巴彥淖爾酸粥細(xì)菌菌群多樣性分析及其與風(fēng)味的相關(guān)性

熊子康，張 青，鄒 銓，孔祥聰，馬佳佳，王玉榮*

（1.湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽(yáng) 441053；2.湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 乳酸菌生物技術(shù)與工程襄陽(yáng)市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 襄陽(yáng) 441053；3.河套學(xué)院 農(nóng)學(xué)系，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000）

酸粥一般以小米、大米或糜米等谷物為原料經(jīng)自然發(fā)酵制成的極具地方特色的谷物發(fā)酵制品，口感酸爽細(xì)膩，具有開(kāi)胃助消化的功效，在內(nèi)蒙古、廣西、山西和陜西等地較為常見(jiàn)[1-3]。谷物在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)改變自身原有的形態(tài)、風(fēng)味以及營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)，并產(chǎn)生氨基酸、維生素和有機(jī)酸等豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而使其更易于消化[4-6]。為保證其品質(zhì)及食用方便性，多地嘗試將其開(kāi)發(fā)成商業(yè)化產(chǎn)品，然而，目前酸粥的生產(chǎn)仍主要依賴于家庭作坊式制作[7]。該模式一般采用自然發(fā)酵，由于受到地域、氣候等的影響，不同地區(qū)生產(chǎn)的產(chǎn)品所包含的微生物多樣性不同[8]；此外，發(fā)酵過(guò)程使用的容器多不密封且不能人為控制溫度，發(fā)酵料液內(nèi)部微生物群亦需較長(zhǎng)時(shí)間才能達(dá)到平衡，增大了有害微生物侵襲的可能性[9]。巴彥淖爾或稱“巴盟”，屬內(nèi)蒙古自治區(qū)，該地區(qū)發(fā)酵酸粥所用原料一般為糜米，制作工藝主要為糜米加水蒸煮，在米粒完全煮透前取適量米湯放涼，置于桶內(nèi)或玻璃罐中，自然發(fā)酵24～30 h即可。每次將發(fā)酵好的酸粥預(yù)留一部分作為下一次發(fā)酵的“引子”，因而明確該地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵食品酸粥樣品中微生物資源構(gòu)成極其重要。

越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)識(shí)到微生物的多樣性與食品中各種風(fēng)味之間存在著重要聯(lián)系。自21世紀(jì)以來(lái)，以Illumina MiSeq為代表的第二代高通量測(cè)序技術(shù)因其準(zhǔn)確率高、通量高和速度快等優(yōu)點(diǎn)使其在食品微生物多樣性研究領(lǐng)域得以廣泛應(yīng)用[10-11]。電子鼻技術(shù)是一種用來(lái)檢測(cè)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的技術(shù)手段，具有實(shí)時(shí)、無(wú)損和快速等特點(diǎn)[12]。電子舌技術(shù)是一種用來(lái)檢測(cè)滋味的技術(shù)手段，具有客觀性強(qiáng)、檢測(cè)響應(yīng)快和標(biāo)準(zhǔn)化控制等特點(diǎn)[13]。向凡舒等[14]基于該技術(shù)解析了利川腌菜細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，并采用電子鼻技術(shù)研究腌菜的風(fēng)味品質(zhì)，結(jié)果表明，腌菜特征風(fēng)味物質(zhì)的形成可能由變形桿菌屬（Proteus）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）和腸球菌屬（Enterococcus）等多種微生物共同作用產(chǎn)生；CAI W C等[15]利用高通量測(cè)序技術(shù)和電子感官技術(shù)綜合評(píng)估了3種低溫大曲的微生物結(jié)構(gòu)、微生物功能和風(fēng)味特征，結(jié)果表明，低溫大曲中高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、鏈霉菌屬（Streptomyces）和乳桿菌屬（Lactobacillus）主要影響低溫大曲的滋味，而嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）和復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）主要影響其風(fēng)味。張青等[16]利用高通量測(cè)序技術(shù)研究了巴彥淖爾酸粥細(xì)菌構(gòu)成，發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬（Lactobacillus）和醋桿菌屬（Acetobacter）為其優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，表明該方法應(yīng)用于酸粥類谷物發(fā)酵食品可行且地域因素對(duì)同類型發(fā)酵食品微生物組成存在一定影響，因此有必要對(duì)巴彥淖爾酸粥品質(zhì)或微生物與產(chǎn)品品質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)性開(kāi)展深入研究。

