六妹羊肚菌原生質(zhì)體單核化再生菌株的雜交分析

劉 彬，周伏忠*，刁文濤，陳曉飛，郭 恒，寧 萌

（河南省科學(xué)院 生物研究所有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450008）

羊肚菌（Morchella sextelata）隸屬于子囊菌亞門(mén)（Ascomycota）、盤(pán)菌綱（Discomycetes）、盤(pán)菌目（Pezizales）、羊肚菌科（Morchellaceae）、羊肚菌屬（Morchella）[1-3]，是世界四大珍貴食用菌之一。羊肚菌富含氨基酸、多糖、礦質(zhì)元素等多種營(yíng)養(yǎng)成分，而且具有增強(qiáng)免疫力、抗菌、抗腫瘤、保護(hù)心血管等功效[4-5]。目前我國(guó)羊肚菌栽培面積已超過(guò)8 000 hm2且仍在不斷增加，然而每年仍有50%～70%的種植者無(wú)法穩(wěn)定盈利、重返貧困或負(fù)債[6-7]。其中，羊肚菌菌種易老化退化（如交配型丟失、線粒體功能衰退等）、產(chǎn)量不穩(wěn)定等成為制約我國(guó)羊肚菌產(chǎn)業(yè)健康穩(wěn)定發(fā)展的關(guān)鍵因素[8-10]。

羊肚菌菌絲細(xì)胞是一種異宗結(jié)合的多核菌絲體，每個(gè)細(xì)胞含有15～42個(gè)細(xì)胞核，每個(gè)細(xì)胞核含有一種交配型，其子囊孢子也為多核，每個(gè)孢子含有18～32個(gè)細(xì)胞核[11-13]，這些情況十分不利于羊肚菌遺傳育種工作的開(kāi)展。原生質(zhì)體單核化技術(shù)在大球蓋菇（Stropharia rugoso-annulata）[14]、香菇（Lentinus edodes）[15-17]、斑玉蕈（Hypsizygus marmoreus）[18]、真姬菇[19]、阿魏菇[20]、平菇[21]、靈芝[22]、玉木耳[23]等擔(dān)子菌的單交配型菌株的分離和遺傳育種研究中得到廣泛應(yīng)用并取得良好效果；而子囊菌類食藥用菌的原生質(zhì)體單核化菌株的分離和雜交育種研究報(bào)道較少，如蛹蟲(chóng)草（Cordyceps militaris）[24]、梯棱羊肚菌（Morchella importuna）[25-26]等；LIU W等[25]利用原生質(zhì)體單細(xì)胞技術(shù)分離到梯棱羊肚菌的單交配型同核體，賀國(guó)強(qiáng)[26]利用梯棱羊肚菌的單交配型子囊孢子進(jìn)行雜交試驗(yàn)成功得到雜交菌株，目前還沒(méi)有看到利用原生質(zhì)體單核化再生菌株進(jìn)行六妹羊肚菌雜交育種的研究報(bào)道。

本研究在對(duì)六妹羊肚菌（Morchella sextelata）原生質(zhì)體單核化再生菌株的分離、交配型鑒定的基礎(chǔ)上，對(duì)單交配型再生菌株進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)雜交實(shí)驗(yàn)制備雜交菌株，以菌株生長(zhǎng)勢(shì)、抗鞣酸能力和菌核產(chǎn)生能力為技術(shù)指標(biāo)，對(duì)單核化再生菌株及雜交菌株的多態(tài)性進(jìn)行分析，并對(duì)雜交菌株的交配型進(jìn)行檢測(cè)，以期探索六妹羊肚菌原生質(zhì)體再生菌株雜交的科學(xué)性和可行性，為六妹羊肚菌的雜交育種工作提供新技術(shù)路線。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與引物

