產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的分離鑒定、高溫馴化及酶學(xué)性質(zhì)研究

張 璋，趙騰飛，李紅霞，胡智慧，宋露露

（茅臺(tái)學(xué)院 釀酒工程系，貴州 遵義 564507）

白酒是中國(guó)傳統(tǒng)的酒精飲料，是世界上最古老的蒸餾酒之一[1-2]，以獨(dú)特的風(fēng)味在中國(guó)倍受推崇，也逐漸受到世界各地的關(guān)注和歡迎。白酒生產(chǎn)包括大曲制作、發(fā)酵、蒸餾和陳釀[1，3-4]。大曲是白酒發(fā)酵重要的發(fā)酵劑和糖化劑，主要含有各種微生物及其所分泌的多種水解酶系[5-8]。在繁雜的水解酶系中，淀粉酶能夠?qū)⒌矸鬯獠⒆罱K產(chǎn)生寡糖單元，廣泛應(yīng)用于酒精、食品、醫(yī)藥、化工、造紙和紡織等行業(yè)當(dāng)中，是最為重要的工業(yè)酶制劑之一。淀粉酶由多種細(xì)菌、霉菌等微生物產(chǎn)生。在大曲尤其是醬香型白酒的高溫大曲中，芽孢桿菌作為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，更是生產(chǎn)淀粉酶的主力菌種。

在針對(duì)芽孢桿菌淀粉酶研究與開(kāi)發(fā)進(jìn)程中，學(xué)者們重點(diǎn)針對(duì)淀粉酶產(chǎn)生菌、基因特征、表達(dá)方式、酶學(xué)性質(zhì)改造、生產(chǎn)工藝優(yōu)化等方面進(jìn)行了研究，取得了大量的研究成果[9-12]。但是針對(duì)工業(yè)應(yīng)用多種多樣的需求來(lái)說(shuō)，如醬香型白酒的高溫釀造環(huán)境或者利用低溫蒸煮生米作為碳源進(jìn)行谷胱甘肽的發(fā)酵[13-14]等，篩選具有廣泛適用性的菌種及對(duì)其產(chǎn)酶能力的研究仍在進(jìn)行之中。如貝萊斯芽孢桿菌淀粉酶定點(diǎn)突變后其穩(wěn)定性有所增加，但在70 ℃條件下保溫30 min時(shí)活性僅殘余20%左右[15]。地衣芽孢桿菌淀粉酶耐熱突變后，最適反應(yīng)溫度提高了10 ℃，但是適用溫度范圍較小，在60 ℃以下反應(yīng)僅能保持40%左右的活性[16]，針對(duì)不同工業(yè)的普適性應(yīng)用仍舊有一定的局限。地衣芽孢桿菌淀粉酶經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)后酶活提高到7.9 U/mL[17]，仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足工業(yè)生產(chǎn)對(duì)高活性淀粉酶的需求。

本研究從醬香型高溫大曲中對(duì)芽孢桿菌進(jìn)行分離篩選，結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)觀察以及16S rDNA序列測(cè)定對(duì)菌株種屬來(lái)源進(jìn)行鑒定，并以淀粉酶活力作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，針對(duì)高溫馴化前后菌株所產(chǎn)淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行探討，以研究高溫馴化對(duì)菌株生長(zhǎng)及其所產(chǎn)淀粉酶酶活的影響以及其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用潛能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

醬香型白酒大曲樣品：貴州省仁懷市茅臺(tái)鎮(zhèn)某酒廠。

1.1.2 試劑

酵母提取物、胰蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物、PCR預(yù)混液：生工生物工程（上海）股份有限公司；氯化鈉、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、亞硫酸氫鈉、苯酚、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基[18]：酵母浸粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L、瓊脂20 g/L、可溶性淀粉20 g/L，121 ℃滅菌20 min。

