基于核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)金黃色葡萄球菌檢測的研究進(jìn)展

伊廷存，胡 梅，霍勝楠*，孟 靜，任意婕，翟清燕，孫瀟慧

（山東省食品藥品檢驗研究院 國家市場監(jiān)管重點實驗室 肉及肉制品監(jiān)管技術(shù)，山東 濟(jì)南 250101）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），隸屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus），普遍存在于空氣、食物、污水等環(huán)境中[1]。金黃色葡萄球菌及其腸毒素是造成細(xì)菌性食物中毒的最常見原因之一，在動物養(yǎng)殖、食品生產(chǎn)加工和食品監(jiān)管方面均存在隱患。因此，快速準(zhǔn)確地檢測金黃色葡萄球菌是確保食品安全和保護(hù)人類免受食源性疾病侵害的關(guān)鍵因素。基于傳統(tǒng)培養(yǎng)的檢測方法是食源性致病菌檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但費時又費力。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是基于核酸鍵比對的檢測技術(shù)，提高了靈敏度和特異性，但PCR需要熱循環(huán)擴(kuò)增儀器和復(fù)雜的擴(kuò)增程序，無法滿足現(xiàn)場快速檢測的需求。核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)是PCR的替代方案，等溫擴(kuò)增是一種使用簡單的溫度控制器擴(kuò)增核苷酸鏈的技術(shù)，允許核酸擴(kuò)增在單一的恒定溫度下進(jìn)行，無需熱循環(huán)儀，具有檢測效率高，檢測速度快，設(shè)備簡單等優(yōu)勢，在現(xiàn)場快速檢測方面的適用性高，可有效應(yīng)用于食源性致病菌的檢測[2-3]。

目前，檢測金黃色葡萄球菌的核酸等溫擴(kuò)增檢測技術(shù)有環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（loop mediated isothermal amplification，LAMP）、重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）、重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增（recombinase aided amplification，RAA）、滾環(huán)擴(kuò)增（rolling circle amplification，RCA）等。此外，國家也發(fā)布了金黃色葡萄球菌等溫擴(kuò)增檢測的標(biāo)準(zhǔn)，如SN/T 2754.1—2011《出口食品中致病菌環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增（LAMP）檢測方法第1部分：金黃色葡萄球菌》[4]等。金黃色葡萄球菌現(xiàn)場快速檢測技術(shù)仍存在靈敏度低、檢測時間長等問題，無法滿足食品安全監(jiān)督管理和食品產(chǎn)品質(zhì)量控制的需要。

因此，為了適應(yīng)食品安全監(jiān)管的新形勢，提升食品安全監(jiān)管的技術(shù)水平，本文闡述了常見的核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)中的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）、滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）、重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）、重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增（RAA）的原理及優(yōu)缺點，主要闡述了核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)技術(shù)在金黃色葡萄球菌檢測上的應(yīng)用，并總結(jié)了其目標(biāo)產(chǎn)物檢測技術(shù)，以期為金黃色葡萄球菌等溫擴(kuò)增快速檢測技術(shù)開發(fā)提供理論支持。

1 核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)的原理及優(yōu)缺點

1.1 核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)的原理

LAMP是一種通過使用具有高置換鏈活性的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶和一組專門設(shè)計的引物擴(kuò)增目標(biāo)DNA鏈的分子生物學(xué)檢測方法。首先，將正向內(nèi)引物（forward inner primer，F(xiàn)IP）雜交到靶DNA的F2c區(qū)域，并合成互補(bǔ)鏈，接下來，在外引物F3雜交到F3c區(qū)后開始鏈置換。然后釋放互補(bǔ)鏈并用作向后內(nèi)引物。接下來，將后向內(nèi)引物（backward inward primer，BIP）雜交，并開始鏈合成。隨后，使用B3引物完全合成互補(bǔ)的DNA鏈，并產(chǎn)生啞鈴形或莖環(huán)DNA用于LAMP循環(huán)擴(kuò)增[5]。