70株單交配型六妹羊肚菌：河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)原生質(zhì)體單核化技術(shù)分離保存的單交配型菌株[27]，其中部分菌株為紫外線（ultraviolet，UV）（編號(hào)帶“UV”的菌株）或亞硝基胍（nitrosoguanidine，NTG）（編號(hào)帶“5G”的菌株）誘變和原生質(zhì)體單核化分離獲得的。交配型基因的上游引物（P6-1F、P8-4F）及下游引物（P6-1R、P8-4R）參照賀國(guó)強(qiáng)[26]的序列：由華大基因公司提供合成服務(wù)。其中引物對(duì)（P6-1F/P6-1R）用于檢測(cè)交配型MAT1-2-1基因，引物對(duì)（P8-4F/P8-4R）擴(kuò)增交配型MAT1-1-1基因。

1.1.2 試劑

葡萄糖、硝酸鈉、胰蛋白胨、酵母提取物（粉）、瓊脂糖、鞣酸、乙醇、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、乙酸鋰（均為分析純或生化試劑）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；電泳緩沖液、GenSTAR Stain RED核酸染料：北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司；2×ESTaqMaster Mix試劑盒：北京天根生化科技有限公司；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker：上海萊楓生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

完全酵母提取物培養(yǎng)基（complete yeast extract medium，CYM）：葡萄糖2%、蛋白胨0.2%、酵母粉0.1%、硫酸鎂0.05%、磷酸二氫鉀0.046%、磷酸氫二鉀0.1%、瓊脂1.5%，蒸餾水配制，pH值自然。

土豆汁葡萄糖瓊脂（potato juice dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：將200 g土豆切片并煮沸10 min，3～4層紗布過(guò)濾；取濾液加入葡萄糖2%，瓊脂1.5%，蒸餾水定容至1 L，pH值自然。

PDA（鞣酸）培養(yǎng)基：在PDA培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加4 mmol/L鞣酸。

基本培養(yǎng)基（minimal medium，MM）：葡萄糖2%、硝酸鈉0.4%、磷酸二氫鉀0.1%、七水硫酸鎂0.05%、氯化鉀0.05%、碳酸鈣0.01%、硫酸亞鐵0.001%、硫酸鋅0.001%、硫酸銅0.001%、瓊脂1.5%，蒸餾水配制，pH值自然。

上述四種培養(yǎng)基均采用121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D型雙人凈化工作臺(tái)：上海滬凈凈化設(shè)備有限公司；TCYQ型全溫?fù)u瓶柜：太倉(cāng)市豪誠(chéng)公司；DDY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠；ChemiDocTMXRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)BIO-RAD公司；MIKRO 22R離心機(jī)：德國(guó)Hettich公司；Tpersonal聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：法國(guó)Biometra公司。

1.3 方法

1.3.1 原生質(zhì)體單交配型再生菌株的多態(tài)性分析

選取實(shí)驗(yàn)室保藏的35株六妹羊肚菌MAT1-1-1交配型原生質(zhì)體再生菌株和35株六妹羊肚菌MAT1-2-1交配型原生質(zhì)體再生菌株進(jìn)行生長(zhǎng)勢(shì)、抗鞣酸能力及菌核產(chǎn)生能力測(cè)定，目的是為后續(xù)雜交實(shí)驗(yàn)提供菌株材料和分析數(shù)據(jù)。

1.3.2 原生質(zhì)體單交配型再生菌株的對(duì)峙培養(yǎng)雜交

對(duì)六妹羊肚菌原生質(zhì)體單交配型再生菌株進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)雜交，參照賀國(guó)強(qiáng)[26]的方法并有所修改：將單交配型斜面菌株轉(zhuǎn)接至PDA平板上23 ℃培養(yǎng)3～4 d后，用直徑10 mm無(wú)菌打孔器轉(zhuǎn)接1塊圓形菌絲塊至新PDA平板上進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)，菌絲塊之間距離約2.5 cm，23 ℃培養(yǎng)3～4 d；然后挑取兩個(gè)菌絲塊中間的菌絲（約2～3 mm2）至MM平板上培養(yǎng)3～4 d；再挑取菌落尖端幼嫩菌絲至新MM上，連續(xù)挑取3次；將第3次的菌落尖端菌絲轉(zhuǎn)接至CYM斜面上，23 ℃培養(yǎng)13～15 d，低溫保藏。