液體培養(yǎng)基[18]：酵母浸粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9402型恒溫培養(yǎng)箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；BSD-YX3200型立式智能精密搖床：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；JNOEC XS-212-202型電子顯微鏡：上海圓派科學(xué)儀器有限公司；FA2004N型電子天平：上海菁海儀器有限公司；UV-5100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海棱光技術(shù)有限公司；SIGMA-1-14型低溫離心機(jī)：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；S1000TM型PCR擴(kuò)增儀：美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的富集與分離[18]

稱取1 g醬香型白酒大曲樣品，加入10 mL生理鹽水混勻，置于80 ℃恒溫水浴鍋中水浴10 min，每隔2 min振蕩混勻。水浴結(jié)束后取上清液用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋。分別選取10-5、10-6、10-7、10-8濃度，以四區(qū)劃線法接種至固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h。使用盧戈氏碘液染色后觀察篩選平板上單菌落的透明水解圈，并比較透明圈直徑（D）和菌落直徑（d）的比值（D/d），挑取比值大的菌落進(jìn)行復(fù)篩。

1.3.2 產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的復(fù)篩

將挑取的菌落接種于液體培養(yǎng)基，30 ℃條件下培養(yǎng)16 h制備種子液。將種子液稀釋至OD600nm值為0.6，按照2%（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基搖瓶中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)。在不同時(shí)間點(diǎn)取樣，12 000 r/min離心收集發(fā)酵上清液。測(cè)定發(fā)酵上清液中淀粉酶的活力，篩選淀粉酶活性高的菌株。

1.3.3 淀粉酶活力測(cè)定

采用3,5-二硝基水楊酸比色法[19]測(cè)淀粉酶活性。酶活單位定義：1 mL粗酶液在40 ℃條件下，1 min水解淀粉生成1 μg葡萄糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位，U。

1.3.4 菌株的形態(tài)觀察及分子生物學(xué)鑒定

將菌株接種至固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24 h后挑取單菌落至液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)16 h后進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)特征。

采用苯酚氯仿抽提法[20]對(duì)目標(biāo)菌株的基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）進(jìn)行提取。并以此DNA為模板，以通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進(jìn)行16S rDNA的擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：DNA模板0.5 μL，27F和1492R各2 μL，PCR預(yù)混液補(bǔ)足50 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）采用基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進(jìn)行同源性比對(duì)，比對(duì)結(jié)果使用MEGA 11.0生物學(xué)軟件進(jìn)行比對(duì)分析，并利用鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[21-22]，確定菌株的種屬。

1.3.5 芽孢桿菌的高溫馴化

將篩選得到的菌株在30 ℃條件下振蕩培養(yǎng)16 h后，以2%（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基，分別于30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、24 h時(shí)測(cè)定菌液在波長(zhǎng)600 nm處的吸光度值（OD600nm值）、酶活力，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定3次，繪制芽孢桿菌在不同溫度條件下的生長(zhǎng)曲線和所產(chǎn)淀粉酶的酶活力曲線，并確定馴化點(diǎn)溫度。

以馴化點(diǎn)溫度將菌株培養(yǎng)至OD600nm值達(dá)到0.6時(shí)，以2%（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接入高于馴化點(diǎn)2.5 ℃的搖瓶?jī)?nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD600nm值達(dá)到0.6時(shí)再以2%（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接入高于馴化點(diǎn)5 ℃的搖瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、24 h時(shí)測(cè)定菌液在波長(zhǎng)600 nm處的吸光度值、酶活力，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定3次，繪制芽孢桿菌在不同溫度條件下的生長(zhǎng)曲線和所產(chǎn)淀粉酶的酶活力曲線。

1.3.6 淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)[15-16]

pH對(duì)淀粉酶活力的影響：將底物用不同pH值（1、2、3、4、5、6、7、8、9）的緩沖液溶解，測(cè)定淀粉酶活力，考察pH對(duì)淀粉酶活力的影響，以最高酶活設(shè)為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。