本研究使用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)巴彥淖爾酸粥進(jìn)行細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)解析，同時(shí)結(jié)合電子鼻和電子舌仿生學(xué)技術(shù)對(duì)其氣味和滋味品質(zhì)進(jìn)行分析，并對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬與風(fēng)味品質(zhì)之間的相關(guān)性進(jìn)行研究，為酸粥菌株發(fā)掘和品質(zhì)提升提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸粥：于2021年6月中旬采集自內(nèi)蒙古自治區(qū)中西部巴彥淖爾市（E105°12′～109°53′，N40°13′～42°28′），共7份樣品，編號(hào)為BM1～BM7。

DNeasy mericon Food Kit 脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）基因組提取試劑盒：德國(guó)QIAGEN公司；引物338F/806R：由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成；5×TransStartTMFastPfu Buffer、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTPs）Mix和FastPfu Fly DNA聚合酶：北京全式金生物技術(shù)有限公司；參比溶液、陰離子溶液、陽(yáng)離子溶液和內(nèi)部溶液：日本Insent公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MiSeq PE300高通量測(cè)序平臺(tái)：美國(guó)Illumina公司；Nanodrop2000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：美國(guó)Nano Drop公司；Veriti FAST梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國(guó)ABI公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國(guó)ProteinSimple公司；PEN3電子鼻（配置10個(gè)金屬氧化傳感器）：德國(guó)Airsense公司；SA 402B電子舌：日本Insent公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 MiSeq高通量測(cè)序

將酸粥樣品振蕩均勻，使用DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒從酸粥樣品中提取細(xì)菌基因組DNA，并采用Nanodrop 2000紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)量其濃度和質(zhì)量，將條帶清晰且OD260nm/OD280nm值介于1.8～2.0之間的DNA進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)的PCR擴(kuò)增，其中正向引物為338F（5'-ACTCCTACGGGAGCAGCAG-3'），反向引物為806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'），參照WANG Y R等[17]的PCR擴(kuò)增體系及PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后使用1%的瓊脂糖凝膠電泳（120 V，30 min）進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)合格的擴(kuò)增產(chǎn)物寄送至上海美吉生物有限公司使用Illumina MiSeq測(cè)序儀完成雙末端測(cè)序。

1.3.2 生物信息學(xué)分析

根據(jù)GUO Z等[18]的序列質(zhì)控條件進(jìn)行質(zhì)控以獲得高質(zhì)量序列：根據(jù)雙端序列的重疊關(guān)系首先對(duì)下機(jī)序列進(jìn)行合并、去除嵌合體以及采用兩步UCLUST法構(gòu)建操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），通過(guò)Greengenes v13.5、核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)項(xiàng)目（ribosomal database project，RDP）v11.5和SILVA v132數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)每個(gè)OTU進(jìn)行同源性比對(duì)注釋和微生物多樣性解析[19]。

1.3.3 基于電子鼻技術(shù)對(duì)酸粥樣品氣味的測(cè)定

采用電子鼻對(duì)酸粥樣品的氣味進(jìn)行測(cè)定。將酸粥樣品搖勻，吸取15 mL樣品于電子鼻樣品瓶中，45 ℃水浴保溫30 min，于室溫靜置15 min后進(jìn)行測(cè)試，并重復(fù)3次。按照RUSINEK R等[20]的方法，選取49 s、50 s和51 s時(shí)的響應(yīng)值為數(shù)據(jù)點(diǎn)，并求其平均值為最終結(jié)果。其中，電子鼻配置的10個(gè)傳感器分別為W1C（芳香型化合物）、W5S（氮氧化合物）、W3C（芳香型化合物）、W6S（對(duì)氫氣有選擇性）、W5C（烷烴芳香成分）、W1S（甲烷）、W1W（有機(jī)硫化物和萜烯類）、W2S（乙醇）、W2W（有機(jī)硫化物）和W3S（烷烴類）。