1.3.3 原生質(zhì)體雜交菌株的多態(tài)性分析

對(duì)雜交菌株進(jìn)行多態(tài)性分析，對(duì)其生長(zhǎng)勢(shì)、抗鞣酸能力及菌核產(chǎn)生能力進(jìn)行測(cè)定。

（1）生長(zhǎng)勢(shì)的測(cè)定

將實(shí)驗(yàn)菌株轉(zhuǎn)接至PDA平板上，23 ℃培養(yǎng)3～4 d；然后用直徑10 mm打孔器移取一塊圓形菌絲塊至PDA（鞣酸）培養(yǎng)基平板上，每個(gè)平板等距離放置三個(gè)菌絲塊，23～24 ℃培養(yǎng)15～16 d。采用精度1 mm的鋼尺測(cè)量每株菌的菌絲帶寬度（mm）。菌絲帶寬度（mm）=（菌落直徑-10）/2。

（2）抗鞣酸能力的測(cè)定

抗鞣酸能力一定程度上反映菌株的漆酶活性[28]。本實(shí)驗(yàn)用褐變?nèi)χ睆椒从尘甑目棍匪崮芰?；用精? mm的鋼尺測(cè)量每株菌的褐變?nèi)χ睆剑╩m）。

（3）菌核產(chǎn)生能力的測(cè)定

菌核產(chǎn)生與否是羊肚菌菌絲生長(zhǎng)階段的一個(gè)重要指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)觀察并比較了每株菌在CYM斜面上的菌核數(shù)量，共分為五個(gè)級(jí)別，由少到多依次為：“0”表示看不見(jiàn)菌核，“+”表示可見(jiàn)少量菌核，“++”表示菌核數(shù)量一般，“+++”表示菌核較多，“++++”表示菌核很多或只有菌核。

1.3.4 雜交菌株生長(zhǎng)類型的測(cè)定

根據(jù)菌株在CYM斜面上的菌絲生長(zhǎng)和菌核產(chǎn)生情況，將雜交菌株大致劃分為菌核型（sclerotia，S）、菌絲型（hyphae，H）和混合型（mixture of sclerotia and hyphae，M）三種生長(zhǎng)類型：“菌核型（S）”表示斜面上有大量菌核產(chǎn)生或全部長(zhǎng)滿菌核的類型；“菌絲型（H）”表示斜面上看不見(jiàn)菌核或只有少量菌核的情況；“混合型（M）”則表示斜面上菌絲和菌核均有生長(zhǎng)、可見(jiàn)的中間類型。

1.3.5 雜交菌株的交配型測(cè)定

按照劉彬等[27]的方法測(cè)定雜交菌株的交配型，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果區(qū)分真雜交菌株或假雜交菌株。交配型電泳結(jié)果：“+”表示擴(kuò)增出條帶，“-”表示沒(méi)有擴(kuò)增出條帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體單交配型再生菌株的多態(tài)性分析結(jié)果

35株六妹羊肚菌MAT1-1-1交配型原生質(zhì)體再生菌株和35株MAT1-2-1交配型原生質(zhì)體再生菌株在PDA（鞣酸）平板上的多態(tài)性進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 六妹羊肚菌原生質(zhì)體單交配型再生菌株的多態(tài)性分析結(jié)果Table 1 Polymorphism analysis results of Morchella sextelata protoplast single mating type regeneration strains

