不同接種順序條件下3株酵母屬菌株生長及釀造特性研究

張 霞，雷學(xué)俊，王曉妹，趙 東，2，楊康卓，陳小文，鄭 佳，2*

（1.宜賓五糧液股份有限公司，四川 宜賓 644000；2.中國輕工業(yè)濃香型白酒固態(tài)發(fā)酵重點實驗室，四川 宜賓 644000）

白酒發(fā)酵是一個復(fù)雜的多種微生物協(xié)調(diào)作用的過程，參與作用的微生物主要有霉菌、酵母菌、細菌和放線菌四大類菌群[1]。酵母菌是十分重要的功能微生物，在白酒發(fā)酵過程中主要參與產(chǎn)生酒精、糖化淀粉、產(chǎn)生香味物質(zhì)等重要環(huán)節(jié)，對白酒最終品質(zhì)的形成起著關(guān)鍵作用[2-3]。根據(jù)酵母功能的不同，主要分為產(chǎn)酒酵母和產(chǎn)香酵母。產(chǎn)酒酵母主要將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇，酵母屬（Saccharomyces）就屬于此類[4]；產(chǎn)香酵母則與酯化酶產(chǎn)生協(xié)同作用，將有機酸、醛類、糖、鹽等物質(zhì)作為底物合成酯類，形成白酒的特征風味[5]。

有關(guān)酵母菌的混菌發(fā)酵主要集中在酵母菌和細菌、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和產(chǎn)香酵母之間協(xié)同或拮抗作用研究，如釀酒酵母和速生梭菌（Clostridium celerecrescens）同時接種為己酸菌合成己酸提供底物—乙醇[6]；釀酒酵母和乳酸菌同時接種能顯著抑制乳酸菌的生長和乳酸合成[7]。DEVANTHI P V P等[8]分別在同時接種和順序接種方式下利用嗜鹽四聯(lián)球菌（Tetragenococcus halophilus）和魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）共發(fā)酵制備醬醪，通過固相微萃?。╯olidphasemicroextraction，SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gaschromatgraphy-massspectrometrometry，GC-MS）對其揮發(fā)性風味成分進行分析，結(jié)果表明，魯氏酵母能夠促進醇類物質(zhì)的形成，并在與嗜鹽四聯(lián)球菌共同培養(yǎng)下產(chǎn)生更復(fù)雜的香氣譜；吳健等[9]研究了不同接種方式和不同接種比例下釀酒酵母與產(chǎn)香酵母之間的相互作用規(guī)律，結(jié)果表明，釀酒酵母會抑制產(chǎn)香酵母的生長，不同接種方式及比例也會影響共培養(yǎng)之間的相互作用關(guān)系；范光森[10]研究發(fā)現(xiàn)，在不同接種方式和不同接種比例下，利用一株高產(chǎn)乙醇的釀酒酵母和一株高產(chǎn)乙酸乙酯的異常威克漢姆共培養(yǎng)發(fā)酵高粱酶解液培養(yǎng)基可大大提高乙酸乙酯的產(chǎn)量；白夢洋等[11]通過改變外界環(huán)境因素將釀酒酵母和畢赤酵母（Pichia pastoris）進行混合培養(yǎng)，結(jié)果表明，不改變外界環(huán)境條件下畢赤酵母對釀酒酵母產(chǎn)生明顯的抑制作用，但隨著發(fā)酵液中乙醇含量的增加，畢赤酵母受到抑制，釀酒酵母則處于相對優(yōu)勢地位；顏兵等[12]通過對釀酒酵母和異常漢遜酵母（Hansenula anomala）共培養(yǎng)的研究發(fā)現(xiàn)，異常漢遜酵母在混合培養(yǎng)中生長受到抑制，而釀酒酵母生長正常。已報道的研究主要集中在酵母屬間的耐受性、發(fā)酵性能和生理代謝等對比性方面[13-14]，還鮮見Saccharomyces不同種之間混菌發(fā)酵的報道。