淀粉酶的pH穩(wěn)定性：將酶液用最適pH值緩沖液稀釋后，在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣，然后在最適反應(yīng)pH條件下測(cè)殘余酶活。

溫度對(duì)淀粉酶活力的影響：按照酶活力測(cè)定的方法，分別在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃條件下測(cè)淀粉酶的活力，考察溫度對(duì)淀粉酶活力的影響。

淀粉酶的溫度穩(wěn)定性：將酶液在最適溫度條件下保溫，在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣，然后在最適反應(yīng)溫度條件下測(cè)殘余酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的篩選

以菌落的透明水解圈為依據(jù)進(jìn)行初篩，從醬香型白酒大曲中分離得到純培養(yǎng)菌株350株，其中產(chǎn)淀粉酶水解透明圈的菌株12株，菌落直徑及透明圈直徑比值見(jiàn)表1。由表1可知，5號(hào)菌株、10號(hào)菌株和11號(hào)菌株的D/d值最高，且5號(hào)＞10號(hào)＞11號(hào)，因此選擇這3株均進(jìn)行復(fù)篩。

表1 篩選產(chǎn)淀粉酶菌株的透明水解圈及菌落直徑比值Table 1 Ratio of transparent hydrolytic circle and colony diameter of screened amylase-producing strains

對(duì)5號(hào)、10號(hào)、11號(hào)菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，并分別對(duì)其所產(chǎn)淀粉酶進(jìn)行活性測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，5號(hào)菌株產(chǎn)酶酶活在前6 h上升較為平緩，在6～10 h顯著上升，10～12 h變化不大，均處于較高水平，在10 h時(shí)具有最高酶活332.4 U/mL，12 h后活性有較為明顯的下降，24 h時(shí)降至最高酶活的21%。10號(hào)菌株酶活變化情況與5號(hào)菌株相似，在培養(yǎng)10 h時(shí)達(dá)到最高酶活252.4 U/mL。11號(hào)菌株活性總體較低，在12 h處達(dá)到最高酶活114.0 U/mL，之后活性快速下降。3個(gè)菌株的淀粉酶活力存在較為明顯的差異，其活性排列順序和D/d值保持一致，選擇5號(hào)菌株為目標(biāo)菌株進(jìn)行后續(xù)研究，并命名為菌株AmyZ5。不同的菌株具有各異的遺傳特性，從而表現(xiàn)出不同的生物活性特征，也正是由于這些催化風(fēng)格各異的微生物種群之間的微妙平衡和相互結(jié)合，才呈現(xiàn)出了各具特色的釀造工藝及風(fēng)格迥異的白酒產(chǎn)品[23]。

圖1 篩選菌株產(chǎn)淀粉酶活性對(duì)比Fig.1 Comparison of amylase activities produced by screened stains

2.2 菌株AmyZ5的種屬鑒定

2.2.1 菌株AmyZ5的形態(tài)特征

菌株AmyZ5在固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征和革蘭氏染色后細(xì)胞的形態(tài)特征見(jiàn)圖2。由圖2A可知，菌株AmyZ5在固體培養(yǎng)基上的菌落呈現(xiàn)淡黃色不透明狀態(tài)，邊緣無(wú)規(guī)則不平滑，菌落內(nèi)部濕潤(rùn)且不易被挑起。由圖2B可知，菌株AmyZ5的細(xì)胞形態(tài)為桿狀，單細(xì)胞，或多細(xì)胞首尾相連呈鏈狀排列，可形成橢圓形的芽孢。根據(jù)菌株AmyZ5的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)，初步判定菌株AmyZ5為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。

圖2 菌株AmyZ5的菌落（A）和細(xì)胞（B）形態(tài)特征Fig.2 Colony (A) and cell (B) morphological characteristics of strain AmyZ5