由表1可知，褐變?nèi)χ睆脚c菌絲帶寬度二者之間呈正相關(guān)，褐變?nèi)χ睆皆酱?、菌絲帶寬度也較大；單交配型交配型菌株MAT1-1-1、交配型菌株MAT1-2-1的菌絲帶寬度均為0～10 mm，表明其生長(zhǎng)勢(shì)相近；菌株MAT1-1-1的褐變?nèi)χ睆綖?8～34 mm，菌株MAT1-2-1的褐變?nèi)χ睆綖?1～38 mm，而且單交配型菌株中褐變?nèi)χ睆健?2 mm的菌株有12株（占比17.14%），表明其抗鞣酸能力有明顯差異；不同菌株的菌核數(shù)量差異較大，產(chǎn)生塊狀聚合的菌核或分散狀態(tài)菌核或不產(chǎn)生菌核。結(jié)果表明，六妹羊肚菌不同原生質(zhì)體再生菌株的生長(zhǎng)勢(shì)、抗鞣酸能力之間有明顯差異和多態(tài)現(xiàn)象。這種單交配型原生質(zhì)體再生菌株之間的多態(tài)現(xiàn)象與香菇[17]、阿魏菇[20]、平菇[21]、靈芝[22]、玉木耳[23]等的原生質(zhì)體再生菌株的情況相類似。

在不同單交配型菌株多態(tài)性分析的基礎(chǔ)上，選取了20株MAT1-1-1單交配型原生質(zhì)體再生菌株（褐變?nèi)χ睆?5～34 mm、菌絲帶寬度2～10 mm、無(wú)菌核或產(chǎn)生菌核）和17株MAT1-2-1單交配型原生質(zhì)體再生菌株（褐變?nèi)χ睆?3～34 mm、菌絲帶寬度1～10 mm、無(wú)菌核或產(chǎn)生菌核）等表現(xiàn)較好的單交配型原生質(zhì)體再生菌株（表1中加粗的菌株）進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)。

2.2 雜交菌株的多態(tài)性分析結(jié)果

雜交菌株的多態(tài)性分析結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 六妹羊肚菌原生質(zhì)體單核化再生菌株的雜交結(jié)果Table 2 Hybridization results of Morchella sextelata protoplast monokaryotic regeneration strains

由表2可知，實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)雜交菌株的菌落尖端菌絲的3次連續(xù)轉(zhuǎn)接和菌株交配型測(cè)定，從63株“雜交”菌株中得到了40株具有雙交配型的雜交菌株，剔除了23株假雜交菌株（單交配型，數(shù)據(jù)略）；雜交成功率達(dá)63.5%。賀國(guó)強(qiáng)[26]通過(guò)對(duì)梯棱羊肚菌不同交配型的子囊孢子進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)雜交，獲得1株雜交菌株；賀新生等[29]研究指出，羊肚菌同一單孢菌株的菌絲是自體融合的，子囊孢子的單孢菌株中存在交配型分離、假同宗結(jié)合“異核體”和大量營(yíng)養(yǎng)體不親和的現(xiàn)象。本研究使用六妹羊肚菌同一母本（雙交配型）的原生質(zhì)體單核化再生菌株進(jìn)行多態(tài)性分析的過(guò)程中，雖然發(fā)現(xiàn)少數(shù)原生質(zhì)體再生菌株之間存在不親和拮抗現(xiàn)象，但大多數(shù)再生菌株之間是親和的；而且通過(guò)對(duì)峙培養(yǎng)雜交和尖端菌絲的連續(xù)轉(zhuǎn)接，獲得了高比例的雜交菌株。后續(xù)擬采取更精準(zhǔn)的方法如核熒光標(biāo)記[34]等技術(shù)對(duì)這些雜交菌株作進(jìn)一步鑒別。