1.3.4 基于電子舌技術(shù)對(duì)酸粥樣品滋味的測(cè)定

采用電子舌對(duì)酸粥樣品的滋味進(jìn)行測(cè)定。將酸粥樣品8 000 r/min 離心15 min后，取上清液于樣品瓶中，4 ℃?zhèn)溆谩０凑誈AO B H等[21]的方法對(duì)樣品中5個(gè)基本味（酸、苦、澀、咸、鮮）和3個(gè)回味（苦味、澀味和鮮味的回味）進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)測(cè)定4次，選取后3次有效數(shù)據(jù)并求取平均值作為最終結(jié)果。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 2017軟件對(duì)酸粥樣品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門、屬以及核心OTU的相對(duì)含量和電子鼻、電子舌雷達(dá)圖進(jìn)行分析，并對(duì)各樣品中OTU的出現(xiàn)次數(shù)進(jìn)行水平階梯圖的繪制；使用R軟件的“vioplot”安裝包對(duì)樣品中各滋味品質(zhì)的響應(yīng)值進(jìn)行小提琴圖繪制；使用Cytoscape軟件對(duì)酸粥中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬與各氣味、滋味指標(biāo)之間相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值＞0.5的相關(guān)性進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸粥樣品的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析

以細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)為測(cè)序靶點(diǎn)，通過(guò)Illumina MiSeq高通量測(cè)序后7份酸粥樣品共產(chǎn)生了265 424條高質(zhì)量序列，經(jīng)兩步UCLUST分析，共得到1 633個(gè)OTU，序列分別隸屬于3個(gè)門、5個(gè)綱、10個(gè)目、16個(gè)科和24個(gè)屬。將平均相對(duì)含量≥1.00%的細(xì)菌門或?qū)贇w為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門或?qū)?，相?duì)含量＜1.00%的細(xì)菌門或?qū)贇w為其他?；陂T水平的酸粥樣品中細(xì)菌菌群組成相對(duì)含量見(jiàn)圖1。

圖1 基于門水平的酸粥樣品中細(xì)菌菌群組成Fig.1 Bacterial community composition in sour porridge samples based on phylum level

由圖1可知，厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）為酸粥樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門，其平均相對(duì)含量分別為88.71%和9.97%，且各樣品中Firmicutes的相對(duì)含量均＞70.00%，其中，樣品BM3、BM4、BM6和BM7中Firmicutes的相對(duì)含量較高，分別為95.79%、96.55%、99.65%和99.07%；不同樣品中Proteobacteria的相對(duì)含量有一定差異，其在樣品BM4、BM6和BM7中其相對(duì)含量均＜1.00%，由此可見(jiàn)，不同樣品間細(xì)菌門組成存在一定的差異。本研究進(jìn)一步在屬水平上對(duì)其細(xì)菌菌群組成進(jìn)行解析，基于屬水平的酸粥樣品中細(xì)菌菌群的相對(duì)含量見(jiàn)圖2。

圖2 基于屬水平的酸粥樣品中細(xì)菌菌群組成Fig.2 Bacterial community composition in sour porridge samples based on genus level

由圖2可知，乳桿菌屬（Lactobacillus）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）和魏斯氏菌屬（Weissella）為酸粥樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，其平均相對(duì)含量分別為85.45%、9.81%和1.60%，且所有樣品中Acetobacter和Weissella的相對(duì)含量均存在明顯差異。在樣品BM1、BM2和BM5中Acetobacter的相對(duì)含量均＞15.0%，而在樣品BM4、BM6和BM7中相對(duì)含量均＜1.0%；Weissella僅存在于樣品BM7中，其相對(duì)含量為11.19%。由此可見(jiàn)，同一地區(qū)不同酸粥樣品間其細(xì)菌屬組成亦存在一定的差異。Lactobacillus和Weissella均為乳酸菌屬，隸屬于厚壁菌門，可在密閉條件下快速生長(zhǎng)繁殖，生成大量乳酸，在形成酸性無(wú)氧環(huán)境后，隨著好氧菌的死亡，進(jìn)一步將碳水化合物轉(zhuǎn)化成乳酸、乙酸和丙酸等，以改善食品的風(fēng)味并延長(zhǎng)其保質(zhì)期[22]；此外，Weissella是兼性厭氧化學(xué)螯合菌，在食品發(fā)酵過(guò)程中，其可以合成酯類、有機(jī)酸和短鏈脂肪酸等風(fēng)味物質(zhì)，從而提高發(fā)酵食品的產(chǎn)品質(zhì)量[23]。Acetobacter隸屬于Proteobacteria，可將乙醇和乳酸氧化為乙酸和乙酰丁酸[24]。說(shuō)明酸粥樣品中存在絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的產(chǎn)酸菌，該研究結(jié)果與張青等[16]所分析基于門、屬水平的酸粥樣品中細(xì)菌菌群的群落組成基本一致。

