不同品種大麥表皮微生物研究

李永強，任婷月*，韓 英，甄 攀

（山西杏花村汾酒廠股份有限公司 技術(shù)中心，山西 汾陽 032205）

清香型白酒是中國白酒三大基本香型之一，獨特的工藝結(jié)合獨特的微生物菌群結(jié)構(gòu)造就了清香型白酒清香純正的風格特征[1]。汾酒大曲是一種以生料大麥、豌豆為原料，自然接種環(huán)境中的微生物，經(jīng)過微生物的生長代謝和能量代謝形成的微生物生態(tài)制品，具有糖化、發(fā)酵、增香的作用[2-4]。

大麥屬禾本科植物，富含碳水化合物、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，此外，含有鈣、磷等礦質(zhì)元素，適合多種微生物生長，是清香型白酒的主要制曲原料[5-7]。不同品種的大麥由于其生長地區(qū)、氣候、儲藏條件的不同，其內(nèi)生微生物、表皮微生物的差異，會對制曲造成一定的影響。近年來，已經(jīng)有較多采用高通量測序技術(shù)解析植物表皮微生物群落結(jié)構(gòu)的研究[8-9]。張二豪等[10]利用高通量測序技術(shù)對蘋果表皮及根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)與多樣性進行研究，并對優(yōu)勢微生物菌屬進行關(guān)聯(lián)性分析；張世偉等[11]采用高通量測序技術(shù)研究了不同品種葡萄表面的微生物群落結(jié)構(gòu)差異，表明不同品種是最關(guān)鍵的影響因素。何萍等[12]采用高通量測序技術(shù)對不同品種葡萄果實表皮微生物群落組成進行研究，結(jié)果表明，不同品種間微生物群落結(jié)構(gòu)組成及相對豐度有較大的差異。目前，有關(guān)大麥表皮微生物多樣性的研究尚非常少，且有關(guān)不同大麥品種原料對于大曲發(fā)酵影響的相關(guān)研究也知之甚少。

本研究采用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)對以上三個不同品種的大麥表皮細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)進行解析，分析不同品種大麥表皮細菌和真菌的多樣性，旨在為清香型白酒制曲原料大麥的質(zhì)量把控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三個不同品種的大麥：DM1（甘啤6號，產(chǎn)地甘肅，清香型白酒現(xiàn)用大麥品種），DM2（汾麥30，產(chǎn)地山西）、DM3（大麥3018，產(chǎn)地山西）。DM2、DM3為本項目團隊優(yōu)選大麥父本、母本，采用系譜法選育得到的新大麥品種，具有遲播早收、生育期短、抗逆性強、畝產(chǎn)高、容重高的優(yōu)良種植特性，適宜山西南部臨汾市、運城市及黃淮冬麥區(qū)種植。

使用經(jīng)體積分數(shù)75%的酒精消毒后的鑷子按照“五點取樣法”取大麥種子樣品，置于無菌自封袋中，-20 ℃冷凍備用。每個樣品取3個樣本作為平行樣。

MoBio PowerSoil 脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Isolation Kit（100）試劑盒：德國QIAGEN公司；2×TaqPlus Master Mix試劑盒：南京諾唯贊生物科技股份有限公司；AgencourtRAMPureRXP（核酸純化試劑盒）：美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SORVALL RC6 Plus高速冷凍離心機：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；GelDoc-It凝膠成像系統(tǒng)：美國UVP公司；NanoDrop2000超微量分光光度計：美國賽默飛公司；Agilent 2100生物分析儀：安捷倫科技有限公司；Labchip GX生物大分子分析儀：珀金埃爾默儀器有限公司；ABI 9700基因擴增聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀，ABI 7500實時熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitive PCR，RT-fqPCR）儀：美國ABI公司；Illumina Miseq PE300高通量二代測序儀：美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

在50 mL無菌離心管中加入10 g大麥樣品和30 mL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），旋渦振蕩，使大麥表皮的微生物富集于PBS中，直接提取緩沖液中的微生物。使用DNA Isolation Kit試劑盒提取基因組DNA，DNA濃度和純度利用Nano Drop 2000進行檢測。