由表2亦可知，雜交菌株在PDA（鞣酸）平板上的生長(zhǎng)勢(shì)、抗鞣酸能力以及在CYM斜面上菌核數(shù)量方面存在明顯差異，雜交菌株的菌絲帶寬度均≥10 mm，褐變?nèi)χ睆綖?2～54mm，而單交配型親本菌株的菌絲帶寬度均≤10mm，因此雜交菌株在生長(zhǎng)勢(shì)、抗逆能力等方面均顯著優(yōu)于單交配型親本菌株，異核體雜交優(yōu)勢(shì)明顯。原因可能是由于羊肚菌菌絲生長(zhǎng)迅速，菌株生長(zhǎng)速度可達(dá)8.0～19.5 mm/d[27]，但在常規(guī)培養(yǎng)條件下不易發(fā)現(xiàn)單交配型和雙交配型雜交菌株之間的差異性，而本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在培養(yǎng)基中添加鞣酸大幅度降低了六妹羊肚菌菌絲的生長(zhǎng)勢(shì)（菌株生長(zhǎng)速度均≤2.0 mm/d）、增加了菌絲致密度，加上菌絲塊間的營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)，使得單交配型菌株和雙交配型雜交菌株之間的差異性和雜交優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)得更充分、更明顯和易于觀察到。

雜交菌株的產(chǎn)菌核能力有明顯差異，雜交菌株、單交配型親本菌株都能產(chǎn)菌核或不產(chǎn)菌核，產(chǎn)菌核能力與菌株交配型沒(méi)有相關(guān)性，該結(jié)果與蔣林林等[31]在減數(shù)分裂后代中發(fā)現(xiàn)的情況和看法相一致；根據(jù)40株六妹羊肚菌雜交菌株在斜面培養(yǎng)基上的菌絲和菌核的豐度差異，可以將其分為菌核型、菌絲型和混合型三種生長(zhǎng)類型。

2.3 雜交菌株的交配型測(cè)定結(jié)果

由以上結(jié)果可知，從63株“雜交”菌株中得到了40株具有雙交配型的雜交菌株及23個(gè)單交配型雜交菌株，部分雜交菌株的交配型電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，UV101×UV57雜交菌株只有一條擴(kuò)增帶，因此進(jìn)行剔除（數(shù)據(jù)略），其他雜交菌株有兩條擴(kuò)增帶，為真雜交菌株，由此可知，六妹羊肚菌原生質(zhì)體單核化再生菌株的雜交成功率較高。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，直接挑取PDA（鞣酸）平板上的菌絲體進(jìn)行交配型檢測(cè)，無(wú)法得到交配型基因的擴(kuò)增條帶；而將該菌絲體進(jìn)一步轉(zhuǎn)接到不含鞣酸的CYM斜面上培養(yǎng)則又可以重新檢測(cè)到交配型基因的擴(kuò)增條帶；可見(jiàn)羊肚菌交配型能否檢出或缺失問(wèn)題不僅與羊肚菌組織結(jié)構(gòu)[8]、菌核及繼代培養(yǎng)[30-31]、減數(shù)分裂及子囊孢子形成[32-33]等生命過(guò)程有關(guān)，還可能會(huì)受到菌絲生理狀態(tài)或生長(zhǎng)抑制物存在與否、細(xì)胞核是否降解[34]等因素的影響。

圖1 部分雜交菌株的交配型電泳結(jié)果Fig.1 Mating type electrophoresis results of some hybrid strains

3 結(jié)論

本研究對(duì)六妹羊肚菌原生質(zhì)體單核化再生菌株的多態(tài)性進(jìn)行了分析，對(duì)其進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)雜交實(shí)驗(yàn)制備雜交菌株。結(jié)果表明，不同原生質(zhì)體單核化再生菌株的生長(zhǎng)勢(shì)和抗鞣酸能力等存在差異和多態(tài)性；從63組對(duì)峙培養(yǎng)雜交實(shí)驗(yàn)中獲得40株雜交菌株（占全部雜交菌株的63.5%），雜交菌株（雙交配型）比單交配型親本菌株具有更強(qiáng)的生長(zhǎng)勢(shì)和抗鞣酸能力；根據(jù)六妹羊肚菌在斜面培養(yǎng)基上菌絲和菌核的差異，可以將雜交菌株分為菌核型、菌絲型和混合型三種生長(zhǎng)類型。本實(shí)驗(yàn)研究為六妹羊肚菌的原生質(zhì)體單核化菌株多態(tài)性分離和雜交育種進(jìn)行了有益探索。