酵母菌（Saccharomyces）是濃香型白酒釀造的重要種屬，尤其是釀酒酵母，釀酒酵母發(fā)酵力強，主要進行發(fā)酵產(chǎn)乙醇[15-16]。有研究發(fā)現(xiàn)，多種酵母菌共同作用參與白酒的發(fā)酵，其中釀酒酵母是優(yōu)勢酵母[17]。濃香型白酒釀造原料由5種不同糧食混合而成，研究不同接種順序下酵母菌（Saccharomyces）在五糧粉糖化液中混合培養(yǎng)的釀造特性，對將來研究同屬酵母菌之間的釀造特性提供一種研究方式，為進一步認識酵母菌（Saccharomyces）在濃香型白酒發(fā)酵過程中的作用有重要意義。釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）、卡斯泰利芽殖酵母（Saccharomyces castellii）和單孢酵母（Saccharomyces unisporus）是濃香型白酒糟醅中豐度較高的3種酵母菌，也是濃香型白酒糟醅已分離到的可培養(yǎng)酵母菌[18]。因此，本研究以濃香型白酒糟醅中分離篩選得到的以上3株酵母菌屬（Saccharomyces）不同種的酵母菌株，分別以純培養(yǎng)為對照，固定接種比例，通過同時接種和順序接種兩種方式研究不同接種順序下此3株酵母菌在五糧粉糖化液中混合培養(yǎng)時的釀造特性，為進一步了解此3株酵母菌在濃香型白酒發(fā)酵過程中的作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y134、卡斯泰利芽殖酵母（Saccharomyces castellii）Y141、單孢酵母（Saccharomyces unisporus）Y140：均分離自濃香型白酒發(fā)酵糟醅。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基[7]：蛋白胨20.0 g/L，酵母膏10.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，pH自然。121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。YPD固體培養(yǎng)基：YPD液體培養(yǎng)基中添加瓊脂20.0 g/L。

五糧粉糖化液[19]：粉碎后的五種糧食（高粱36%、大米22%、糯米18%、小麥16%和玉米8%）∶水=1∶10，浸泡，煮沸糊化40 min，加1.6%α-淀粉酶65 ℃液化3 h，再加1.6%糖化酶62 ℃糖化3 h，將過濾液糖度調(diào)至12～13°Bx。121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.1.3 試劑

葡萄糖（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉（分析純）：四川西隴化工有限公司；乙醇（純度99.8%）：美國Honeywell公司；4-辛醇（色譜純）：美國Sigma-Aldrich公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TG-WAX毛細管色譜柱（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國Thermo公司；固相微萃取手柄、50 μm CAR/DVB/PDMS纖維萃取頭：美國Supelco公司；7890B-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）：美國Agilent公司；5810R離心機：德國Eppendorf公司；FE28 pH計：梅特勒托利多（中國）有限公司；BPC-250F生化培養(yǎng)箱：上海一恒科技儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酵母菌株活化

取一環(huán)酵母菌斜面培養(yǎng)物接種于YPD液體培養(yǎng)基，28 ℃活化培養(yǎng)16 h到對數(shù)生長期。

1.3.2 純培養(yǎng)酵母菌的釀造特性

將活化好的菌液分別以105CFU/mL接入50 mL五糧粉糖化液中，純培養(yǎng)體系包括酵母菌Y134、Y141和Y140，于28 ℃靜置培養(yǎng)7 d，發(fā)酵0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h、120 h、168 h時取樣。由于3株酵母菌在YPD平板上的菌落形態(tài)不同，采用稀釋平板法測定發(fā)酵過程中3株酵母菌的活菌數(shù)[20]，同時測定發(fā)酵液理化指標，并測定發(fā)酵12 h后發(fā)酵液中的特征揮發(fā)性風味成分。

1.3.3 混合培養(yǎng)酵母菌的釀造特性

同時接種混合培養(yǎng)：將活化好的菌液同時分別以105CFU/mL接種于50 mL五糧粉糖化液中，混合培養(yǎng)體系包括Y134&Y141、Y134&Y140、Y141&Y140和Y134&Y141&Y140，后續(xù)培養(yǎng)及樣品處理同1.3.2。