2.2 基于OTU水平的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

本研究在細(xì)菌門、屬水平解析酸粥樣品細(xì)菌菌群組成的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析7份酸粥樣品中OTU的出現(xiàn)次數(shù)及核心OTU（在所有樣品中均存在的OTU）的相對(duì)含量，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 酸粥樣品中操作分類單元的出現(xiàn)次數(shù)（A）及核心操作分類單元相對(duì)含量（B）Fig.3 Occurrence times of operational taxonomic unit (A) and relative content of core operational taxonomic unit (B) in sour porridge samples

由圖3A可知，7份樣品中共產(chǎn)生了1 633個(gè)OTU，然而核心OTU（OTU3082、OTU4824、OTU639、OTU1596、OTU281、OTU839和OTU895）僅有7個(gè)，占OTU總數(shù)的0.43%，但其中包含了63 755條高質(zhì)量序列，占質(zhì)控后合格序列總數(shù)的24.02%；在樣品中出現(xiàn)1次的OTU有822個(gè)，占OTU總數(shù)的50.34%，其中包含13 297 條高質(zhì)量序列，僅占質(zhì)控合格序列總數(shù)的5.01%。由圖3B可知，OTU3082、OTU4824、OTU639、OTU1596、OTU281、OTU839和OTU895平均相對(duì)含量分別為11.63%、6.63%、4.78%、0.83%、0.09%、0.04%和0.03%。而平均相對(duì)含量＞1.0%的核心OTU僅有3個(gè)，其中2個(gè)核心OTU隸屬于Lactobacillus，分別為OTU3082和OTU639；1個(gè)核心OTU隸屬于Acetobacter，為OTU4824。該結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明，在巴彥淖爾酸粥樣品中，Lactobacillus和Acetobacter為核心細(xì)菌屬。

2.3 酸粥樣品感官特性測(cè)定結(jié)果

2.3.1 基于電子鼻技術(shù)酸粥樣品的氣味檢測(cè)結(jié)果

本研究進(jìn)一步采用電子鼻測(cè)定酸粥樣品氣味，電子鼻響應(yīng)雷達(dá)圖見(jiàn)圖4。

圖4 酸粥樣品氣味電子鼻傳感器響應(yīng)雷達(dá)圖Fig.4 Response radar diagram of sour porridge samples ordor by electronic nose sensor

由圖4可知，納入本研究的酸粥樣品在不同傳感器上的響應(yīng)強(qiáng)度不同，僅有W1W（有機(jī)硫化物和萜烯類）、W5S（氮氧化合物）和W1S（甲烷）這3個(gè)傳感器對(duì)酸粥響應(yīng)強(qiáng)度較大，均＞19，而其他7個(gè)傳感器對(duì)酸粥響應(yīng)強(qiáng)度較小。其中W1W、W5S和W1S這3個(gè)傳感器對(duì)樣品BM7的響應(yīng)強(qiáng)度均為最大，分別為63.02、37.75和37.31；對(duì)樣品BM4的相應(yīng)強(qiáng)度均為最小，分別為40.27、19.63和24.03。為進(jìn)一步探究各樣本間的氣味的異同，本研究對(duì)各傳感器所測(cè)數(shù)值進(jìn)行處理，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 電子鼻各傳感器對(duì)酸粥樣品氣味的響應(yīng)強(qiáng)度Table 1 Response intensity of electronic nose sensors to the odor of sour porridge samples