2.2.2 菌株AmyZ5的分子生物學(xué)鑒定

對(duì)擴(kuò)增得到的16S rDNA序列測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株AmyZ5與貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）XC1的16S rDNA具有最高的序列同源性。利用MEGA 11.0[21]生物學(xué)軟件分析菌株AmyZ5和相關(guān)菌株的16S rDNA基因，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 基于16S rDNA基因序列菌株AmyZ5的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of strain AmyZ5 based on 16S rDNA gene sequence

由圖3可知，菌株AmyZ5與Bacillus velezensis同屬一個(gè)分支，綜合菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)和分子生物學(xué)結(jié)果，鑒定菌株AmyZ5為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。

2.3 菌株AmyZ5的高溫馴化

2.3.1 菌株AmyZ5在不同溫度下的生長(zhǎng)情況及酶活力變化

醬香型白酒高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵的生產(chǎn)工藝對(duì)菌株的生長(zhǎng)代謝有較大的影響[24]。由圖4A可知，菌株AmyZ5在30～45 ℃條件下均能夠生長(zhǎng)，但在45 ℃條件下生長(zhǎng)量具有較為明顯的下降，30 ℃條件下培養(yǎng)15 h菌液OD600nm值是45 ℃時(shí)的1.4倍。由圖4B可知，雖然菌株AmyZ5能夠在較高溫度條件下保持生長(zhǎng)，但其所產(chǎn)淀粉酶活性則隨溫度的升高而持續(xù)降低。不同培養(yǎng)溫度下，淀粉酶最高活性均出現(xiàn)在培養(yǎng)15 h時(shí)，但45 ℃時(shí)菌株AmyZ5所產(chǎn)淀粉酶活性約為30 ℃時(shí)的1/3。芽孢桿菌相比較其他菌種而言，因其較高的耐溫性，是高溫大曲中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。雖然芽孢桿菌能夠在較高的溫度下存活，但其生物活性相較于最適生長(zhǎng)溫度來(lái)說(shuō)，會(huì)被高溫環(huán)境所抑制，這對(duì)于發(fā)酵原料的利用及白酒風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生有著嚴(yán)重的影響。

圖4 不同溫度條件下菌株AmyZ5的生長(zhǎng)情況（A）及淀粉酶活（B）Fig.4 Growth (A) and amylase activities (B) of strain AmyZ5 under different temperature conditions

2.3.2 菌株AmyZ5高溫馴化后的生長(zhǎng)情況及酶活力變化

為提高菌株AmyZ5在45 ℃時(shí)的生長(zhǎng)活力，對(duì)其進(jìn)行高溫馴化。培養(yǎng)環(huán)境溫度的急劇改變，不利于菌種對(duì)于環(huán)境的適應(yīng)，從而延長(zhǎng)適應(yīng)期并可能導(dǎo)致菌種生長(zhǎng)量的降低。因此采用梯度升溫的方式對(duì)菌株AmyZ5進(jìn)行馴化，將馴化后的菌株命名為HTAmyZ5。

由圖5A可知，經(jīng)過(guò)馴化，菌株HTAmyZ5在45 ℃條件下培養(yǎng)24 h的OD600nm值是馴化前培養(yǎng)24 h的OD600nm值的1.3倍，更為顯著的是對(duì)于高溫環(huán)境適應(yīng)的時(shí)間大大縮短。馴化前菌株AmyZ5在前9 h時(shí)生長(zhǎng)十分緩慢，而高溫馴化后3 h時(shí)OD600nm值是馴化前培養(yǎng)3 h時(shí)OD600nm值的4.2倍。不僅僅是生長(zhǎng)量有了明顯的提高，馴化后菌株HTAmyZ5所產(chǎn)淀粉酶的酶活也得到了顯著的提高。由圖5B可知，馴化后菌株HTAmyZ5所產(chǎn)淀粉酶在9 h時(shí)出現(xiàn)最大酶活196.1 U/mL，在12 h時(shí)酶活仍保持在97%，在24 h時(shí)酶活存留約70%左右。高溫馴化后，最高淀粉酶活性（培養(yǎng)10 h時(shí)）是馴化前（培養(yǎng)15 h時(shí)）的1.9倍。較短的適應(yīng)期以及較高的生長(zhǎng)量和淀粉酶活性，不僅能夠提高釀酒原料的利用和轉(zhuǎn)化，還可以大大縮短釀造所用的時(shí)間，對(duì)于白酒發(fā)酵生產(chǎn)具有著積極的意義。