順序接種混合培養(yǎng)：將活化好的菌液以105CFU/mL接種于50 mL五糧粉糖化液中，接種順序為0 h接入菌株Y140，12 h接入菌株Y141，24 h接入菌株Y134，混合培養(yǎng)體系也包括Y134&Y141、Y134&Y140、Y141&Y140和Y134&Y141&Y140，后續(xù)培養(yǎng)及樣品處理同1.3.2。

1.3.4 理化指標的測定

pH：采用pH計測定；還原糖含量：采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測定[21]；乙醇含量：使用頂空固相微萃取（HS-SPME）-氣相色譜法測定[22]。

1.3.5 揮發(fā)性風味成分的測定

使用頂空固相微萃取（HS-SPME）萃取揮發(fā)性風味物質(zhì)，并利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）檢測揮發(fā)性風味物質(zhì)的含量，具體方法參照文獻[23]。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

同一處理的樣品做3組平行，結(jié)果以“平均值±標準差”表示；使用Origin2021軟件處理發(fā)酵液活菌數(shù)和理化指標的變化；利用R語言中的Pheatmap程序包繪制熱圖，進行揮發(fā)性風味成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 3株酵母菌純培養(yǎng)發(fā)酵生長特征

由圖1可知，3株酵母菌株純培養(yǎng)時的生長趨勢相似。其中，菌株Y134生長速度最快，最先達到穩(wěn)定期（24 h），且活菌數(shù)最高（8.0×106CFU/mL）；菌株Y141培養(yǎng)36 h時，活菌數(shù)達到最高（7.5×106CFU/mL），菌株Y140生長速度較慢，培養(yǎng)48 h時，活菌數(shù)達到最高（6.5×106CFU/mL）。

圖1 3株酵母菌純培養(yǎng)活菌數(shù)的變化情況Fig.1 Change of viable counts of 3 yeast strains during pure culture

2.2 不同接種順序?qū)?株酵母菌株生長特征的影響

不同接種順序混合培養(yǎng)3株酵母菌活菌數(shù)的變化情況見圖2。由圖2可知，由于有限的營養(yǎng)物質(zhì)和生存空間以及菌種之間的相互競爭，無論接種順序如何，混合培養(yǎng)時各菌株的最大活菌數(shù)都低于純培養(yǎng)的水平，與唐潔等[24]的研究結(jié)果類似。

圖2 不同接種順序條件下混合培養(yǎng)3株酵母菌的活菌數(shù)變化情況Fig.2 Change of viable counts of 3 yeast strains during mixed culture with different inoculation sequence

同時接種時，混合培養(yǎng)條件下菌株Y134的活菌數(shù)和純培養(yǎng)的活菌數(shù)相近，說明菌株Y134的生長幾乎不受其他兩株菌的影響，而菌株Y140和Y141則受菌株Y134的競爭影響較大。在Y134&Y141、Y134&Y140混合培養(yǎng)條件下，菌株Y141和Y140最大活菌數(shù)分別僅達到9.0×105CFU/mL和5.0×105CFU/mL，且兩者活菌數(shù)在達到穩(wěn)定期后迅速降低；在Y141&Y140混合培養(yǎng)條件下，兩菌株互相影響，菌株Y141略占優(yōu)勢，但最大活菌數(shù)（4.0×106CFU/mL）比純培養(yǎng)時降低了47%；在Y134&Y141&Y140混合培養(yǎng)條件下，菌株Y134對菌株Y141和Y140的抑制作用明顯，菌株Y141和Y140分別在24 h和12 h達到最大活菌數(shù)后快速下降。說明同時接種條件下，3株菌混合培養(yǎng)時，Saccharomyces cerevisiaeY134競爭優(yōu)勢顯著，嚴重抑制Saccharomyces castelliiY141和Saccharomyces unisporusY140的生長，而SaccharomycescastelliiY141對Saccharomyces unisporusY140又有一定的抑制作用。