RCA是一種等溫擴(kuò)增反應(yīng)，由在37 ℃下具有鏈置換活性的DNA聚合酶催化完成。獨特的寡核苷酸掛鎖探針（padlock probe，PLP）與靶序列雜交，在DNA連接酶作用下合成環(huán)狀模板。特異引物與環(huán)狀模板對齊后，在DNA聚合酶的作用沿環(huán)延伸，并且先前生成的延伸鏈不斷被替換。最終產(chǎn)生數(shù)百至數(shù)千個重復(fù)的長單鏈DNA產(chǎn)物，包括單引物擴(kuò)增RCA（single-primer RCA）、多引物擴(kuò)增RCA（multiple-primer RCA）和指數(shù)擴(kuò)增RCA（exponential RCA）[6-7]。另外，在RCA基礎(chǔ)上開發(fā)了一種跨越式滾環(huán)擴(kuò)增（saltatory rolling circle amplification，SRCA），實現(xiàn)了非閉環(huán)DNA模板擴(kuò)增，且無需形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)[8]。

RPA是由加載因子（T4 UvsY）、重組酶（T4 UvsX）、聚合酶（Bsu）和單鏈結(jié)合蛋白（T4 gp32）以及兩條特異性的上下游引物參與的一種等溫擴(kuò)增反應(yīng)。首先，T4 UvsX重組酶在T4 UvsY蛋白的幫助下與寡核苷酸引物結(jié)合，形成重組酶-引物復(fù)合物，然后這些復(fù)合物與目標(biāo)dsDNA的同源序列雜交，并在同源位點啟動鏈侵襲。解鏈的DNA鏈通過單鏈結(jié)合蛋白（T4 gp32）穩(wěn)定，具有鏈置換活性的DNA聚合酶（Bsu）結(jié)合到引物的3'端，并且在脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）存在下進(jìn)行引物延伸，并實現(xiàn)DNA產(chǎn)物的指數(shù)放大[9]，RPA已由TwistDx商業(yè)化[10]。

RAA與RPA具有相似的原理，區(qū)別是其重組酶UvsX來自于大腸桿菌（Escherichia coli），而RPA是噬菌體重組酶。RAA是由江蘇奇天公司研發(fā)，并進(jìn)行了商業(yè)化生產(chǎn)[11]。

1.2 不同核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)的比較及優(yōu)缺點

核酸等溫擴(kuò)增的顯著優(yōu)勢是能夠使用簡單的熱控制儀器擴(kuò)增核酸，且操作簡單，不需要專業(yè)的人員即可操作[12]。不同核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)的比較見表1。

表1 不同核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)的比較Table 1 Comparison of different nucleic acid isothermal amplification technology

由表1可知，4種核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)的反應(yīng)溫度范圍為37～65 ℃，越高的溫度對設(shè)備的要求就越高，RPA和RAA的反應(yīng)溫度為37～40 ℃，更接近室溫環(huán)境。除此之外，LAMP和RCA擴(kuò)增反應(yīng)前還需要95 ℃的條件進(jìn)行雙鏈DNA（double strand DNA，dsDNA）解鏈為單鏈DNA（single strand DNA，ssDNA），且在擴(kuò)增反應(yīng)的最后還需80 ℃和60 ℃條件下擴(kuò)增以提高檢測的靈敏度。而RPA和RAA可以直接作用于dsDNA，不需要額外的加熱步驟[7]。對于擴(kuò)增類型而言，4種等溫擴(kuò)增技術(shù)都可實現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增。對于聚合酶而言，3種DNA聚合酶都具有鏈置換活性和5'→3'聚合酶活性，而phi29 DNA聚合酶可連續(xù)合成長片段的DNA，RAA采用的來源于細(xì)菌和真菌的DNA聚合酶相較于RPA具有更高的活性[13]。對于反應(yīng)時間而言，RPA和RAA的反應(yīng)時間最短，可實現(xiàn)靶基因的快速檢測，有利于開發(fā)食源性致病菌的快速檢測。對于目標(biāo)基因長度，RCA能夠擴(kuò)增的片段最長。對于引物數(shù)量而言，LAMP需要4～6個引物，引物設(shè)計復(fù)雜，容易引起非特異性擴(kuò)增。