圖5 高溫馴化前后菌株AmyZ5的生長(zhǎng)情況（A）及淀粉酶活（B）對(duì)比Fig.5 Comparison of growth (A) and amylase enzyme activities (B) of strain AmyZ5 before and after high temperature acclimation

2.4 菌株AmyZ5和HTAmyZ5產(chǎn)淀粉酶粗酶液的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.4.1 菌株AmyZ5和HTAmyZ5產(chǎn)淀粉酶粗酶液的最適反應(yīng)條件

在醬香型白酒發(fā)酵工藝中，高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵是獨(dú)特工藝點(diǎn)及關(guān)鍵控制點(diǎn)[25]。而溫度、pH等環(huán)境因素對(duì)于酶的催化性質(zhì)也起著決定性的影響[26-27]。由圖6A可知，馴化后所產(chǎn)淀粉酶活性的最適反應(yīng)溫度從40 ℃提高至70 ℃，這對(duì)于醬香型白酒“三高”發(fā)酵工藝中原料的生物轉(zhuǎn)化有著十分有利的作用；同時(shí)，在20～90 ℃反應(yīng)溫度之間，相比較菌株AmyZ5所產(chǎn)淀粉酶活性迅速變化的情況而言，菌株HTAmyZ5所產(chǎn)淀粉酶活性均能保持在最高酶活的60%以上，這也為菌株HTAmyZ5淀粉酶提供了可觀的工業(yè)應(yīng)用前景[14，28]。由圖6B可知，高溫馴化并沒(méi)有改變?cè)撠惾R斯芽孢桿菌淀粉酶的最適反應(yīng)pH，在馴化前后均為pH 3。但菌株HTAmyZ5所產(chǎn)淀粉酶在pH 1～9時(shí)活性變化較小，在pH 1～7時(shí)活性能夠保持在60%以上，在pH9時(shí)仍能保持在40%左右。與菌株AmyZ5僅在pH 2～5范圍內(nèi)保持60%以上活性相比，菌株HTAmyZ5在反應(yīng)溫度及pH值的適用范圍更為廣泛，具有巨大的實(shí)際應(yīng)用潛能。在最適反應(yīng)條件下，菌株HTAmyZ5所產(chǎn)淀粉酶活性達(dá)到322.1 U/mL，為45 ℃培養(yǎng)條件時(shí)菌株AmyZ5所產(chǎn)淀粉酶活性的3.1倍。有文獻(xiàn)報(bào)道稱，不同的培養(yǎng)溫度對(duì)芽孢桿菌分泌淀粉酶的活性有明顯影響[29]。菌株HTAmyZ5經(jīng)過(guò)耐高溫馴化后，可能由于逐漸升高的培養(yǎng)溫度誘導(dǎo)菌株分泌的淀粉酶中耐高溫淀粉酶所占比例增加，從而體現(xiàn)為所產(chǎn)淀粉酶的反應(yīng)溫度有所提高。后續(xù)會(huì)對(duì)淀粉酶進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，并調(diào)取基因組中相關(guān)基因進(jìn)行異源表達(dá)，以研究馴化后淀粉酶最適反應(yīng)溫度發(fā)生改變的相關(guān)機(jī)理。

圖6 菌株AmyZ5和HTAmyZ5產(chǎn)淀粉酶粗酶液的最適反應(yīng)溫度（A）及pH（B）Fig.6 Optimum reaction temperature (A) and pH (B）of crude enzyme solution of amylase produced by strains AmyZ5 and HTAmyZ5