順序接種時，在Y134&Y141混合培養(yǎng)條件下，菌株Y134抑制菌株Y141生長的同時自身生長受到影響，最大活菌數(shù)明顯降低。在Y134&Y140混合培養(yǎng)條件下，兩株菌的最大活菌數(shù)均略低于純培養(yǎng)，菌株Y134對菌株Y140的抑制作用明顯減弱。48 h后隨著菌株Y134活菌數(shù)的增加，菌株Y140活菌數(shù)極速下降，這可能是菌株Y134對菌株Y140的競爭優(yōu)勢和營養(yǎng)條件的限制所致。在Y141&Y140混合培養(yǎng)條件下，菌株Y141沒有表現(xiàn)出如同時接種時對菌株Y140的競爭優(yōu)勢，反而其生長受到限制，不僅提前進入穩(wěn)定期，而且最大活菌數(shù)也比純培養(yǎng)時降低了30%。在Y134&Y141&Y140混合培養(yǎng)條件下，活菌數(shù)均未達到純培養(yǎng)時最大活菌數(shù)，可能是一方面由于營養(yǎng)物質(zhì)和生存空間的限制，另一方面由于3株菌互相競爭抑制。由此可見，順序接種條件下，Saccharomyces cerevisiaeY134的競爭優(yōu)勢被削弱，而Saccharomyces castelliiY141對Saccharomyces unisporusY140的抑制作用消失。

2.3 不同接種順序發(fā)酵五糧粉糖化液理化指標的變化

2.3.1 pH的變化

純培養(yǎng)及不同接種順序混合培養(yǎng)發(fā)酵五糧粉糖化液pH的變化見圖3。

圖3 同時接種（A）及順序接種（B）發(fā)酵五糧粉糖化液pH的變化Fig.3 Change of pH of five grains powder saccharification liquid fermented by simultaneous inoculation (A) and sequential inoculation (B)

由圖3可知，所有樣品的pH變化趨勢都一致，發(fā)酵前36 h下降迅速，同時接種混合培養(yǎng)發(fā)酵五糧粉糖化液的pH值從6.10降至5.32～5.65。順序接種混合培養(yǎng)發(fā)酵五糧粉糖化液的pH值從6.10降至5.22～5.42，之后保持穩(wěn)定或略微升高。酵母在發(fā)酵初期會產(chǎn)生乙酸等酸性物質(zhì)，使得發(fā)酵液pH下降迅速，進入穩(wěn)定期后，酵母發(fā)酵主要產(chǎn)乙醇以及積累代謝產(chǎn)物，隨著發(fā)酵液中酒精度的升高，一些酸類物質(zhì)被利用合成酯類，因此發(fā)酵中后期pH值穩(wěn)定或略微升高[25-26]。這說明接種順序?qū)?株酵母菌混合培養(yǎng)發(fā)酵五糧粉糖化液pH的變化趨勢無顯著影響。

2.3.2 還原糖含量的變化

微生物的生長需要碳源，酵母菌可以利用還原糖作為碳源進行繁殖代謝[27]。純培養(yǎng)及不同接種方式混合培養(yǎng)發(fā)酵五糧粉糖化液中還原糖含量的變化見圖4。由圖4可知，所有樣品發(fā)酵前36 h還原糖含量下降迅速，之后趨于平穩(wěn)。同時接種條件下，菌株Y134純培養(yǎng)及其所有混合培養(yǎng)發(fā)酵液中還原糖含量下降較快，在24 h均已達到最低值（2.18～2.22 g/L），而菌株Y141和Y140的純培養(yǎng)及其混合培養(yǎng)發(fā)酵液中還原糖含量則在發(fā)酵36 h達最低值（2.23～2.30 g/L）；順序接種條件下，只有菌株Y134純培養(yǎng)發(fā)酵液中還原糖含量在24 h達到最低值（2.27 g/L），其他發(fā)酵液中還原糖含量均在36 h達到最低值（2.17～2.35 g/L）。說明順序接種會延遲菌株Y134與其他菌株混合培養(yǎng)對還原糖的利用，而對Y140和Y141混合培養(yǎng)無影響。