LAMP具有出色的特異性和擴(kuò)增速率，但其主要缺點是靶DNA長度的限制和擴(kuò)增子的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。LAMP的最佳靶標(biāo)長度＜300 bps，因此設(shè)計引物時不建議擴(kuò)增＞500 bps的靶DNA[14]。RPA的主要缺點是設(shè)計引物的難度很高，由于RPA在相對較低的溫度下工作，因此較長的引物形成的二級結(jié)構(gòu)不會變性，但這可能導(dǎo)致擴(kuò)增失敗，因此建議使用30～45個堿基對范圍內(nèi)的引物[15]。RPA的第二個缺點是它對目標(biāo)序列選擇的限制。盡管RPA能夠擴(kuò)增高達(dá)1.5 kb的長序列，但它更適合80～400 bps的短序列，最好為100～200 bps[16]，另外RPA和RAA還支持多重擴(kuò)增反應(yīng)，適合開發(fā)多種食源性致病菌的同時檢測[17]。RCA由于使用PLP擴(kuò)增線性靶標(biāo)DNA會導(dǎo)致測定的特異性更高，且存在非特異性擴(kuò)增和引物設(shè)計的復(fù)雜問題[3]。此外，RAA試劑的成本要較RPA的試劑成本低，也是開發(fā)金黃色葡萄球菌的快速檢測技術(shù)的一大優(yōu)勢。

2 核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)技術(shù)在金黃色葡萄球菌檢測上的應(yīng)用

采用核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)檢測金黃色葡萄球菌的流程如下：

2.1 金黃色葡萄球菌核酸等溫擴(kuò)增檢測限

核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)在金黃色葡萄球菌檢測上得到廣泛應(yīng)用，基于等溫擴(kuò)增技術(shù)檢測金黃色葡萄球菌的相關(guān)研究進(jìn)展見表2。

表2 核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)在金黃色葡萄球菌檢測上的應(yīng)用Table 2 Application of nucleic acid isothermal amplification technology in Staphylococcus aureus detection

由表2可知，靈敏度越高，能從樣品檢測到金黃色葡萄球菌的可能性就越高；檢測限越低，越能真實反應(yīng)樣品中污染的金黃色葡萄球菌。LAMP、RCA、RPA和RAA的檢測靈敏度均能達(dá)到100 CFU/mL（g），但SOWMYA N等[23]建立的金黃色葡萄球菌LAMP方法，只能檢測牛奶、甘蔗汁和米飯中低至100 CFU/mL（g）的金黃色葡萄球菌，SHEET O H等[24]開發(fā)的基于基因nuc的LAMP檢測方法，僅能檢測牛奶中低至9×102CFU/mL的金黃色葡萄球菌，HASSAN M等[25]開發(fā)了基于femA和arcC基因檢測金黃色葡萄球菌的LAMP方法，可檢測到食品中100 CFU/mL（g）的金黃色葡萄球菌。WANG Y T等[26]建立了免疫磁分離-RCA檢測金黃色葡萄球菌的方法，可檢測果汁中低至3.3×102CFU/mL的金黃色葡萄球菌。LI Y N等[27]描述了用于測定金黃色葡萄球菌DNA的比色微孔板法，金黃色葡萄球菌目標(biāo)序列的檢測限為1.2 pmol/L的基因組，并驗證了該方法在食品樣品中的應(yīng)用潛力。YANG Q等[20]建立了一種SRCA方法來檢測牛奶中的金黃色葡萄球菌，其熒光檢測方法的檢測限為56 CFU/mL，與傳統(tǒng)的PCR方法相比，SRCA測定的靈敏度至少提高了100倍，但該方法需要94 ℃預(yù)變性3 min，80 ℃孵育5 min，增加了檢測成本。

CHENG R等[28]采用一種基于免疫磁珠和RPA結(jié)合的免疫磁分離法檢測牛奶和豬肉中的金黃色葡萄球菌菌株，在人工污染樣品中的檢測靈敏度為5.1×101CFU/mL。HU J Q等[29]建立的基于RPA和聚合物絮凝沉降的新型檢測方法，人工污染食品樣品中金黃色葡萄球菌的檢測限為38 CFU/mL（g）。王雨[30]建立了一種基于RPA-側(cè)向流動試紙條（lateral flow dipstick，LFD）的快速、可視化檢測系統(tǒng)，可以對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌兩種重要的食源性致病菌實現(xiàn)高靈敏性、強(qiáng)特異性的快速有效檢測，在加入金黃色葡萄球菌的肉、海鮮、蔬菜、牛奶、雞蛋等食品基質(zhì)中金黃色葡萄球菌的檢測靈敏度為20 CFU/mL（g）。后來旺等[31]開發(fā)的RAA-側(cè)流層析試紙方法，靈敏度分析結(jié)果表明金黃色葡萄球菌的檢出限為1.83×102CFU/mL。QIAN J J等[22]建立了檢測金黃色葡萄球菌的RAA-LFD技術(shù)，人工污染醬油、豆汁、果奶和牛奶樣品的檢測限為2×101CFU/mL。