由表1可知，巴彥淖爾酸粥在W1W、W5S和W1S這3個(gè)傳感器上的平均響應(yīng)值分別為51.43、27.63和29.14。由此可見(jiàn)，酸粥揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中有機(jī)硫化物和萜烯類物質(zhì)、氮氧化合物和甲烷的含量較為豐富。除W6S和W3S外，其他8個(gè)傳感器對(duì)酸粥樣品的響應(yīng)值差異均較大，變異系數(shù)均＞8.0%，由此可見(jiàn)，7份酸粥樣品在氣味方面存在較大差異。

2.3.2 基于電子舌技術(shù)對(duì)酸粥樣品滋味的檢測(cè)結(jié)果

酸粥樣品的電子舌檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5A可知，酸粥樣品在酸味、咸味、鮮味的回味和鮮味指標(biāo)上的差異較大。其中，樣品BM7在酸味指標(biāo)上的響應(yīng)值最大，為7.45；樣品BM3在酸味指標(biāo)上的響應(yīng)值最小，為-22.64，但其在鮮味指標(biāo)上的響應(yīng)值最大，為7.38；樣品BM4在咸味指標(biāo)上的響應(yīng)值最大，為12.21，其在鮮味的回味指標(biāo)上的響應(yīng)值亦最大，為9.05。由圖5B可知，酸粥在各滋味指標(biāo)中差異最大的是酸味，極差值為28.37；其次是咸味、鮮味的回味、澀味和鮮味，極差值分別為14.01、10.96、9.18和8.43；而在澀味回味和苦的回味上的差異較小。Lactobacillus和Acetobacter作為酸粥中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，可以產(chǎn)生大量的有機(jī)酸來(lái)降低pH，從而增加酸度[21，25]。由此可知，酸粥樣品中滋味品質(zhì)的差異主要是由酸味引起的。

圖5 酸粥樣品滋味電子舌響應(yīng)雷達(dá)圖（A）及小提琴圖（B）Fig.5 Response radar diagram (A) and violin diagram (B) of sour porridge samples taste by electronic tongue

2.4 優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬與風(fēng)味的相關(guān)性分析

酸粥樣品風(fēng)味特征與其發(fā)酵菌群息息相關(guān)，為探究不同菌群對(duì)自然發(fā)酵酸粥滋味和氣味的影響，本研究對(duì)樣品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬與氣味物質(zhì)、滋味進(jìn)行相關(guān)性分析，其相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖6。

圖6 酸粥樣品優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬與氣味及滋味的相關(guān)性Fig.6 Correlation between dominant bacterial genera and odor and taste of sour porridge samples

由圖6可知，Weissella與酸粥的澀味呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)R2=0.998；Acetobacter與芳香型化合物的生成呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)R2=0.999，與苦的回味呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)R2=0.999；Lactobacillus與氮氧化合物的生成呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)R2=0.999，與乙醇類物質(zhì)的生成呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)R2=0.999。由此可見(jiàn)，Acetobacter和Lactobacillus對(duì)于酸粥中芳香類風(fēng)味物質(zhì)和氮氧化合物的形成有著積極的作用，Weissella對(duì)于酸粥中酸味的形成亦發(fā)揮著積極影響。

3 結(jié)論

巴彥淖爾自然發(fā)酵酸粥樣品的細(xì)菌菌群組成存在一定差異，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為Firmicutes和Proteobacteria，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為L(zhǎng)actobacillus、Acetobacter和Weissella，所有樣品包含7個(gè)核心OTU。就氣味和滋味品質(zhì)而言，其揮發(fā)性物質(zhì)的差異主要集中在氮氧化合物、甲烷和萜類化合物上，而其滋味差異主要體現(xiàn)在酸味方面。經(jīng)相關(guān)性分析得知，Acetobacter和Lactobacillus對(duì)酸粥芳香類風(fēng)味物質(zhì)和氮氧化合物的產(chǎn)生具有積極作用，Weissella對(duì)酸粥酸味的形成亦具有積極影響，在后續(xù)發(fā)酵酸粥工藝中，可進(jìn)一步為其滋味品質(zhì)的提升進(jìn)行研究，完善酸粥風(fēng)味和滋味品質(zhì)的雙向促進(jìn)，優(yōu)化酸粥的生產(chǎn)工藝條件，提升工業(yè)化生產(chǎn)。