圖4 同時接種（A）及順序接種（B）發(fā)酵五糧粉糖化液中還原糖含量的變化Fig.4 Change of reducing sugar content of five grains powder saccharification liquid fermented by simultaneous inoculation(A) and sequential inoculation (B)

2.3.3 乙醇含量的變化

濃香型白酒發(fā)酵離不開酵母菌的作用，特別是發(fā)酵產(chǎn)乙醇的釀酒酵母[28]，本研究中的3株酵母菌均能夠發(fā)酵產(chǎn)乙醇[29-30]。純培養(yǎng)及不同接種方式混合培養(yǎng)發(fā)酵五糧粉糖化液乙醇含量的變化見圖5。由圖5可知，同時接種時，除菌株Y141和Y140純培養(yǎng)發(fā)酵液中乙醇含量在168 h達最大值，其他所有發(fā)酵液中的乙醇含量均在發(fā)酵24 h時達到最大值，之后趨于穩(wěn)定，其中菌株Y134純培養(yǎng)發(fā)酵液中乙醇含量最高，達5.6%。順序接種條件下，Y134&Y141和Y134&Y140發(fā)酵液在發(fā)酵24 h時乙醇含量達最大值（分別為4.3%和4.4%），Y141&Y140和Y134&Y141&Y140發(fā)酵液在發(fā)酵48 h時乙醇含量達最大值（3.9%），這和發(fā)酵液中還原糖含量變化相反，這是因為酵母菌消耗還原糖代謝產(chǎn)生了乙醇[31]。順序接種條件下混合培養(yǎng)發(fā)酵體系中乙醇含量最大值比同時接種條件下的乙醇含量最大值均有所降低，其中順序接種時Y141&Y140發(fā)酵液中乙醇含量最大值下降最多，高達28%，說明順序接種降低了混合培養(yǎng)發(fā)酵時3株酵母菌產(chǎn)乙醇能力。

圖5 同時接種（A）及順序接種（B）發(fā)酵五糧粉糖化液中乙醇含量的變化Fig.5 Change of ethanol content of five grains powder saccharification liquid fermented by simultaneous inoculation (A) and sequential inoculation (B)

2.4 不同接種順序?qū)ξ寮Z粉糖化液揮發(fā)性特征風味成分的影響

乙酸乙酯、異丁醇和異戊醇均為酵母菌在酒精發(fā)酵時的副產(chǎn)物[32]，對白酒影響比較大，與白酒骨架成分相關(guān)[33]。因此，關(guān)注酵母發(fā)酵液中乙酸乙酯和高級醇（異丁醇、異戊醇）含量的變化有助于酵母菌的代謝調(diào)控，使其朝著有利于增加白酒香味成分的方向代謝。純培養(yǎng)及不同接種方式混合培養(yǎng)發(fā)酵五糧粉糖化液中特征揮發(fā)性風味成分見圖6。

圖6 同時接種（A）及順序接種（B）發(fā)酵五糧粉糖化液中特征風味物質(zhì)的變化Fig.6 Change of characteristic flavor substances content of five grains powder saccharification liquid fermented by simultaneous inoculation (A) and sequential inoculation (B)

由圖6可知，無論接種順序如何，純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)發(fā)酵液中揮發(fā)性特征風味物質(zhì)含量均為乙酸乙酯＜異丁醇＜異戊醇。純培養(yǎng)條件下，菌株Y141純培養(yǎng)發(fā)酵液中乙酸乙酯含量在第5天達最大值，菌株Y134和Y140純培養(yǎng)發(fā)酵液中乙酸乙酯含量在第2天達最大值。同時接種條件下，所有混合培養(yǎng)發(fā)酵液中乙酸乙酯含量均在第2天達最大值；順序接種條件下，除Y134&Y141發(fā)酵液中乙酸乙酯含量在第5天達最大值，其余混合培養(yǎng)發(fā)酵液均在第7天達最大值，且Y134&Y141&Y140發(fā)酵液中乙酸乙酯含量最高，達到22 mg/L。順序接種條件下混合培養(yǎng)發(fā)酵液中乙酸乙酯含量高于純培養(yǎng)和同時接種，說明順序接種延長了酵母菌產(chǎn)乙酸乙酯的時間，使得順序接種混合培養(yǎng)時發(fā)酵液中乙酸乙酯含量增加。