1.3.2 PCR擴增

以總基因組DNA為模版進行PCR擴增，細菌16S rRNA基因的V3-V4區(qū)相關(guān)引物對為338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。真核ITS2區(qū)相關(guān)引物對為：ITS3（5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）。

PCR擴增體系和擴增條件參照相關(guān)文獻方法[13]。PCR擴增產(chǎn)物委托北京奧維森基因科技有限公司使用Illumina Miseq PE300高通量測序平臺進行測序。

1.3.3 高通量測序結(jié)果分析

利用QIIME1（v1.8.0）軟件對測序所得的原始序列進行去噪、拼接和質(zhì)控后，使用UPARSE軟件（version 7.1）根據(jù)97%的相似度對優(yōu)質(zhì)序列進行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類，并進行物種注釋。使用QIIME1（v1.8.0）軟件進行Alpha多樣指數(shù)分析。使用R（v3.6.0）軟件進行物種組成柱狀圖分析和主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品Venn圖分析

對9個大麥樣品表皮微生物細菌16S rRNA基因的V3-V4區(qū)以及真菌ITS2區(qū)進行PCR擴增和測序，對各樣本優(yōu)化后共得到677 155條有效細菌序列和896 479條有效真菌序列，在97%相似度下劃分OTU。

Venn圖可直觀分析各個樣本的OTU數(shù)目和各樣本間的重疊情況[14-15]。由圖1a可知，9個大麥表皮樣本共915個細菌OTUs，DM1、DM2、DM3樣品所產(chǎn)生的OTU數(shù)分別為566個、668個、517個；共有細菌OTU數(shù)為279個，特有細菌OTU數(shù)分別為119個、152個、87個。由圖1b可知，9個大麥表皮樣本共產(chǎn)生了397個真菌OTUs，DM1、DM2、DM3樣品所產(chǎn)生的OTU數(shù)分別為334個、228個、199個；共有真菌OTU數(shù)為131個，特有真菌OTU數(shù)分別為125個、19個、20個。以上結(jié)果表明，不同品種大麥表皮微生物群落結(jié)構(gòu)組成差異較大。

圖1 不同品種大麥樣品基于細菌（a）、真菌（b）操作分類單元的Venn圖Fig.1 Venn diagram of operational taxonomic unit of different varieties of barley samples based on bacteria (a) and fungi (b)

2.2 稀釋性曲線

稀釋性曲線可反映樣品的測序深度，可用來說明測序的數(shù)據(jù)量是否合理。由圖2可知，細菌與真菌的測序深度合理，能反映樣本中微生物的實際情況。

圖2 不同品種大麥樣品細菌（a）、真菌（b）稀釋性曲線Fig.2 Dilution curves of bacteria (a) and fungi (b) of different varieties of barley samples

2.3 Alpha多樣性分析

Chao1指數(shù)表示菌種豐富度，Shannon指數(shù)用來表征菌種多樣性[16]。由圖3可知，DM1樣品的細菌和真菌豐富度和多樣性最高，DM3樣品的細菌和真菌豐富度和多樣性最低。

圖3 不同品種大麥樣品細菌（a、b）及真菌（c、d）Alpha多樣性箱圖Fig.3 Box diagram of bacterial (a,b) and fungal (c,d) alpha diversity of different varieties of barley samples

2.4 細菌群落多樣性分析

由圖4（a）可知，基于門水平，從三個大麥樣本中共得到5個優(yōu)勢細菌門（平均相對含量＞1%），分別為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes），擬桿菌門（Bacteroidota）、放線菌門（Actinobacteriota）和藍細菌門（Cyanobacteria）。DM1樣品中的優(yōu)勢細菌門為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和藍細菌門，平均相對含量分別是70.8%、12.5%、12.3%、2.6%、1.4%。DM2樣品中的優(yōu)勢細菌門為變形菌門、厚壁菌門、藍細菌門、擬桿菌門和放線菌門，平均相對含量分別是82.5%、5.3%、8.6%、2.1%和1.0%。DM3樣品中的優(yōu)勢細菌門為變形菌門、厚壁菌門和藍細菌門，平均相對含量分別是92.9%、2.3%和2.9%。以上結(jié)果表明，三個大麥表皮樣本菌群結(jié)構(gòu)差異較大，且變形菌門在三個品種大麥樣本中均占絕對優(yōu)勢。