同種等溫擴(kuò)增技術(shù)基于不同的樣品基質(zhì)，其檢測限也存在差異，如XIONG J等[32]開發(fā)的可視閉管LAMP方法，僅能檢測到干魚制品中3×103CFU/g的金黃色葡萄球菌，HU J Q等[29]建立的RPA方法可以檢測到牛奶、蝦、魚、剩米飯中低至3.8 CFU/mL（g）的金黃色葡萄球菌，而在豬肉、奶酪和雞蛋中的檢測靈敏為38 CFU/g。分析其原因，可能是由于不同樣品存在的抑制劑不同，也可能是樣品基質(zhì)本身的成分對等溫擴(kuò)增反應(yīng)存在干擾，如奶酪和雞蛋的高黏稠度降低了DNA的提取效率，高脂肪高蛋白質(zhì)干擾了等溫擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)程等。因此，應(yīng)針對不同的樣品基質(zhì)考慮等溫擴(kuò)增反應(yīng)種類并研究其檢測的靈敏度。

2.2 核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)檢測金黃色葡萄球菌的目標(biāo)基因

金黃色葡萄球菌檢測常用基因見表3。

表3 金黃色葡萄球菌檢測常用基因Table 3 Common genes for Staphylococcus aureus detection

由表3可知，檢測金黃色葡萄球菌常用的靶基因主要有nuc、femA、mecA、arcC、gyrB等。nuc基因是編碼金黃色葡萄球菌細(xì)胞外熱穩(wěn)定核酸酶（thermostable nuclease，TNase）蛋白的物種特異性基因，在不同菌株之間具有較高的保守性，是檢測金黃色葡萄球菌應(yīng)用最廣的目標(biāo)基因[33-34]。femA為金黃色葡萄球菌特異性基因，是耐藥基因的輔助基因，其所編碼蛋白與細(xì)胞壁肽聚糖五甘氨酸橋合成有關(guān)，已被用作鑒定金黃色葡萄球菌的分子標(biāo)記，在系統(tǒng)發(fā)育上也是保守的，葡萄球菌之間的差異低于20%[30]；mecA編碼青霉素結(jié)合蛋白2a基因，是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的特異性基因，常與nuc基因結(jié)合檢測金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；arcC為編碼氨基甲酸酯激酶的基因，是金黃色葡萄球菌七個管家基因之一，對金黃色葡萄球菌具有特異性；gyrB編碼DNA促旋酶中B亞單位蛋白的基因。

金黃色葡萄球菌的目標(biāo)基因越保守，其檢測準(zhǔn)確度就越高，越能同其他細(xì)菌區(qū)分開。此外，選擇其他方法確定金黃色葡萄球菌靶基因也有相關(guān)研究報道，如WU C等[35]通過對國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中金黃色葡萄球菌基因組序列和NCBI的非冗余核酸數(shù)據(jù)庫下載到本地服務(wù)器，通過本地基于局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）和在線比對篩選金黃色葡萄球菌的潛在特異性基因，并滿足種間特異性和種內(nèi)普遍性的標(biāo)準(zhǔn)，建立了特異性的LAMP檢測方法，檢測限為4×102CFU/mL，對金黃色葡萄球菌的特異性為100%，與傳統(tǒng)的PCR相比，LAMP將檢測限降低了220倍。

3 目標(biāo)產(chǎn)物檢測技術(shù)

