相比，ETEC分別使HT-29細胞MUC2、MUC5AC mRNA相對表達水平下調至（75±5）%（P＞0.05）和（52±1）%（P＜0.05），而各乳酸菌的干預能夠改善ETEC對黏蛋白基因的抑制。其中，植物乳桿菌LP45能夠顯著提升MUC2信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）相對表達至（2.39±0.15）倍（P＜0.05），嗜熱鏈球菌S709顯著提升MUC5AC mRNA相對表達至（1.89±0.21）倍（P＜0.05），從而增加腸道的黏液分泌，改善ETEC感染造成的黏液屏障損傷，增強腸道屏障、恢復黏膜屏障功能。

圖4 不同種屬乳酸菌對HT-29細胞黏蛋白表達的影響Fig.4 Effect of different species of lactic acid bacteria on mucin expression in HT-29 cells

2.5 不同種屬乳酸菌對HT-29細胞緊密連接蛋白表達的影響

緊密連接的腸道上皮細胞是腸道機械屏障的基礎，能夠有效避免致病菌或大分子物質透過細胞間隙，而致病菌可通過改變緊密連接蛋白結構與功能等方式破壞腸道屏障[33-34]。由圖5可知，與Control相比，ETEC對緊密連接蛋白表達的抑制效果并不明顯，僅使HT-29細胞ZO-2 mRNA相對表達下調至（63±4）%。另外，各乳酸菌的干預能夠在ETEC存在的情況下上調各緊密連接蛋白的相對表達，其中嗜熱鏈球菌S869分別使ZO-1、occludin mRNA相對表達顯著上調（15.24±0.93）倍、（9.06±0.09）倍（P＜0.05），鼠李糖乳桿菌LR519和乳雙歧桿菌BAL531分別使ZO-2 mRNA相對表達顯著上調（14.83±1.60）倍、（13.27±1.01）倍（P＜0.05），表示各乳酸菌均可上調細胞緊密連接蛋白表達，增強腸上皮細胞的緊密連接，恢復腸道屏障功能，但其作用效果存在一定的菌株差異。這與朱翠等[35-36]研究發(fā)現，乳酸菌能夠調節(jié)腸上皮細胞緊密連接蛋白表達及其在胞內的分布，腸道內雙歧桿菌、乳桿菌分泌的短鏈脂肪酸能夠維持腸黏膜上皮細胞緊密連接、保護腸道機械屏障的結果相似。

圖5 不同種屬乳酸菌對HT-29細胞緊密連接蛋白表達的影響Fig.5 Effect of different species of lactic acid bacteria on tight junction protein expression in HT-29 cells

2.6 不同種屬乳酸菌拮抗ETEC造成的HT-29細胞損傷

腸上皮細胞是腸道機械屏障的另一組成部分，其完整性對腸道吸收營養(yǎng)物質、阻擋致病菌和內毒素的入侵至關重要[37]。由圖6可知，ETEC組HT-29細胞增殖率降低（2.06±0.08）%（P＜0.05）。除菌株S869外，各乳酸菌的干預可改善ETEC造成的腸上皮細胞損傷，其中嗜熱鏈球菌S131能夠使HT-29細胞的相對增殖率顯著提高至（21.07±1.21）%（P＜0.05），結果表明，上述乳酸菌能夠清除ETEC產生的毒素類物質，產生有益于腸上皮細胞生長的物質，從而拮抗ETEC對腸上皮細胞的損傷。該結果與VON MENTAER A等[38-39]研究發(fā)現，ETEC通過破壞細胞骨架、引起炎癥反應等機制對宿主腸道上皮細胞造成損傷結論一致。

圖6 不同種屬乳酸菌拮抗產腸毒素大腸桿菌造成的HT-29細胞損傷Fig.6 Different species of lactic acid bacteria antagonized the damage of HT-29 cells caused by enterotoxigenic Escherichia coli

3 結論

植物乳桿菌LP45、嗜酸乳桿菌La28、鼠李糖乳桿菌LR519、乳雙歧桿菌BAL531、嗜熱鏈球菌S131、S709可以通過抑制致瀉性大腸桿菌ETEC，拮抗ETEC感染造成的AQP-3表達下調、炎癥因子分泌增加及上皮細胞凋亡，提高腸道吸水能力、增強腸道免疫，從而改善腹瀉癥狀，緩解水樣便或膿血便。此外，上述乳酸菌均在不同程度上緩解ETEC感染造成的腸道黏膜屏障與緊密連接損傷，增強腸道機械屏障，從而維持基本腸道健康。綜合來說，菌株LP45、La28、LR519、BAL531、S131、S709及S869能夠通過抑制腸道致病菌，恢復腸道通透性及正常腸道屏障生理功能，降低腸道炎癥等機制緩解TD腹瀉癥狀，但不同乳酸菌在各機制下的作用效果存在一定差異。