圖4 基于門（a）和屬（b）水平不同品種大麥樣品細菌群落結(jié)構(gòu)Fig.4 Bacterial community structure of different varieties of barley samples based on phylum (a) and genus (b) levels

由圖4（b）可知，基于屬水平，DM1的表皮細菌多樣性顯著高于DM2和DM3。DM1樣品共有7個優(yōu)勢細菌屬（平均相對豐度＞1%），分別為假單胞菌屬（Pseudomonas）、馬賽菌屬（Massilia）、泛菌屬（Pantoea）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、類芽孢菌屬（Paenibacillus）、Pedobacter、薄層菌屬（Hymenobacter），平均相對豐度分別為20.8%、17.8%、12.3%、11.7%、9.06%、5.05%、4.20%。DM2、DM3樣品中均有2個優(yōu)勢菌屬（平均相對豐度＞1%），分別是泛菌屬（Pantoea）和假單胞菌屬（Pseudomonas），其平均相對豐度為60.9%、62.3%和11%、26.3%。泛菌屬是一類廣泛存在于自然界且功能多樣的微生物[17]。假單孢菌屬普遍分布于植物中，對植物生長、生物防治和養(yǎng)分利用等方面具有有益作用[18-21]。研究發(fā)現(xiàn)，泛菌屬存在于多種植物的種子中，且多為優(yōu)勢類[22]。在連續(xù)3代的蘿卜種子中，發(fā)現(xiàn)泛菌屬和假單胞菌屬也是主要類群[23]；LEVEAU J H J等[24]研究發(fā)現(xiàn)，霞多麗葡萄上的優(yōu)勢菌屬為假單胞菌屬。RAHMAN M等[25]研究表明，Pantoea和Pseudomonas具有促進植物生長和抵抗真菌性病害等功能。綜上所述，DM2和DM3樣品中富含與植物生長和生物防治相關(guān)的微生物。

2.5 真菌群落多樣性分析

由圖5（a）可知，基于門水平，從三個大麥樣本中，共得到3個優(yōu)勢真菌門（平均相對豐度＞1%），分別為擔子菌門（Basidiomycota）、子囊菌門（Ascomycota）和毛霉門（Mucoromycota）。DM1樣品中的優(yōu)勢真菌門為擔子菌門、子囊菌門和毛霉門，平均相對豐度分別是62.0%、27.1%、10.5%。DM2樣品中的優(yōu)勢真菌門為擔子菌門和子囊菌門，平均相對豐度分別是85.9%、13.8%。DM3樣品中的優(yōu)勢真菌門為子囊菌門和擔子菌門，平均相對豐度分別是80.7%、18.9%。以上結(jié)果表明，大麥表皮樣本中，主要存在擔子菌門、子囊菌門這兩類，三個大麥樣本菌群結(jié)構(gòu)差異較大。

圖5 基于門（a）和屬（b）水平不同品種大麥樣品真菌群落結(jié)構(gòu)Fig.5 Fungal community structure of different varieties of barley samples based on phylum (a) and genus (b) levels