3.1 比色法

比色法是借助反應(yīng)體系中的特殊成分（如MnCl2），加入特定的比色顯色試劑（金屬敏感染料和pH敏感染料）生成定性的顏色結(jié)果[36]。顯色試劑一般有甲酚紅（由紅色到黃色）、羥基萘酚藍(lán)（深藍(lán)色到藍(lán)色）和骨鈣黃素（深黃色到黃色），以及孔雀石綠（深藍(lán)色到淺藍(lán)色）和無色結(jié)晶紫等[37]。CHEN X等[38]采用孔雀石綠作為比色劑，陽性結(jié)果會由無色變?yōu)榫G色，開發(fā)了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的LAMP比色檢測方法，檢測限為100 fg的基因組DNA。此外，還可以通過觀察沉淀物來辨別檢測結(jié)果，HU J Q等[29]提出了一種基于RPA和聚合物絮凝沉降的新型檢測方法，0.2 g/mL PEG8 000與0.5 moL NaCl溶液混勻后，與RPA產(chǎn)物1∶1混勻，加入10 μL免疫磁珠結(jié)合目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行磁分離洗滌，乙酸鈉緩沖液作用下產(chǎn)生絮凝沉降，目視可檢測低至1.3×10-5ng的金黃色葡萄球菌基因。XIONG J等[32]以5種pH敏感指示劑進(jìn)行目視評估，比較溴百里酚藍(lán)、酚紅、甲酚紅、中性紅和羥基萘酚藍(lán)的靈敏度和特異性，最終選擇甲酚紅建立了基于pH敏感指示劑的閉管LAMP檢測方法，可檢測5.4 copy/μL金黃色葡萄球菌基因產(chǎn)物。

采用比色法檢測，無需任何復(fù)雜的檢測儀器或訓(xùn)練有素的人員即可完成，特別適用于資源有限環(huán)境下金黃色葡萄球菌的現(xiàn)場檢測。但比色法也存在一些缺點，在復(fù)雜的生物樣品中很難看到產(chǎn)生的顏色，需要一雙“有經(jīng)驗的眼睛”來解釋顏色變化[39]；另外還存在靶基因特異性弱，假陽性結(jié)果等問題。因此，為提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，會將比色法與紙芯片、智能化平臺[40]結(jié)合，以實現(xiàn)檢測結(jié)果的定量分析。

3.2 熒光測定

熒光測定是實時監(jiān)測擴(kuò)增的直接方案，通過加入與DNA相結(jié)合的熒光染料指示擴(kuò)增反應(yīng)，常用的熒光染料有溴化乙 錠、PicoGreen、SYBR Green I、GelRed 和GelGreen 等。SYBR Green I與dsDNA結(jié)合時，用紫外線照射時會發(fā)出綠色熒光[24，28]。王芳等[41]將擴(kuò)增產(chǎn)物DNA與[Ru（bpy）2（dppz）]2+結(jié)合后產(chǎn)生的強(qiáng)烈紅色熒光信號判定結(jié)果，SU J Y等[42]以SYBR Green指示染料建立了金黃色葡萄球菌的orfXLAMP檢測方法，具有很高的特異性和靈敏度。KHOSRAVI A D等[43]采用SYBR Green I評估金黃色葡萄球菌的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物，在紫外線下將橙色變?yōu)榫G色，與PCR結(jié)果100%一致。FAN X R等[21]通過SYBR Green I結(jié)合重組酶聚合酶擴(kuò)增，建立了金黃色葡萄球菌的快速、視覺和無設(shè)備的即時檢測方法。熒光測定可以實現(xiàn)肉眼觀察，也可以使用成本低的便攜式熒光閱讀器進(jìn)行檢測，從而實現(xiàn)檢測的定性和定量分析，司曉雪[44]建立了一種基于3,3'，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺-辣根過氧化物酶-過氧化氫顯色體系的金黃色葡萄球菌快速可視化檢測方法，具有良好的特異性和穩(wěn)定性。然而，熒光染料存在擴(kuò)增抑制問題，如SYBR Green I可顯著抑制擴(kuò)增反應(yīng)。為了降低其抑制效應(yīng)，可采用閉管方式[23]或者蠟封管方式[10]，也可選擇旋轉(zhuǎn)管方式[45]。

3.3 側(cè)向流技術(shù)