2.4.2 菌株AmyZ5/HTAmyZ5產(chǎn)淀粉酶粗酶液的穩(wěn)定性分析

淀粉酶在最適反應(yīng)溫度及pH條件下的穩(wěn)定性也決定著其在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)當(dāng)中的應(yīng)用效果。由圖7A可知，高溫馴化對(duì)淀粉酶在其最適反應(yīng)溫度條件下的穩(wěn)定性有著較小幅度的降低，2 h時(shí)菌株HTAmyZ5淀粉酶酶活殘余22.2%，相比較菌株AmyZ5淀粉酶的殘余酶活下降了36%。持續(xù)較高的溫度對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象有較大的影響[30]，這可能是引起菌株HTAmyZ5淀粉酶溫度穩(wěn)定性發(fā)生一定下降的原因。而pH穩(wěn)定性的變化要復(fù)雜一些。由圖7B可知，在較短的反應(yīng)時(shí)間（0.5 h）內(nèi)，菌株HTAmyZ5的pH穩(wěn)定性相比菌株AmyZ5要高；處于較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間時(shí)，菌株HTAmyZ5的pH穩(wěn)定性則有所降低，但在2 h時(shí)兩者的殘余酶活十分接近。結(jié)合溫度穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性分析，高溫馴化對(duì)于貝萊斯芽孢桿菌淀粉酶的穩(wěn)定性沒(méi)有產(chǎn)生顯著改變。

圖7 菌株AmyZ5和HTAmyZ5所產(chǎn)淀粉酶粗酶液的溫度（A）及pH（B）穩(wěn)定性Fig.7 Temperature (A) and pH (B) stability of crude enzyme solution of amylase produced by strains AmyZ5 and HTAmyZ5

3 結(jié)論

本研究首先利用透明圈法從醬香型高溫大曲中分離篩選到一株產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察以及分子生物學(xué)鑒定，確定該菌株為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），命名為AmyZ5。對(duì)其生長(zhǎng)環(huán)境溫度耐受性進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，菌株AmyZ5在30 ℃時(shí)具有較高的生長(zhǎng)量；所產(chǎn)淀粉酶最適反應(yīng)溫度為40 ℃，最適反應(yīng)pH為3。對(duì)AmyZ5菌株進(jìn)行高溫馴化，馴化后菌株HTAmyZ5能夠在45 ℃環(huán)境下具有較高的生長(zhǎng)量，同時(shí)大大縮短菌種在高溫環(huán)境的適應(yīng)期，培養(yǎng)3 h時(shí)OD600nm值比菌株AmyZ5提高了4.2倍；其所產(chǎn)淀粉酶最適反應(yīng)溫度提高到70 ℃，在20～90 ℃范圍內(nèi)活性能夠保持在60%以上；最適反應(yīng)pH仍為3，在pH 1～7范圍內(nèi)活性能夠保持在60%以上，在pH 9時(shí)仍保留有40%的活性；最高酶活提高了3.1倍，達(dá)到322.1 U/mL；穩(wěn)定性受到高溫培養(yǎng)環(huán)境的影響有小幅度的降低，但變化并不顯著。本試驗(yàn)馴化得到的芽孢桿菌在較高溫度環(huán)境下能夠持續(xù)生長(zhǎng)并分泌較高活性的淀粉酶，對(duì)醬香型白酒發(fā)酵高溫生產(chǎn)工藝具有較好的適用潛力及潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)為該菌株在白酒發(fā)酵乃至酒糟降解等工業(yè)應(yīng)用方面奠定了一定的科學(xué)依據(jù)及理論基礎(chǔ)。后續(xù)將針對(duì)該菌種的傳代穩(wěn)定性、所產(chǎn)淀粉酶的基因工程菌異源表達(dá)以及淀粉酶結(jié)構(gòu)改造進(jìn)行更深入的研究。