由圖5（b）可知，基于屬水平，DM1的表皮真菌多樣性顯著高于DM2和DM3。DM1樣品中共有9個能準確鑒定的優(yōu)勢菌屬（平均相對豐度＞1%），分別是類型孢子菌屬（Tylospora）、橫梗霉屬（Lichtheimia）、維希尼克氏酵母菌屬（Vishniacozyma）、線黑粉酵母屬（Filobasidium）、Dioszegia、鏈格孢屬（Alternaria）、復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、畢赤酵母屬（Pichia）和鎖霉屬（Itersonilia），其平均相對豐度分別是18.2%、10.4%、9.3%、8.8%、8.2%、6.5%、6.2%、6.2%和4.0%。DM2樣品中共有6個優(yōu)勢細菌屬（平均相對豐度＞1%），分別是擔子菌門一類未鑒定的屬、類型孢子菌屬（Tylospora）、鏈格孢屬（Alternaria）、線黑粉酵母屬（Filobasidium）、復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）和擲孢酵母屬（Sporobolomyces），平均相對豐度分別是71.7%、5.2%、5.2%、4.8%、4.1%和3.6%。DM3樣品中共有5個優(yōu)勢細菌屬（平均相對豐度＞1%）分別是復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、擲孢酵母屬（Sporobolomyces）、類型孢子菌屬（Tylospora）、畢赤酵母屬（Pichia）和鏈格孢屬（Alternaria），平均相對豐度分別是67.8%、7.3%、5.8%、3.6%和2.6%。三個大麥品種優(yōu)勢菌屬差異較大，可能與產(chǎn)地、氣候和品種等因素有關(guān)。復(fù)膜孢酵母屬是清香型白酒大曲上霉的主要微生物，可分泌淀粉酶、蛋白酶、β-葡萄糖苷酶等水解酶類，降解大分子底物，為釀酒酵母等其他白酒發(fā)酵微生物的生長提供營養(yǎng)[26]。DM3樣品中復(fù)膜孢酵母屬為絕對優(yōu)勢真菌屬。鏈格孢屬是一類世界范圍廣泛分布的真菌，存在于自然界的不同基質(zhì)上，可作為腐生菌、寄生菌和內(nèi)生菌，是重要植物病原菌，可造成多種作物的嚴重病害[27]。DM3樣品中鏈格孢屬相對豐度最低。

2.6 基于細菌、真菌OTU水平的不同品種大麥樣品主成分分析

主成分分析（PCA）可直觀地將樣品間、樣品組間差異程度體現(xiàn)在二維坐標圖上，樣品間距離越近表示其物種組成越相似。

由圖6a可知，第一主成分PC1方差貢獻率為61.09%，第二主成分PC2方差貢獻率為12.9%。DM3中兩個樣本與DM2距離較近，DM1與DM2、DM3距離較遠，表明三個大麥品種細菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。由圖6b可知，第一主成分PC1方差貢獻率為49.92%，第二主成分PC2方差貢獻率為34.23%。三個大麥品種組分布距離較遠，表明三個大麥品種真菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。

圖6 基于細菌（a）、真菌（b）操作分類單元水平的不同品種大麥樣品主成分分析Fig.6 Principal component analysis of different varieties of barley samples based on operational taxonomic unit level of bacteria (a) and fungi (b)

3 結(jié)論

采用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)對不同大麥品種表皮微生物群落結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，甘啤6號的細菌和真菌豐富度和多樣性均最高，大麥3018的細菌和真菌豐富度和多樣性均最低。甘啤6號與汾麥30、大麥3018細菌群落結(jié)構(gòu)差異較大，三個大麥品種真菌群落結(jié)構(gòu)差異較大，甘啤6號產(chǎn)地為甘肅，汾麥30、大麥3018產(chǎn)地為山西，由此表明大麥的生長環(huán)境對大麥表皮細菌群落結(jié)構(gòu)的影響較大，大麥品種對其表皮真菌群落結(jié)構(gòu)的影響較大。從細菌群落結(jié)構(gòu)分析來看，甘啤6號表皮樣本的優(yōu)勢細菌屬相對豐度較高的依次是假單胞菌屬（Pseudomonas）、馬賽菌屬（Massilia）、泛菌屬（Pantoea）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、類芽孢菌屬（Paenibacillus）等。汾麥30、大麥3018樣本中，相對豐度較高的依次是泛菌屬（Pantoea）、假單胞菌屬（Pseudomonas）等。從真菌群落結(jié)構(gòu)分析來看，甘啤6號中相對豐度較高的依次是類型孢子菌屬（Tylospora）、橫梗霉屬（Lichtheimia）、維希尼克氏酵母菌屬（Vishniacozyma）、線黑粉酵母屬（Filobasidium）、Dioszegia等。汾麥30樣本中擔子菌門一類未鑒定的屬為優(yōu)勢菌屬；大麥3018樣本中復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）為優(yōu)勢菌屬。本研究揭示了不同品種大麥表皮微生物群落結(jié)構(gòu)的差異，為清香型白酒制曲原料大麥的選擇和質(zhì)量把控提供了理論依據(jù)，并為進一步完善制曲大麥質(zhì)量評價指標提供了科學(xué)依據(jù)。