側(cè)向流測定（lateral flow assay，LFA）技術(shù)是通過肉眼觀察測試線的顏色變化來進(jìn)行檢測的一種分析技術(shù)，基于金納米顆粒（Au Nanoparticles，AuNPs）積累引起的顏色變化進(jìn)行判斷，用于現(xiàn)場檢測和量化目標(biāo)物質(zhì)，將待測樣品添加到獨立設(shè)備上，幾分鐘內(nèi)即可獲得結(jié)果[46-47]。側(cè)向流技術(shù)與不同的載體結(jié)合（如試紙條、傳感設(shè)備）可建立不同側(cè)向流測定技術(shù)。側(cè)向流測定技術(shù)結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。由圖1可知，LFA的典型結(jié)構(gòu)包括多孔膜、樣品墊、接合墊和吸收墊，分為樣品區(qū)、檢測區(qū)和控制區(qū)。LFA具有研發(fā)生產(chǎn)成本低、易于使用的特點，是快速檢測最佳選擇之一。將等溫擴(kuò)增方法與LFA相結(jié)合，可以確保在非實驗室條件下具有超高的測試靈敏度，并降低了對設(shè)備的要求[48]。LFA通過與LAMP、RPA、RAA結(jié)合使用檢測金黃色葡萄球菌，展示了檢測系統(tǒng)的高靈敏度、便捷性。WANG Y L等[49]將RPA與LFA技術(shù)結(jié)果開發(fā)了檢測金黃色葡萄球菌的IMS-RPA-LF方法，能夠檢測牛奶樣品中低至40 CFU/mL的金黃色葡萄球菌。后來旺等[31]建立了RAA-LFA檢測金黃色葡萄球菌的方法，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點。但LFA仍然存在一定的不足，如可能存在樣品污染，對環(huán)境控制力弱、檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度等問題。

圖1 側(cè)向流試紙條結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of lateral flow test strip structure

另外，隨著新型納米材料的開發(fā)和研發(fā)技術(shù)的提高，設(shè)計了基于納米顆粒的側(cè)向流生物傳感器（lateral flow biosensor，LFB），原理與LFA相似，LFB采用的塑料盒固定封裝，由吸收墊、硝酸纖維素膜、樣品墊和共軛墊有序地組裝在背卡或設(shè)備上[34]。CHEN X等[38]建立了基于納米顆粒的側(cè)向流生物傳感器（LAMP-LFB），用于檢測所有金黃色葡萄球菌，特異性為100%。LFB提供了更多的可視化，不需要特殊的儀器、控制器和過程，成為分析產(chǎn)物的優(yōu)選方法[34]。

4 結(jié)論

核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)作為近十多年來興起的新技術(shù)，具有設(shè)備簡單、反應(yīng)速度快、靈敏度高等優(yōu)點，已經(jīng)成為食源性致病菌檢測的研究熱點。金黃色葡萄球菌作為全球大多數(shù)國家的食品安全法定檢測項目，開發(fā)了大量的金黃色葡萄球菌等溫擴(kuò)增技術(shù)，在保障食品安全和控制食源性疾病方面均發(fā)揮了巨大作用。

本文通過介紹LAMP、RPA/RAA、RCA技術(shù)的反應(yīng)機(jī)制，比較了幾種等溫擴(kuò)增技術(shù)的優(yōu)勢和劣勢，為后續(xù)等溫擴(kuò)增技術(shù)的選擇提供了參考。同時，從金黃色葡萄球菌等溫擴(kuò)增檢測方法的檢測限、目標(biāo)基因和目標(biāo)產(chǎn)物檢測技術(shù)方面闡述了金黃色葡萄球菌等溫擴(kuò)增技術(shù)的研究進(jìn)展。其中，RPA、RAA反應(yīng)具有需求溫度低，檢測時間短，可同時檢測多種病原體等優(yōu)勢，適合開發(fā)快速檢測技術(shù)。比色法、熒光測定法和側(cè)向流技術(shù)都屬于視覺檢測技術(shù)，通過肉眼觀察即可判斷結(jié)果，在設(shè)備便捷、檢測時間等方面具有一定的優(yōu)勢。本文為開發(fā)金黃色葡萄球菌等溫擴(kuò)增檢測方法提供理論支持，為研發(fā)金黃色葡萄球菌的即時檢測設(shè)備奠定基礎(chǔ)。