關(guān)于異丁醇、異戊醇含量的變化，菌株Y134純培養(yǎng)發(fā)酵液中異丁醇含量在第3天達最大值（37.67 mg/L），菌株Y141純培養(yǎng)發(fā)酵液中異丁醇含量第2天達最大值（39.68 mg/L），菌株Y140純培養(yǎng)發(fā)酵液中異丁醇含量在第5天達最大值（25.06 mg/L），3株酵母菌純培養(yǎng)發(fā)酵液中異戊醇含量均在第5天達最大值，且菌株Y141純培養(yǎng)發(fā)酵液中含量最高（79.14 mg/L）。除順序接種的Y141&Y140發(fā)酵液在發(fā)酵第2天時異丁醇含量達最大值（49.60 mg/L）外，其余混合培養(yǎng)發(fā)酵液中異丁醇和異戊醇含量都是在第5天或第7天達最大值。所有順序接種條件下混合培養(yǎng)發(fā)酵液中異丁醇、異戊醇含量均高于純培養(yǎng)及同時接種條件下混合培養(yǎng)發(fā)酵液，說明在混合培養(yǎng)發(fā)酵中菌株之間互相促進產(chǎn)高級醇類。猜測原因是混合培養(yǎng)發(fā)酵時3株酵母互相影響，改變了乙醇發(fā)酵路徑，使得混合培養(yǎng)時促進乙醇發(fā)酵時副產(chǎn)物高級醇的產(chǎn)生，這還有待于進一步研究其菌株間代謝途徑。有研究表明，適量的高級醇有利于酒體的和諧，但含量稍高則會破壞酒體風格，影響白酒口感[34]。由此可見，同時接種有利于控制發(fā)酵液中高級醇含量，更適合濃香型白酒發(fā)酵，也符合濃香型白酒窖池中微生物的發(fā)酵方式。

3 結(jié)論

本研究以分離自濃香型白酒糟醅中的3株酵母菌（釀酒酵母Y134、卡斯泰利芽殖酵母Y141、單孢酵母Y140）為研究對象，研究接種順序?qū)?株菌在五糧粉糖化液中生長及釀造特性的影響。結(jié)果表明，接種順序?qū)Υ?株酵母菌混合培養(yǎng)發(fā)酵中菌株的生長特征影響較大，同時接種時菌株Y134占絕對優(yōu)勢，菌株Y141對菌株Y140有一定程度的抑制作用；順序接種時菌株Y134的競爭優(yōu)勢明顯減弱，菌株Y141和菌株Y140降低了菌株Y134的最大活菌數(shù)，菌株Y141失去對菌株Y140的抑制作用。接種順序?qū)?株酵母菌混合培養(yǎng)發(fā)酵五糧粉糖化液的pH無明顯影響，而順序接種會延遲Y134混合培養(yǎng)時菌株對還原糖的利用，降低菌株產(chǎn)乙醇能力，提高乙酸乙酯、異丁醇和異戊醇含量，說明同時接種有利于控制發(fā)酵液中乙酸乙酯和高級醇含量，更適合濃香型白酒發(fā)酵，也符合濃香型白酒窖池中微生物的發(fā)酵方式。接種順序影響了3株酵母菌混合培養(yǎng)發(fā)酵下的釀造特性，這對將來研究酵母菌在白酒發(fā)酵過程中的作用奠定基礎(chǔ)，而同時接種更利于此3株酵母菌釀造特性的體現(xiàn)，這對研究酵母菌混合培養(yǎng)以及此3株酵母在白酒發(fā)酵過程中的作用提供一定的指導(dǎo)意義。